Verschiedene antivirale Hefesysteme verhindern die tödliche Pathogenese, die durch das LA-Mykovirus verursacht wird

Aktuelle Studien zeigen, dass antivirale Systeme von Bakterien bis hin zu Säugetieren bemerkenswert konserviert sind, was zeigt, dass durch die Untersuchung mikrobieller Organismen einzigartige Einblicke in diese Systeme gewonnen werden können. Anders als bei Bakterien, bei denen eine Phageninfektion jedoch tödlich sein kann, sind bei der aufkeimenden Hefe Saccharomyces cerevisiae keine zytotoxischen viralen Folgen bekannt, obwohl sie chronisch mit einem doppelsträngigen RNA-Mykovirus namens LA infiziert ist. Dies bleibt trotz der vorherigen Identifizierung konservierter antiviraler Systeme, die die LA-Replikation einschränken, der Fall. Hier zeigen wir, dass diese Systeme zusammenarbeiten, um eine grassierende LA-Replikation zu verhindern, die bei bei hohen Temperaturen gezüchteten Zellen zur Letalität führt. Wir nutzen diese Entdeckung und verwenden ein Überexpressionsscreening, um antivirale Funktionen für die Hefehomologen des PolyA-bindenden Proteins (PABPC1) und des die La-Domäne enthaltenden Proteins Larp1 zu identifizieren, die beide an der viralen angeborenen Immunität beim Menschen beteiligt sind. Mithilfe eines komplementären Funktionsverlustansatzes identifizieren wir neue antivirale Funktionen für die konservierten RNA-Exonukleasen REX2 und MYG1; die SAGA- und PAF1-Chromatin-Regulationskomplexe; und HSF1, der Haupttranskriptionsregulator der proteostatischen Stressreaktion. Durch die Untersuchung dieser antiviralen Systeme zeigen wir, dass die LA-Pathogenese mit einer aktivierten proteostatischen Stressreaktion und der Akkumulation zytotoxischer Proteinaggregate verbunden ist. Diese Ergebnisse identifizieren proteotoxischen Stress als zugrunde liegende Ursache der LA-Pathogenese und machen Hefe zu einem leistungsstarken Modellsystem für die Entdeckung und Charakterisierung konservierter antiviraler Systeme.

Alle Laborstämme und die meisten Umweltisolate der Keimhefe S. cerevisiae sind mit einem doppelsträngigen RNA-Virus (dsRNA) namens LA infiziert (1, 2). LA gehört zur weit verbreiteten Totiviridae-Familie endogener dsRNA-Viren. Wie alle Viren dieser Familie ist das LA-dsRNA-Genom in einem Virion verpackt, das es vor einer durch den Wirt vermittelten Verdauung schützt. Löcher im Virion ermöglichen die Extrusion von RNA-Transkripten in das Zytosol, das für das Kapsidprotein Gag kodiert, das den größten Teil des Partikels ausmacht. Das LA-Transkript kodiert auch für ein Gag-pol-Fusionsprotein, das in viel geringeren Mengen als das Gag-Protein produziert wird und eine RNA-abhängige RNA-Polymeraseaktivität besitzt. Jedes Virion enthält ein Gag-Pol-Protein, das für die LA-Replikation und Transkription innerhalb des Partikels verantwortlich ist. Die Einkapselung der viralen Transkripte in entstehenden Partikeln und die Synthese des negativen RNA-Strangs durch Gag-pol zur Bildung des dsRNA-Genoms vervollständigen den LA-Replikationszyklus (2). Um diese Proteine ​​zu produzieren, nutzt LA Merkmale, die für RNA-Viren beim Menschen typisch sind, einschließlich eines „Cap-Snatching“-Mechanismus, der LA-Transkripte mit einer 5′-Methyl-Cap ausstattet, und eines ribosomalen Frameshifting-Mechanismus, um daraus Gag- und Gag-pol-Fusionsproteine ​​zu produzieren ein einziges Transkript (3, 4).

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Jüngste Studien zu bakteriellen antiviralen Systemen haben gezeigt, dass sie eine bemerkenswerte evolutionäre Erhaltung mit denen des Menschen teilen, was das Potenzial mikrobieller Organismen aufzeigt, neue Erkenntnisse über die angeborene virale Immunität zu liefern (5–11). Tatsächlich führten frühe Studien mit LA zur Entdeckung zweier antiviraler Systeme, von denen später gezeigt wurde, dass sie zur angeborenen Immunität gegen verschiedene RNA-Viren bei Säugetieren beitragen (12–17). Das erste dieser antiviralen Systeme umfasst die Gene SKI2, 3 und 8, die Untereinheiten eines konservierten Ribosomen-assoziierten Komplexes kodieren, der der Translation von Transkripten entgegenwirkt, denen Poly(A)-Schwänze fehlen, wie sie von LA kodiert werden (18–23). Ein separater Weg der LA-Abschwächung erfolgt über Xrn1 (auch bekannt als SKI1), eine 5′-3′-Exoribonuklease, die ungekappte mRNAs abbaut (24–26).

Wir haben kürzlich herausgefunden, dass die mitochondriale DNA/RNA-Endonuklease Nuc1 die Akkumulation von LA in sporulierenden Zellen unterdrückt, was einen neuen antiviralen Weg der Hefe darstellt (27). Nuc1 ist ein Homolog der Endonuklease G (EndoG), die in allen Eukaryoten und vielen Prokaryoten vorkommt, und ist vor allem für seine Rolle bei der Förderung der Genomfragmentierung während des programmierten Zelltods von Säugetieren bekannt, einem wichtigen letzten Auswegmechanismus der Virusabwehr (28, 29). Interessanterweise ist der programmierte Zelltod ein wesentlicher Bestandteil der Hefesporulation, und Nuc1 fragmentiert während dieses Prozesses die DNA aus sterbenden meiotischen Produkten, zusätzlich zu seiner Rolle bei der Abschwächung der LA-Viruskonzentrationen, die von den überlebenden Sporen vererbt werden (27, 30, 31).

