Doppelte modulierende Wirkungen von Diosmin auf Calciumoxalat-Nierensteinbildungsprozesse: Kristallisation, Wachstum, Aggregation, Kristallzellenadhäsion, Internalisierung in tubuläre Nierenzellen und Invasion durch extrazelluläre Matrix
Mar 16, 2022
für weitere Informationen:ali.ma@wecistanche.com
Supaporn Chamchuna,b,c,1, Sunisa Yoodeea,1, Besuchen Sie Thongboonkerda,*
aMedical Proteomics Unit, Office for Research and Development, Faculty of Medicine Siriraj Hospital, Mahidol University, Bangkok 10700, Thailand
bDepartment of Medical Technology, School of Allied Health Sciences, University of Phayao, Phayao 56000, Thailand
cExzellenzeinheit für integrative molekulare Biomedizin, School of Allied Health Sciences, University of Phayao, Phayao 56000, Thailand
Schlüsselwörter: Bioaktive Verbindung, Flavonoid, Inhibitor, Modulator, Nephrolithiasis, Promoter, Urolithiasis
ABSTRAKT
Diosminist ein natürliches Flavonglykosid (Bioflavonoid), das in Früchten und Pflanzen mit mehreren pharmakologischen Aktivitäten vorkommt. Es wurde weithin als Nahrungsergänzungsmittel oder Therapeutikum bei verschiedenen Krankheiten/Störungen eingesetzt. Obwohl empfohlen, zeugen seine Schutzmechanismen dagegenNiereSteinkrankheit (Nephrolithiasis/ Urolithiasis), insbesondere Calciumoxalat (CaOx)-Monohydrat (COM), das die häufigste Form ist, blieb unklar. In dieser Studie haben wir daher systematisch die Auswirkungen von evaluiertDiosmin(bei 2,5–160 nM) in verschiedenen Stadien vonNiereSteinbildungsprozesse, einschließlich COM-Kristallisation, Kristallwachstum, Aggregation, Kristall-Zell-Adhäsion, Internalisierung in tubuläre Nierenzellen und Invasion durch die extrazelluläre Matrix (ECM). Das zeigten die ErgebnisseDiosminhatte dosisabhängige modulierende Wirkungen auf alle erwähnten COM-Nierensteinprozesse.Diosminsignifikant erhöhte Anzahl und Masse von COM-Kristallen während der Kristallisation, aber verringerte Kristallgröße und -wachstum. WährendDiosminförderte die Kristallaggregation, hemmte die Kristallzelladhäsion und die Internalisierung in tubuläre Nierenzellen. Schließlich förderte Diosmin die Kristallinvasion durch die ECM. Unsere Daten liefern Beweise, die sowohl hemmende als auch fördernde Wirkungen von Diosmin auf COM belegenNiereSteinbildungsprozesse. Aufgrund dieser zweifach modulierenden Wirkungen von Diosmin ist seine Anti-Urolithiasis-Rolle zweifelhaft und es sollte bei seiner Anwendung Vorsicht geboten seinNiereSteinkrankheit.
1. Einleitung
Diosmin(3′,5,7-trihydroxy-4′-methoxyflavone-7-rhamnoglucosid) ist ein natürliches Bioflavonoid, das häufig in verschiedenen Pflanzen und Früchten vorkommt, hauptsächlich Citrus spp. [1,2]. Es kann aus dem anderen Flavonoid Hesperidin synthetisiert oder abgeleitet werden [1,2]. Diosmin allein oder in Kombination mit Hesperidin wird häufig als phlebotropes Medikament zur Behandlung von venösen und lymphatischen Erkrankungen wie chronischer venöser Insuffizienz und Hämorrhoiden eingesetzt [3,4]. Darüber hinaus weist Diosmin mehrere andere biologische und pharmakologische Aktivitäten auf, darunter antioxidative und entzündungshemmende Aktivitäten [5,6], antimutagene und antineoplastische Eigenschaften [7,8], antibiotische Wirkungen [9], antihyperglykämische Eigenschaften [ 10] und Schutzwirkungen gegen Multiorganschäden, d. h.