Trotz des allgegenwärtigen Vorkommens von LA in Laborstämmen wurden ihm keine Auswirkungen auf die Fitness zugeschrieben, weshalb LA weitgehend als harmloser Kommensal angesehen wird. Hier zeigen wir, dass eine LA-Infektion für Hefepilze tatsächlich tödlich ist und dass sie durch die angeborene Virusimmunität aktiv abgeschwächt werden muss, um die Lebensfähigkeit zu erhalten. Insbesondere bei Stämmen, denen die parallel wirkenden antiviralen Signalwege NUC1 und SKI fehlen, ist die LA-Kopienzahl massiv erhöht, was bei hohen Temperaturen zur Letalität führt.

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Wir kamen zu dem Schluss, dass eine weitere Charakterisierung von LA und der Faktoren, die seine Replikation auf einem niedrigen Niveau halten, neue antivirale Systeme aufdecken könnte. Durch die Identifizierung von Bedingungen, die zur LA-Pathogenese führen, konnten wir bioinformatische und vorwärtsgerichtete genetische Screening-Ansätze nutzen, um neue antivirale Gene zu entdecken. Mithilfe eines Screenings auf überexprimierte Gene, die die bedingte Letalität von nuc1∆ ski3∆ unterdrücken, identifizieren wir antivirale Funktionen für die Hefehomologen des Poly(A)-bindenden Proteins (PABPC1) und des La-Domänen-enthaltenden Proteins Larp1, die beide an der viralen Angeborenung beteiligt sind Immunität beim Menschen (32, 33). Darüber hinaus wurden in genetischen Studien zum Funktionsverlust zwölf neue antivirale Gene identifiziert. Dazu gehören der hochkonservierte SAGA-Transkriptionskoaktivatorkomplex und mehrere RNA-Exonukleasen, darunter REX2 und MYG1, die beide unterschiedliche, aber schlecht charakterisierte menschliche und bakterielle Homologe aufweisen (34–37).

Abschließend charakterisieren wir die LA-Pathogenese mit zellbiologischen Methoden und stellen fest, dass eine hohe Viruslast proteostatischen Stress verursacht. Da hohe Temperaturen bekanntermaßen den proteostatischen Stress verstärken, legen diese Beobachtungen nahe, dass katastrophaler proteostatischer Stress die Ursache für LA-induzierte Letalität ist. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese zeigen wir, dass nuc1∆ ski3∆-Mutanten eine LA-abhängige Empfindlichkeit gegenüber Azetidin-2-carbonsäure (AZC) aufweisen, einem Prolinanalogon, von dem bekannt ist, dass es orthostatischen Stress verursacht (38). Darüber hinaus zeigen wir eine antivirale Funktion für HSF1, einen konservierten Transkriptionsfaktor, der die Reaktion auf orthostatischen Stress erkennt und steuert. Interessanterweise spielt menschliches Hsf1 auch eine wichtige Rolle bei der Replikation und/oder Pathogenität verschiedener Viren, einschließlich HIV, SARS-Cov-2 und Dengue-Virus, obwohl die Mechanismen unklar sind (39). Diese Ergebnisse liefern neue Beispiele für die Erhaltung des angeborenen Immunsystems von Mikroben auf den Menschen und heben Lichthefe als leistungsstarkes Modellsystem für die Entdeckung neuer antiviraler Systeme hervor.

Ergebnisse

Die antiviralen Hefesysteme NUC1, SKI und XRN1 arbeiten zusammen, um die LA-Pathogenese zu verhindern.

Unsere früheren Studien zu NUC1 konzentrierten sich auf meiotische Zellen (27). Um die antivirale Funktion von NUC1 in vegetativ wachsender Hefe zu untersuchen, untersuchten wir die LA-Kopienzahl in mitotischen haploiden Zellen im Hintergrund des Referenzstamms BY4742. Wir beobachteten die LA-dsRNA-Spiegel mittels Ethidiumbromid-Färbung von elektrophoretischer RNA und stellten fest, dass eine nuc1∆ ski3∆-Doppelmutante einen starken Anstieg der LA-dsRNA aufwies (Abb. 1A). Wir haben diese Ergebnisse mithilfe der Immunfluoreszenzmikroskopie mit einem dsRNA-Antikörper bestätigt, der zum Nachweis replizierender RNA-Viren verwendet wird (40, 41). Diese Bilder zeigten, dass sich LA-dsRNA in Brennpunkten ansammelte, die an „virale Fabrik“-Standorte der Virusreplikation erinnern, die in menschlichen Zellen beobachtet wurden (Abb. 1B und SI-Anhang, Abb. S1) (42). In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen in anderen Stammhintergründen (24, 27, 43) zeigte Western Blot, dass die Gag-Proteinspiegel in den nuc1∆- und ski3∆-Mutanten erhöht waren (Abb. 1C). Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass eine nuc1∆ ski3∆-Doppelmutante massiv erhöhte Gag-Spiegel anhäufte (Abb. 1C). Diese Daten zeigen, dass NUC1 und SKI3 an getrennten antiviralen Signalwegen beteiligt sind und dass der Verlust beider Signalwege zu einer stark erhöhten LA-Viruslast führt.