Herz-Kreislauf [11], Netzhaut [12],Niere, Leber- und Hirnverletzung [13].
NiereSteinkrankheit (oder Nephrolithiasis/Urolithiasis) wird durch die in der Niere entwickelten und abgelagerten festen Steine verursacht und betrifft Menschen in allen Teilen der Welt mit einer hohen Rezidivrate [14–17]. Unter allen verschiedenen verursachenden Kristallen ist Calciumoxalat (CaOx), insbesondere die Monohydratform (COM), die pathogenste und häufigste kristalline Komponente, die in den Steinbildnern (Patienten mit Nierensteinen) gefunden wird [18]. Mechanistisch haben COM-Kristalle die stärkste Adhäsionsfähigkeit und die stärksten zytotoxischen Wirkungen auf renale tubuläre Epithelzellen [19,20]. Während der Steinpathogenese haben sowohl Randalls Plaque-Modell als auch intratubuläre Hypothese gemeinsame Merkmale der COM-Steinbildungsprozesse, einschließlich COM-Kristallisation, Wachstum, Aggregation, Retention durch Oberflächenadhäsion auf tubulären Nierenzellen oder Nierenbecken, Internalisierung in die Zellen und Invasion in Niereninterstitium durch extrazelluläre Matrix (ECM) [21,22].
In letzter Zeit haben sich viele Studien auf die Arzneimittelforschung unter Verwendung von Heilpflanzen/-früchten und ihren bioaktiven Verbindungen konzentriert, mit dem Ziel, die Bildung neuer und/oder wiederkehrender Steine zu verhindern. Eine Reihe früherer Berichte hat gezeigt, dass einige bioaktive Verbindungen, insbesondere phenolische Verbindungen (Polyphenole, Flavonoide, Flavonglykoside usw.), die aus verschiedenen Heilpflanzen/Früchten extrahiert werden, vorbeugende Wirkungen gegen die pathogenen Mechanismen von habenNiereSteinkrankheit sowohl in vitro als auch in vivo [23–25]. Unter diesen nützlichen Substanzen haben einige Berichte darauf hingewiesen, dass Diosmin die Ablagerung von CaOx-Kristallen im Nierengewebe in Tiermodellen verhindern könnte [26,27]. Seine genaue modulierende Rolle (Hemmung oder Förderung) und Mechanismen (Stadien oder Steinbildungsprozesse) bei der COM-Nierensteinbildung wurden jedoch nicht untersucht. Die vorliegende Studie evaluierte daher systematisch die Auswirkungen vonDiosmin(bei 2,5–160 nM) in verschiedenen Stadien vonNiereSteinbildungsprozesse, einschließlich Kristallisation, Kristallwachstum, Aggregation, Kristallzelladhäsion, Internalisierung in tubuläre Nierenzellen und Invasion durch ECM.
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2. Materialien und Methoden
2.1. Diosmin-Zubereitung
Diosmin(Tokyo Chemical Industry; Tokio, Japan) wurde mit 100 Prozent Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) gelöst und Arbeitsaliquots wurden mit den Endkonzentrationen von 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 und 160 nM zur Untersuchung ihrer Auswirkungen auf COM-Kristalle. Zusätzlich wurde in allen Experimenten 100-prozentiges DMSO als Negativkontrolle verwendet.
2.2. Zellkultur
Die tubuläre MDCK-Nierenepithelzelllinie, die aus dem distalen tubulären Segment des Nephrons (ATCC; Manassas, VA) stammt, wurde in Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) (Gibco; Grand Island, NY), ergänzt mit 10 Prozent fötalem Rinderserum (FBS), vermehrt. 60 U/ml Penicillin G (Sigma-Aldrich) und 60 ug/ml Streptomycin (Sigma-Aldrich). Die Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C gehalten.