Um festzustellen, ob eine hohe LA-Viruslast die Zellfitness beeinträchtigt, haben wir das Hefewachstum mithilfe von Spottest-Wachstumstests untersucht. Subtile Wachstumsdefekte von nuc1∆- und ski3∆-Einzelmutanten wurden bei 37 Grad beobachtet, wenn Zellen mit Glycerin anstelle von Glucose als Kohlenstoffquelle gezüchtet wurden, einem Zustand, unter dem Hefe auf mitochondriale Atmung angewiesen ist (Abb. 1D). Obwohl nuc1∆ ski3∆-Doppelmutanten bei 30 Grad normal wuchsen, zeigten sie bemerkenswerterweise unabhängig von der Kohlenstoffquelle eine bedingte Letalität bei 37 Grad (Abb. 1D). Wie erwartet wurde die Lebensfähigkeit einer nuc1∆ ski3∆-Doppelmutante bei hoher Temperatur durch ein NUC1--exprimierendes Plasmid wiederhergestellt, was eine entsprechende Abnahme der Gag-Spiegel hervorrief (Abb. 1 C und D). Um zu bestätigen, dass der Wachstumsdefekt der nuc1∆ ski3∆-Doppelmutante durch LA verursacht wurde, konstruierten wir einen isogenen Stamm, der von LA (LA0) geheilt wurde, und testeten sein Wachstum bei hohen Temperaturen. Wir fanden heraus, dass der Wachstumsdefekt vollständig gelindert wurde, was darauf hindeutet, dass die bedingte Letalität auf die uneingeschränkte LA-Replikation zurückzuführen ist (Abb. 1D). Um die Auswirkungen einer hohen LA-Kopienzahl auf die Zellfitness unter optimalen Wachstumsbedingungen zu beurteilen, haben wir die Proliferationsraten in Flüssigkultur gemessen. Diese Studien zeigten eine verringerte Wachstumsrate in nuc1∆ ski3∆-Doppelmutanten im Vergleich zum Wildtyp bei 30 Grad, die bei L-A0-Stämmen umgekehrt war, was zeigt, dass eine hohe LA-Belastung selbst in nicht gestressten Zellen schädlich für die Fitness ist (SI-Anhang, Abb. S2).

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Um weiter zu charakterisieren, wie NUC1 mit bekannten antiviralen Signalwegen interagiert, haben wir seine Beziehung zu XRN1 getestet. Wir fanden heraus, dass eine nuc1∆ xrn1∆-Doppelmutante im Vergleich zu jeder einzelnen Mutante stark erhöhte Gag-Spiegel ansammelte und eine LA-abhängige bedingte Letalität bei hohen Temperaturen aufwies (SI-Anhang, Abb. S3 A ​​und B), was darauf hindeutet, dass NUC1 und XRN1 wirken parallele Wege zur Abschwächung von LA. Aufgrund ihrer nichtredundanten Schlüsselrolle bei der mRNA-Massenregulierung ist eine xrn1∆ ski3∆-Doppelmutante selbst in Stämmen ohne LA unbrauchbar (44). Um festzustellen, ob XRN1 ein von NUC1 und SKI3 unabhängiges antivirales System darstellt, verwendeten wir ein Plasmid mit hoher Kopienzahl, um XRN1 in einer nuc1∆ ski3∆-Doppelmutante zu überexprimieren. Tatsächlich beobachteten wir einen erheblichen Rückgang der Gag-Spiegel und eine Unterdrückung der bedingten Letalität von nuc1∆ ski3∆ durch plasmidgesteuerte XRN1-Überexpression (Abb. 1 C und D). Wir kommen zu dem Schluss, dass Nuc1, Ski3 und Xrn1 sich konvergent der LA-Replikation widersetzen und dass eine massiv erhöhte LA-Viruslast in nuc1∆ ski3∆- oder nuc1∆ xrn1∆-Mutanten bei hohen Temperaturen eine tödliche Pathogenese verursachte (Abb. 1E).

Ein bioinformatisch-basiertes genetisches Screening identifiziert neue antivirale Faktoren.

Die LA-abhängige bedingte Letalität von nuc1∆ ski3∆-Doppelmutanten ließ vermuten, dass andere antivirale Faktoren durch kombinatorische Mutantenstudien identifiziert werden könnten. Um neue mögliche antivirale Faktoren zu identifizieren, durchsuchten wir in mindestens zwei Hochdurchsatz-Screening-Studien eine kuratierte genetische Interaktionsdatenbank nach Gendeletionen, die in Kombination mit nuc1∆ einen synthetischen Wachstumsdefekt verursachten (45). Zusätzlich zum erwarteten Vorhandensein von XRN1- und SKI-Deletionen in diesem Datensatz fanden wir 16 weitere Gene. Wir nutzten genetische Kreuzungen, um Dreifachmutanten herzustellen, die Deletionen jedes dieser sechzehn Gene mit nuc1∆ ski3∆ kombinierten, und bestätigten sechs, die schwere Wachstumsstörungen verursachten (Tabelle 1). Wir stellten fest, dass die durch jedes dieser Gene verursachten synthetischen Wachstumsphänotypen in LA0-Stämmen umgekehrt waren, was darauf hindeutet, dass sie antivirale Proteine ​​kodieren (Tabelle 1). Im Folgenden beschreiben wir die Bestätigung mehrerer dieser Bildschirmtreffer als neue antivirale Faktoren.