2.3. COM-Kristallisationsassay
Die COM-Kristallisation wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [28,29]. Kurz gesagt, 500 ul 10 mM CaCl2·2H2O in Kristallisationspuffer (enthaltend 10 mM Tris-HCl und 90 mM NaCl) (pH 7,4) wurden in jede Vertiefung der 24--Well-Platte (Corning Inc.; Corning, New York). Ein gleiches Volumen (4 ul) Kristallisationspuffer (Leerwertkontrolle), DMSO (Negativkontrolle) oderDiosmin(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 oder 160 nM) wurde mit CaCl2 gemischt. Schließlich wurden dann 500 ul 1,0 mM Na 2 C 2 O 4 in den Kristallisationspuffer gegeben, um die Endkonzentrationen von CaCl 2 und Na 2 C 2 O 4 auf 5 mM bzw. 0,5 mM einzustellen. Die Mischung wurde 1 h bei 25 ◦C inkubiert und dann untersucht. Kristallbilder wurden zufällig von mindestens 15 Hochleistungsfeldern (HPFs) unter dem invertierten Phasenkontrast-Lichtmikroskop Nikon Eclipse Ti-S (Nikon; Tokio, Japan) aufgenommen. Kristallgröße und -anzahl wurden von mindestens 15 HPFs für jede Probe unter Verwendung von NIS Element D Software Version 4.11 (Nikon) gemessen. Die Kristallmasse wurde aus mindestens 100 Kristallen in 15 HPFs unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: Kristallmasse (µm2/HPF)=Durchschnittliche Kristallgröße in jedem Feld (µm2) × Anzahl der Kristalle in jedem Feld (/HPF) ( 1)
2.4. COM-Kristallwachstumsassay
Der Kristallwachstumsassay wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [30,31].
Kurz gesagt, wurde in jeder Vertiefung des { {12}}Well-Platte. Das Gemisch wurde 1 h bei 25 °C inkubiert, um eine vollständige Kristallisation zu ermöglichen. An diesem Punkt (T0) wird ein gleiches Volumen (4 μl) Kristallisationspuffer (Blindkontrolle), DMSO (Negativkontrolle) oderDiosmin(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 oder 160 nM) wurde in jede Vertiefung gegeben und die Mischung wurde weitere 60 min (T60) inkubiert. Bei T0 und T60 wurden zufällig Kristallbilder von mindestens 15 HPFs unter dem invertierten Phasenkontrast-Lichtmikroskop Nikon Eclipse Ti-S aufgenommen. Die Kristallgrößen bei T0 und T60 wurden mit der Software NIS Element D, Version 4.11 (Nikon), gemessen, während das Kristallwachstum (dargestellt durch Δ Kristallgröße) aus mindestens 100 Kristallen in 15 HPFs unter Verwendung der folgenden Formel berechnet wurde: Δ Kristallgröße (µm2)=Kristallgröße bei T60 − Kristallgröße bei T0 (2)
2.5. COM-Kristallaggregationsassay
Der Kristallaggregationsassay wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [32,33]. COM-Kristalle wurden wie oben erwähnt in dem Kristallwachstumsassay erzeugt, aber mit einem größeren Volumen in einem 50- ml konischen Röhrchen (Corning Inc.) und dann durch Zentrifugation bei 2000 g für 5 min geerntet. Der Überstand wurde verworfen, während COM-Kristalle dreimal mit Methanol gewaschen wurden. Nach einer weiteren Zentrifugation bei 2000 g für 5 min wurde das Methanol verworfen und die Kristalle über Nacht bei 25 °C luftgetrocknet. COM-Kristalle (1000 ug Trockengewicht) wurden in 1 ml Kristallisationspuffer in jeder Vertiefung der 6--Vertiefungsplatte (Corning Inc.) resuspendiert. Ein gleiches Volumen (4 ul) Kristallisationspuffer (Leerwertkontrolle), DMSO (Negativkontrolle) oderDiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 oder 160 nM) wurde der COM-Kristallsuspension in jeder Vertiefung zugesetzt. Die Platte wurde in einem Schüttelinkubator (Zhicheng; Shanghai, China) bei 150 U/min und 25 °C für 1 h kontinuierlich geschüttelt. Danach wurde die Bildung von COM-Kristallaggregaten (definiert als „eine Ansammlung von drei oder mehr einzelnen COM-Kristallen, die fest miteinander verbunden sind“ [32]) untersucht und unter dem invertierten Phasenkontrast-Lichtmikroskop Nikon Eclipse Ti-S abgebildet. Die Anzahl der COM-Kristallaggregate wurde aus mindestens 15 zufälligen HPFs pro Vertiefung gezählt.
2.6. COM-Kristallzellen-Adhäsionsassay
Der Kristallzellen-Adhäsionsassay wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [34,35]. Kurz gesagt, COM-Kristalle wurden wie oben erwähnt in einem 50--ml-konischen Röhrchen erzeugt und dann durch 5-minütige Zentrifugation bei 2000 g geerntet. Der Überstand wurde verworfen, während COM-Kristalle dreimal mit Methanol gewaschen wurden. Nach einer weiteren Zentrifugation bei 2000 g für 5 min wurde das Methanol verworfen und die Kristalle über Nacht bei 25 °C luftgetrocknet. Die Kristalle wurden vor der Intervention mit den Zellen 30 min lang durch UV-Lichtbestrahlung dekontaminiert.
MDCK-Zellen (mit einer Dichte von 2 × 10 5 Zellen/Vertiefung) wurden ausgesät und in jeder Vertiefung der 6--Vertiefungsplatte (Corning Inc.) für 48 h gezüchtet, um eine konfluente Monoschicht zu erhalten. Das Kulturmedium wurde dann vor der Zugabe von COM-Kristallen (100 &mgr;g Trockengewicht Kristalle pro ml Kulturmedium) aufgefrischt. Ein gleiches Volumen (4 ul) Kristallisationspuffer (Leerwertkontrolle), DMSO (Negativkontrolle) oderDiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 oder 160 nM) wurde in jede Vertiefung gegeben. Die Zellen wurden weiter in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C für 1 h inkubiert. Danach wurden die Zellen fünfmal kräftig mit PBS gewaschen und unter einem Nikon Eclipse Ti-S inversen Phasenkontrast-Lichtmikroskop abgebildet. Die Anzahl der verbleibenden COM-Kristalle, die an der Oberfläche der renalen Tubuluszellen anhafteten, wurde aus mindestens 15 Zufallsfeldern pro Vertiefung gezählt.
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2.7. COM-Kristall-Internalisierungsassay
Die fluoreszenzmarkierten COM-Kristalle wurden wie zuvor beschrieben erzeugt [36,37]. Die Zusammensetzungen/Konzentrationen der für die Kristallisation verwendeten Chemikalien waren die gleichen wie oben für die einfachen (nicht markierten) Kristalle erwähnt, aber 0,1 &mgr;g/ml Fluoresceinisothiocyanat (FITC) (Thermo Scientific Pierce; Rockford, IL) war CaCl2⋅2H2O-Lösung vor dem Mischen mit Na2C2O4 zugesetzt. Die nachfolgenden Schritte (Kristallisation und Ernte) wurden wie oben erwähnt durchgeführt, jedoch im Dunkeln.
Um die Internalisierung von Kristallen in renale tubuläre Epithelzellen zu bewerten, wurden MDCK-Zellen (mit einer Dichte von 2 × 10 5 Zellen/Vertiefung) ausgesät und in jeder Vertiefung der 6--Vertiefungsplatte (Corning Inc.) für 48 h gezüchtet, um sie zu erhalten konfluente Monoschicht. Der Zellmonolayer wurde mit FITC-markierten COM-Kristallen (1000 µg Kristall/ml Medium) in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C für 1 h inkubiert. Danach wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit Trypsin-EDTA-Lösung inkubiert, um nicht internalisierte (sowohl anhaftende als auch nicht anhaftende) Kristalle zu eliminieren. Der Prozentsatz der Zellen mit internalisierten Kristallen wurde aus insgesamt 10.000 erfassten Ereignissen unter Verwendung eines Durchflusszytometers (BD Accuri C6) (BD Biosciences; San Jose, CA) quantifiziert. Die mit einfachen (unmarkierten) COM-Kristallen inkubierten Zellen wurden zum Voreinstellen des Rauschens und der Schwelle für das positive Fluoreszenzsignal verwendet. Die Zellen mit positiven Fluoreszenzsignalen wurden dann gezählt und für eine solche Prozentberechnung verwendet.