Ein in unserem Screening identifiziertes Gen, REX2, kodiert eine 3′-5′-RNA-Exonuklease, die von Bakterien bis zum Menschen konserviert ist (35). Sowohl Rex2 als auch sein menschliches Homolog REXO2 sind in den Mitochondrien lokalisiert und enthalten eine EXOIII-Domäne, die häufig in prokaryotischen und eukaryotischen Proteinen vorkommt, einschließlich des Interferon-stimulierten antiviralen Proteins ISG20 (36, 37, 46–48). Wir fanden heraus, dass ein rex2∆ nuc1∆-Doppelmutantenstamm im Vergleich zu jedem Einzelmutanten stark erhöhte Gag-Spiegel akkumulierte und LA-abhängige Wachstumsdefekte aufwies, einschließlich Letalität bei hohen Temperaturen (Abb. 2 A und B und SI-Anhang, Abb. S2). Ein rex2∆-Einzelmutantenstamm zeigte einen leichten Anstieg der Gag-Spiegel, obwohl dieser Effekt marginal war (Abb. 2B). Um die Konsequenzen von rex2∆ für die LA-Kopienzahl genau zu untersuchen, haben wir LA-RNA mithilfe von RT-qPCR quantifiziert. Diese Messungen bestätigten, dass rex2∆ nuc1∆-Stämme stark erhöhte LA-Spiegel ansammeln, zeigten jedoch auch, dass ein rex2∆-Einzelmutant keine erhöhte LA-RNA ansammelte (Abb. 2C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die antivirale Rolle von Rex2 nur bei fehlender NUC1-Funktion offensichtlich ist. Bemerkenswerterweise waren die Dreifachmutanten nuc1∆ ski3∆ rex2∆ und nuc1∆ xrn1∆ rex2∆ unter allen Wachstumsbedingungen unbrauchbar, und diese Defekte wurden in L-A0-Stämmen umgekehrt (Abb. 2D). Diese Ergebnisse belegen das schwerwiegende pathogene Potenzial des LA-Mykovirus und identifizieren eine neue antivirale Rolle für eine hochkonservierte mitochondrial lokalisierte RNA-Exonuklease.

Abb. 1. LA-Abschwächung schützt Hefe vor tödlicher Pathogenese. (A) Dargestellt ist ein mit Ethidiumbromid gefärbtes Gel aus Gesamt-RNA, das aus den angegebenen Stämmen hergestellt wurde, wobei die 4,6-kb-LA-dsRNA-Bande mit einem Pfeil gekennzeichnet ist. (B) Immunfluoreszenz wurde verwendet, um LA dsRNA (orange) in Zellen der angegebenen Genotypen sichtbar zu machen. Diese Stämme wurden von dem schwach vorkommenden L-BC-dsRNA-Virus befreit, um Hintergrundfärbungen zu beseitigen (Details zur Methode). Die DAPI-Färbung der DNA ist blau. (Maßstabsbalken, 1 μm.) (C) Western Blot der LA Gag- und 3-Phosphoglyceratkinase (Pgk1)-Proteinspiegel in den angegebenen Stämmen wird gezeigt. Auf der rechten Seite sind Molekulargewichtsmarker angegeben. (D) Gezeigt werden Spottest-Wachstumstests der Stämme aus 1C. Die Stämme wurden auf -Leu-Medien, die entweder Glucose oder Glycerin enthielten, getupft und bei den angegebenen Temperaturen gezüchtet. (E) Das mitochondriale Protein Nuc1 arbeitet mit den zytosolischen Proteinen Xrn1 und SkiC zusammen, um den LA-Proteinspiegel zu regulieren und die Zellfitness sicherzustellen.

Ein weiteres in unserem Screening identifiziertes Gen war MYG1, das Hefe-Homolog des menschlichen MelanocYte-Proliferationsgens 1, eine 3′-5′-RNA-Exonuklease, die in allen Taxa Homologe aufweist (34). Mutantenstämme, die myg1∆ und nuc1∆ kombinieren, zeigten im Vergleich zu den Einzelmutanten einen starken Anstieg des Gag-Proteins und der LA-RNA und zeigten schwere LA-abhängige Wachstumsdefekte bei hohen Temperaturen und in Flüssigkultur (Abb. 2C und SI-Anhang, Abb. S2, S4). A und C). Wie bei rex2∆ zeigte ein myg1∆-Einzelmutantenstamm einen geringen Anstieg des Gag-Spiegels und keine Veränderung der LA-RNA (Abb. 2C und SI-Anhang, Abb. S4C). Wir konnten nuc1∆ ski3∆ myg1∆-Dreifachmutanten wiederherstellen, obwohl sie bei 30 Grad extrem langsam wuchsen und noch höhere Gag-Werte anhäuften (SI-Anhang, Abb. S4 A und C). Diese Wachstumsdefekte wurden auch bei L-A0-Stämmen umgekehrt (SI-Anhang, Abb. S4A). MYG1 stellt somit einen neuen antiviralen Faktor dar, der parallel zu NUC1 und dem SKI-Komplex wirkt.

Tabelle 1. Identifizierung neuer potenzieller antiviraler Faktoren mithilfe eines bioinformatischen Ansatzes

Mutationen, die zu einer Überexpression von menschlichem MYG1 führen, werden mit der Autoimmunerkrankung Vitiligo in Verbindung gebracht, was darauf hindeutet, dass MYG1 möglicherweise eine Rolle bei der angeborenen Immunität des Menschen spielt (49, 50). Wir untersuchten diese Möglichkeit mithilfe eines Plasmids, das menschliches MYG1 unter der Kontrolle eines konstitutiven Hefepromotors exprimiert (34), und stellten fest, dass menschliches MYG1 den bedingten Wachstumsdefekt einer nuc1∆-myg1∆-Mutante rettete (SI-Anhang, Abb. S4D). Diese Ergebnisse zeigen, dass die antivirale Funktion von Hefe-MYG1 durch menschliches MYG1 erreicht werden kann, was auf eine potenzielle antivirale Funktion von MYG1 beim Menschen schließen lässt.