2.8. COM-Kristallinvasion durch ECM-Assay
COM-Kristalle wurden wie oben beschrieben für Kristallaggregations- und Kristall-Zell-Adhäsionsassays hergestellt. Der Kristallinvasionsassay wurde gemäß dem zuvor erstellten Protokoll durchgeführt [38,39]. Kurz gesagt, insgesamt 20 µg COM-Kristalle, beschichtet mit Kristallisationspuffer (Blindkontrolle), DMSO (Negativkontrolle), Albumin (Sigma-Aldrich) (Positivkontrolle) oderDiosmin(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 oder 160 nM) wurden in 200 ul MEM gegeben. Anschließend wurden 200 ul 0,3 pM Lys-Plasminogen (Fitzgerald Industries International; Acton, MA) in PBS gemischt und mit dem Kristall-Protein-Komplex 1 h bei 37°C inkubiert. Das ungebundene Plasminogen wurde durch Zentrifugation bei 2000 g für 5 min verworfen und das Pellet wurde einmal mit PBS gewaschen. Danach wurden 100 ul 0,15 pM Urokinase-Plasminogen-Aktivator (uPA) (Fitzgerald Industries International) in PBS mit dem Kristall-Protein-Plasminogen/Plasmin-Komplex gemischt. Die Mischung wurde dann auf das Matrixgel in der ECM-Migrationskammer gegeben und bei 37 °C inkubiert. Nach 24--stündiger Inkubation wurde die im oberen Teil der Migrationskammer verbleibende Lösung unter Verwendung einer Gaze oder eines Seidenpapiers entfernt. Die eingedrungenen COM-Kristalle innerhalb des Matrixgels wurden dann unter Verwendung eines Lichtmikroskops mit differentiellem Interferenzkontrast (DIC)-Modus (Nikon H600L) abgebildet. Die Kristallinvasionsentfernung wurde von mindestens 15 Niedrigleistungsfeldern (LPFs) innerhalb derselben Kammer unter Verwendung der NIS Element D-Softwareversion 4.11 (Nikon) gemessen und gemittelt.
2.9. statistische Analyse
Alle obigen Experimente wurden dreifach durchgeführt (drei unabhängige Experimente) und die quantitativen Daten sind als Mittelwert ± SEM angegeben. Mehrfachvergleiche wurden unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukey's post-hoc-Test durchgeführt. Der Pearson-Korrelationstest wurde durchgeführt, um die Beziehung zwischen Variablen zu bestimmen. Alle statistischen Analysen wurden unter Verwendung der SPSS-Software (Version 18) (IBM SPSS; Armonk, NY) durchgeführt. Ein P-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
3. Ergebnisse
3.1. Wirkung von Diosmin auf die COM-Kristallisation
Die Kristallisation ist einer der wesentlichen frühen Schritte vonNiereSteinbildungsprozesse aller Art. Nach 1-h Kristallisation mit oder ohneDiosminbei verschiedenen Konzentrationen (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 oder 160 nM) wurden COM-Kristallgröße und -anzahl gemessen und die Kristallmasse berechnet. Als Blind- bzw. Negativkontrolle dienten Kristallisationspuffer und das Verdünnungsmittel DMSO. Die Daten zeigten, dass alle Dosierungen (2,5–160 nM) von Disomin im Vergleich zu Blind- und Negativkontrollen die Kristallgröße signifikant reduzierten, aber die Kristallzahl dosisabhängig erhöhten (Abb. 1A–1C). In Übereinstimmung mit der Kristallzahl nahm die Kristallmasse dosisabhängig zu (Abb. 1D). Insgesamt weisen diese Daten darauf hin, dass Diosmin die COM-Kristallisation (Neokristalle) fördert.