Abb. 2. Neue antivirale Faktoren werden durch Ausnutzung der LA-Pathogenese identifiziert. (A) Gezeigt wird eine Spot-Analyse von Stämmen mit Defekten in NUC1 und REX2. Die Stämme wurden auf SC-Medien, die entweder Glucose oder Glycerin enthielten, getupft und bei der angegebenen Temperatur gezüchtet. (B) Western Blot der LA Gag- und Pgk1-Proteinspiegel der Stämme in Abb. 2A. Auf der rechten Seite sind Molekulargewichtsmarker angegeben. (C) LA-RNA wurde durch qPCR quantifiziert und auf endogene ACT1-RNA normalisiert. Der mittlere RNA-Spiegel und die Standardabweichung werden angezeigt. n=5. *P < {{10}}.05, **P < 0.01, ***P < 0,001 (ungepaarter Student-t-Test). (D) Gezeigt wird eine Spot-Analyse von Stämmen, die in drei parallelen antiviralen Signalwegen defekt sind und ein Plasmid enthalten, das NUC1 exprimiert. Stämme werden auf -URA-Medien oder synthetischen Komplettmedien (SC), ergänzt mit 0,1 % 5-Fluororotsäure (5-FOA), aufgetüpfelt.

Eine weitere Genkategorie, die mithilfe unseres bioinformatischen Screenings identifiziert wurde, war die Genexpression. CDC73 und SPT3 kodieren Untereinheiten der konservierten Chromatin-assoziierten Komplexe PAF1 bzw. SAGA. Sowohl cdc73∆ als auch spt3∆ verursachten in Kombination mit nuc1∆ ski3∆ eine LA-abhängige Letalität (Tabelle 1). Da gezeigt wurde, dass SAGA (SptAda-Gcn5-Acetyltransferase) die antivirale Genexpression im Kastanienfäulepilz Cryphonectria parasitica hochreguliert, haben wir diesen Komplex weiter untersucht (51). Ein spt3∆ nuc1∆-Doppelmutantenstamm akkumulierte erhöhte Gag-Spiegel und zeigte LA-abhängige Letalität bei hohen Temperaturen (SI-Anhang, Abb. S4 B und C). SAGA ist ein großer Proteinkomplex und wir haben bestätigt, dass Deletionen in mehreren anderen für SAGA-Untereinheiten kodierenden Genen die gleichen phänotypischen Konsequenzen hatten wie spt3∆ (SI-Anhang, Tabelle S1 und S4C). Zusammen mit den Erkenntnissen aus C. parasitica legen diese Ergebnisse nahe, dass der SAGA-Komplex die antivirale Genexpression in verschiedenen Pilzarten steuert.

Das Screening mit hoher Kopienunterdrückung identifiziert antivirale Hefefaktoren, die auch beim Menschen antiviral wirken.

Da die Überexpression von XRN1 die Wachstumsdefekte eines nuc1∆ ski3∆-Stammes unterdrückte, stellten wir die Hypothese auf, dass die Überexpression anderer antiviraler Faktoren einen ähnlichen Effekt hervorrufen würde, der als Screening zur Identifizierung neuer antiviraler Systeme verwendet werden könnte. Wir verwendeten ein High-Copy-Plasmid-Suppressionsscreening, um Gene zu erkennen, deren Überexpression die bedingte Letalität eines nuc1Δ ski3Δ-Stammes linderte (Details zur Methode). Mithilfe dieses Screenings identifizierten wir SRO9, SLF1 und PAB1 als High-Copy-Suppressoren von nuc1∆ ski3∆, die alle Ribosomen-assoziierte RNA-Bindungsproteine ​​kodieren (Abb. 3A) (52, 53). Sro9 und Slf1 sind paraloge Lupus-Autoantigen (La)-Domänen enthaltende Proteine, die häufig in Eukaryoten vorkommen. Bemerkenswert ist, dass ihr menschliches Homolog Larp1 kürzlich in Screenings nach Proteinen identifiziert wurde, die an die SARS-Cov-2-Plus-Strang-ssRNA oder das Nukleokapsid gebunden sind (32, 54). Larp1 stand im Mittelpunkt einer dieser Studien und es wurde gezeigt, dass es die SARS-Cov-2-Replikation in menschlichen Zellen abschwächt, obwohl sein Mechanismus nicht bekannt ist (32). PAB1 kodiert für das hochkonservierte PolyA-bindende Protein, das durch verschiedene Mechanismen ein häufiges Ziel der Virushemmung beim Menschen ist (33). Wir fanden heraus, dass die Überexpression von PAB1 oder SRO9 die Gag-Spiegel in einem nuc1∆ ski3∆-Mutanten deutlich reduzierte, was ihre rettenden Phänotypen erklärt (Abb. 3B). Obwohl die Überexpression von SLF1 den Wachstumsdefekt nuc1∆ ski3∆ genauso gut rettete wie SRO9, führte sie seltsamerweise nicht zu einer Verringerung der Gag-Werte (Abb. 3 A und B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass PAB1 und SRO9 Zellen retten, indem sie die LA-Replikation unterdrücken, und dass SLF1 die Zellen vor den pathogenen Folgen einer erhöhten Virusreplikation schützt.

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Eine hohe LA-Kopienzahl führt zu zytotoxischem proteostatischem Stress.

Um einen Einblick in die unterschiedlichen Mechanismen der antiviralen Aktivitäten von Sro9 und Slf1 zu erhalten, haben wir untersucht, welche physiologischen Konsequenzen die LA-Pathogenese haben könnte und wie sich SRO9/SLF1 unterschiedlich auf sie auswirken könnte. Wir haben auf eine frühere Studie hingewiesen, in der Deletionen von NUC1- oder SKI-Komplex-Genen zu einer schwachen Induktion eines GFP-Reportergens führten, das von Hsf1 kontrolliert wird (55), einem konservierten Transkriptionsfaktor, der proteostatischen Stress erkennt und die Genexpressionsreaktion aktiviert (56–58). ). Mithilfe der Durchflusszytometrie mit diesem Reporter (HSE-GFP) bestätigten wir diese Ergebnisse und stellten fest, dass eine nuc1∆ ski3∆-Doppelmutante eine synergistische und LA-abhängige Aktivierung von HSE-GFP verursachte (Abb. 3C und SI-Anhang, Abb. S5). Wir stellten die Hypothese auf, dass die massive Produktion von Gag, die in nuc1∆ ski3∆-Mutanten beobachtet wurde, für diese proteostatische Stressreaktion verantwortlich ist. Dies wird dadurch unterstützt, dass die HSE-GFP-Aktivierung einer nuc1∆ ski3∆-Doppelmutante durch die Überexpression von PAB1 oder SRO9 rückgängig gemacht wurde, was die Konsequenzen dieser Gene für die Gag-Akkumulation widerspiegelt (Abb. 3 B und C). Bemerkenswerterweise verhinderte die Überexpression des SRO9-Paralogs SLF1 die HSE-GFP-Aktivierung nicht. Die evolutionäre Divergenz der paralogen SRO9- und SLF1-Gene hat daher zu unterschiedlichen antiviralen Mechanismen geführt, wobei SRO9 die Ansammlung viraler Proteine ​​und den damit verbundenen proteostatischen Stress unterdrückt und SLF1 die Zellen scheinbar vor den toxischen Folgen viral induzierten proteostatischen Stresses schützt.

Abb. 3. Überexpression von Translationskontrollfaktoren lindert die LA-Pathogenese. (A) Gezeigt werden Spottest-Wachstumstests der Hochkopiesuppressoren SRO9, SLF1 und PAB1. Die Stämme wurden auf –LEU-Medien, die entweder Glucose oder Glycerin enthielten, getupft und bei den angegebenen Temperaturen gezüchtet. (B) Western Blot für LA Gag-, Pgk1-, Sro9- und Slf1-Proteinspiegel in den Stämmen aus 3A. Auf der rechten Seite sind Molekulargewichtsmarker angegeben. (C) Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die HSE-GFP-Expression in den angegebenen Stämmen (n {{10}}) zu messen. Das erste und dritte Quartil sind durch die grauen Kästchen gekennzeichnet. Die mittlere GFP-Intensität wird durch die schwarzen Balken darin markiert. *P < 0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (ungepaarter Student-t-Test). (D) Fluoreszenzmikroskopie von Hsp104-GFP in den angegebenen Stämmen. Die Zellen wurden mit DAPI gefärbt, um Kerne sichtbar zu machen. (Maßstabsbalken, 1 μm.) Der Prozentsatz der Zellen mit 3+ GFP-Foci wird rechts angezeigt. n=3. Für jedes Replikat wurden 75 bis 140 Zellen gezählt.

Proteostatischer Stress ist häufig mit der Ansammlung zytotoxischer Proteinaggregate verbunden, die mithilfe von GFP sichtbar gemacht werden können, das an die Proteindisaggregase Hsp104 fusioniert ist, ein direktes Ziel der Hsf1-Transkriptionsaktivierung, von dem bekannt ist, dass es sich gemeinsam mit Proteinaggregaten lokalisiert (59, 60). Um die mit der LA-Pathogenese verbundenen proteostatischen Defekte weiter zu untersuchen, verwendeten wir Fluoreszenzmikroskopie, um Hsp104-GFP-Foci in verschiedenen Stämmen sichtbar zu machen. Wie erwartet akkumulierten Wildtyp-Zellen, die bei 30 Grad gezüchtet wurden, selten beobachtbare Hsp104-GFP-Herde. Während die Einzelmutanten nuc1∆ und ski3∆ dem Wildtyp ähnelten, wies ein nuc1∆ ski3∆-Doppelmutant auffallenderweise mehr als 25 % der Zellen mit drei oder mehr Hsp104-GFP-Herden auf (Abb. 3D). Wie bei allen anderen Phänotypen, die wir für nuc1∆ ski3∆ beobachtet haben, war die Akkumulation von Hsp104-GFP-Foci von der Anwesenheit von LA abhängig (Abb. 3D). Diese Ergebnisse zeigen, dass eine hohe Viruslast, die durch die Deletion von NUC1 und SKI3 verursacht wurde, zur Akkumulation von Hsp104-GFP-Herden führte, die auf eine zytotoxische Proteinaggregation hinweisen.

Da die LA-Pathogenese mit proteostatischen Defekten korrelierte, nahmen wir an, dass Hsf1 als antiviraler Faktor fungieren würde. Die Deletion von HSF1 ist tödlich, daher haben wir das temperaturempfindliche Allel hsf1-848 verwendet, das aus einer zuvor veröffentlichten Sammlung von Stämmen stammt (61). Das hsf1-848-Allel zeigte bei 39 Grad kein Wachstum, bei 37 Grad einen mittleren Wachstumsphänotyp und bei 35 Grad keinen offensichtlichen Wachstumsdefekt (Abb. 4A). Stichprobentests zeigten, dass die hsf1-848-Wachstumsphänotypen bei 35 Grad und 37 Grad stark verstärkt wurden, wenn sie mit entweder nuc1∆ oder ski3∆ kombiniert wurden, und dass diese Wachstumsdefekte in Stämmen, denen das LA-Virus fehlte, umgekehrt wurden (Abb. 4A). . Wie erwartet blieb die Unlebensfähigkeit aller hsf1-848-Mutantenstämme in Zellen bestehen, die bei 39 Grad gezüchtet wurden, unabhängig von der Anwesenheit von LA. Darüber hinaus haben wir mithilfe von Tetradensektionen gezeigt, dass hsf1-848 nuc1∆ ski3∆-Dreifachmutanten bei der zulässigen Temperatur unbrauchbar waren, wenn sie mit LA infiziert waren, aber gesund, wenn sie von einem LA0-Stamm abstammten (SI Anhang, Abb. S6). Mittels Western Blot stellten wir fest, dass hsf1-848 nuc1∆ und hsf1-848 ski3∆ im Vergleich zu den Einzelmutanten erhöhte Mengen an LA Gag anreicherten (Abb. 4B). Zusammen mit unseren zellbiologischen Studien legen diese Ergebnisse nahe, dass die Hsf1-regulierte proteostatische Stressreaktion als antivirales System in Hefen fungiert und den pathogenen Folgen der grassierenden LA-Replikation entgegenwirkt.

Da bekannt ist, dass sich proteostatische Defekte bei hohen Temperaturen verschlimmern und zu Zytotoxizität führen (59), führt ein einfaches Modell die tödlichen Folgen der LA-Pathogenese bei hohen Temperaturen auf katastrophalen proteostatischen Stress zurück. Um dieses Modell weiter zu testen, behandelten wir Stämme mit Azetidin-2-carbonsäure (AZC), einem Prolinanalogon, das in Proteine ​​eingebaut wird und zu orthostatischem Stress führt (38). Diese Experimente zeigten, dass nuc1∆ ski3∆ in Abhängigkeit vom LA-Virus eine starke Empfindlichkeit gegenüber AZC aufwies (Abb. 4C und SI-Anhang, Abb. S6). Darüber hinaus fanden wir heraus, dass nuc1∆ ski3∆ eine Empfindlichkeit gegenüber 5 % Ethanol zeigte, einem Zustand, der ebenfalls proteostatische Defekte verursacht, jedoch nicht gegenüber 0,5 M NaCl, das osmotischen Stress verursacht (SI-Anhang, Abb. S6). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die tödlichen Folgen der LA-Pathogenese insbesondere auf überwältigenden proteostatischen Stress zurückzuführen sind.

Abb. 4. Die Hitzeschockreaktion unterdrückt die LA-Pathogenese. (A) Gezeigt wird eine Spot-Analyse von Stämmen mit Defekt in HSF1, NUC1 und SKI3 mit oder ohne LA. Die Stämme wurden auf Glucose enthaltenden SC-Medien getupft und bei der angegebenen Temperatur gezüchtet. (B) Western Blot für LA Gag- und Pgk1-Proteinspiegel der angegebenen Stämme. Auf der rechten Seite sind Molekulargewichtsmarker angegeben. (C) Gezeigt wird eine Spotanalyse von Stämmen, die mit dem proteotoxischen Prolinanalogon Azetidin-2-carbonsäure (AZC) behandelt wurden. Stämme wurden auf SC-Medien getupft, die Glucose enthielten, ergänzt mit oder ohne 0,1 mg/ml AZC, und bei 30 Grad gezüchtet.

Diskussion

Trotz seiner allgegenwärtigen Präsenz in Laborstämmen waren Studien zum LA-dsRNA-Virus aufgrund seiner scheinbar harmlosen Natur begrenzt. Hier zeigen wir, dass LA schwerwiegende Folgen für Hefen hat, wenn ihre Replikation unkontrolliert ist, und dass verschiedene angeborene Immunsysteme die LA-Replikation auf einem tolerierbaren Niveau halten. Insbesondere zeigen wir, dass bei Stämmen, denen die parallel wirkenden antiviralen Gene NUC1 und SKI3 fehlen, die LA-Replikation massiv hochreguliert ist, was zu orthostatischem Stress und bedingter Letalität bei hohen Temperaturen führt. Wir nutzten diese neue Entdeckung und nutzten bioinformatische und vorwärtsgerichtete genetische Screens, um neue Hefegene zu identifizieren, die die LA-Replikation einschränken oder Zellen vor den pathogenen Folgen einer ungehemmten LA-Replikation schützen. Da diese Screenings nicht sättigend waren, kodiert das Hefegenom wahrscheinlich zahlreiche andere antivirale Faktoren. Viele aufschlussreiche Studien wurden an Hefe durchgeführt, um die Replikation von exogen eingeführten viralen RNAs aus anderen Organismen zu untersuchen, und es wird interessant sein zu bestimmen, ob die antiviralen LA-Faktoren auf diese viralen RNAs ähnlich wirken (62, 63).

Angesichts des klaren Risikos einer LA-Infektion ist es rätselhaft, wie es trotz allgegenwärtiger antiviraler Aktivität bestehen bleibt. Eine Erklärung für dieses Paradoxon könnte sein, dass LA einen ausgleichenden Vorteil bietet. Ein möglicher Vorteil von LA besteht darin, dass es einigen Stämmen ermöglicht, Satellitenviren aufrechtzuerhalten, die sekretierte Toxine kodieren, die benachbarte, nicht infizierte Zellen abtöten. LA ist jedoch in vielen Stämmen vorhanden, denen „Killer“-Satelliten fehlen, sodass diese Erklärung nicht ausreicht, um die Persistenz der LA-Infektion zu erklären. Wir spekulieren daher, dass LA möglicherweise einen kryptischen Nutzen hat, der sein schädliches Potenzial ausgleicht.

Unsere Entdeckung von Rex2 als Virusabschwächungsfaktor erweitert das Arsenal bekannter mitochondrialer antiviraler Faktoren über Nuc1 hinaus und legt nahe, dass Mitochondrien ein wichtiger antiviraler Knotenpunkt in Hefen sind. Tatsächlich spielen Mitochondrien eine zentrale Rolle bei der Virusabwehr als programmierter Zelltodregulator und als Plattform für die antivirale Signalübertragung beim Menschen. Wie schwächen mitochondriale Nukleasen ein Virus ab, das sich im Zytosol von Hefen befindet? Eine Möglichkeit besteht darin, dass diese Enzyme zwar auf die Mitochondrien abzielen, sich aber dennoch in geringen, aber ausreichenden Mengen im Zytosol ansammeln, um eine LA-Abschwächung direkt zu bewirken. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese haben wir zuvor gezeigt, dass sich Nuc1 im Zytosol meiotischer Zellen ansammelt, obwohl unsere Methoden es im Zytosol mitotischer Zellen nicht nachweisen konnten (27). Eine andere Hypothese besagt, dass einige Aspekte des LA-Replikationszyklus in enger Verbindung mit Mitochondrien stattfinden. Beispielsweise können LA-Transkripte mit Mitochondrien assoziieren und diese möglicherweise durchqueren, wodurch sie Nuc1 und/oder Rex2 ausgesetzt werden. Unsere Ergebnisse unterstreichen die potenzielle allgemeine Bedeutung von Mitochondrien für die virale angeborene Immunität in Eukaryoten und positionieren das Hefe-LA-System als leistungsstarkes Modell für weitere Studien zu diesem Thema.

Der mit der Translation von Ribosomen verbundene antivirale SKI-Komplex und unsere Identifizierung von Pab1, Sro9 und Slf1 als Hochkopiesuppressoren der LA-Pathogenese zeigen weiter, dass das translatorische Ribosom ein wichtiger Knotenpunkt der antiviralen Aktivität von Hefen ist. Der Befund, dass PAB1 (PolyA-Bindungsprotein) LA unterdrückt, ist angesichts des Fehlens von PolyA-Schwänzen in LA-Transkripten überraschend, was darauf hindeutet, dass Pab1 nicht direkt auf LA einwirkt. Frühere Erkenntnisse zeigten, dass LA-Transkripte mit PolyA+-Hefe-mRNAs um das Einfangen von 60S-ribosomalen Untereinheiten konkurrieren, um translatierende 80S-Komplexe zu bilden (64). Ein Modell, das unsere Ergebnisse erklärt, ist, dass Pab1 die Translation von PolyA-Schwanz-haltigen mRNAs verstärkt, was dann die Verfügbarkeit von 60S-Untereinheiten für LA-Transkripte für die Translation verringert. Die Rollen von Sro9 und Slf1 bei der Übersetzung sind weniger gut verstanden, ihre Funktionen könnten jedoch in ähnlicher Weise mit der Konkurrenz von LA-Transkripten um 60S-Untereinheiten zusammenhängen. Wichtig ist, dass die Homologen von Pab1 und Sro9/Slf1 an der menschlichen Virusabwehr beteiligt sind und weitere Untersuchungen dieser Gene in Hefen Aufschluss über antivirale Mechanismen geben werden, die von Hefen auf den Menschen übertragen werden.

Cistanche-Pflanze stärkt das Immunsystem

Wir identifizierten eine antivirale Rolle für den konservierten Transkriptionsfaktor HSF1 zusammen mit einer LA-induzierten proteostatischen Stressreaktion, die die Akkumulation von Hsp104-GFP-Foci beinhaltet, einem HSF1-aktivierten Marker für zytotoxische Proteinaggregate. Diese Ergebnisse stützen das Modell, bei dem die LA-Pathogenese durch proteotoxischen Stress verursacht wird. Wir entdeckten auch eine antivirale Funktion für den SAGA-Komplex, der nachweislich als Coaktivator der Hsf1-Zielgeninduktion nach einem Hitzeschock fungiert (65, 66). Diese Beobachtungen legen nahe, dass hohe LA-Spiegel zur SAGA-abhängigen Aktivierung von Hsf1-Zielgenen führen, die dann die antivirale Funktion ausüben, was auf ein potenzielles antivirales Genexpressionsprogramm in aufkeimenden Hefen schließen lässt. Dieses Modell macht viele überprüfbare Vorhersagen, die für die virale Pathogenese in anderen Organismen relevant sein könnten. Tatsächlich kontrolliert menschliches HSF1 auch die Expression proteolytischer Regulierungsfaktoren. Während antivirale Funktionen von menschlichem HSF1 beschrieben wurden, ist unklar, welche Rolle die orthostatische Stressreaktion dabei spielt (39). Unsere Ergebnisse beleuchten ein leistungsstarkes System zur Unterscheidung der antiviralen Funktion von Hsf1 im Hinblick auf seine Rolle bei der Aktivierung der proteostatischen Stressreaktion.

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