3.2. Wirkung von Diosmin auf das Wachstum von COM-Kristallen
Die modulierende Wirkung vonDiosminauf das COM-Kristallwachstum wurde durch Messen der Veränderung der Kristallgröße (&Dgr; Kristallgröße) nach 60- min weiterer Inkubation nach Abschluss des anfänglichen Kristallisationsschritts bewertet, wenn keine Neokristalle vorhanden waren. Die Ergebnisse zeigten, dass alle Dosen (2,5–160 nM) von Disomin die Δ-Kristallgröße dosisabhängig im Vergleich zu den Blind- und Negativkontrollen signifikant reduzierten (Abb. 2). Diese Befunde zeigen, dass Diosmin das Wachstum von COM-Kristallen hemmt.
3.3. Wirkung von Diosmin auf die Aggregation von COM-Kristallen
Neben dem Kristallwachstum ist die Aggregation einzelner Kristalle, die fest aneinander haften, ein weiterer wichtiger Schritt währendNiereStein Pathogenese. Der hohe Grad an Kristallaggregation kann letztendlich zu einer Steinvergrößerung und Obstruktion des kleinen Nierenröhrenlumens führen. Vergleich mit Blind- und Negativkontrollen,Diosminbei 10–160 nM dosisabhängig erhöhte Anzahl der COM-Kristallaggregate (Abb. 3). Diese Ergebnisse zeigen, dass Diosmin die Aggregation von COM-Kristallen fördert.
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3.4. Wirkung von Diosmin auf die Adhäsion von COM-Kristallzellen
Die Retention der verursachenden Kristalle ist einer der entscheidenden Schritte fürNiereSteinbildung und kann durch Kristallzelladhäsion induziert werden, die verhindert, dass die Kristalle zusammen mit dem Urinausfluss ausgestoßen werden. Wir bewerteten somit die modulatorische Aktivität vonDiosminauf COM-Kristallzellenadhäsion. Die Daten zeigten, dass Diosmin bei 5–160 nM die Haftfähigkeit von COM-Kristallen auf renalen Tubuluszellen dosisabhängig im Vergleich zu Blind- und Negativkontrollen signifikant reduzierte (Abb. 4). Diese Daten zeigen, dass Diosmin die COM-Kristallzellenadhäsion hemmt.
3.5. Wirkung von Diosmin auf die Internalisierung von COM-Kristallen in renale Tubuluszellen
Nach der Adhäsion können einige COM-Kristalle in die renalen Tubuluszellen internalisiert werden und mehrere nachfolgende zelluläre Reaktionen hervorrufen [37,40]. Die Kristallinternalisierung wurde unter Verwendung von FITC-markierten COM-Kristallen bewertet und durch Durchflusszytometrie quantifiziert. Einfache COM-Kristalle (ohne Markierung) wurden verwendet, um technisches Rauschen zu subtrahieren und sicherzustellen, dass die Fluoreszenzintensität dem FITC-Signal entsprach. Im Vergleich zu Blind- und Negativkontrollen war der Prozentsatz der Zellen mit internalisierten Kristallen signifikant verringert umDiosminbei 10–160 nM dosisabhängig (Abb. 5). Die Ergebnisse zeigen, dass Disomin die Internalisierung von COM-Kristallen in renale Tubuluszellen hemmt.
3.6. Wirkung von Diosmin auf die Invasion von COM-Kristallen durch ECM
Kristallinvasion durch ECM ist ein pathogener/zerstörerischer Prozess währendNiereSteinpathogenese, die verschiedene Entzündungsreaktionen und -kaskaden auslösen kann und dadurch die Krankheitsmechanismen verschlimmert. Wir haben dieses Phänomen anhand eines etablierten Protokolls untersucht, das auf der Plasminogen-Plasmin-Aktivität des Kristall-Protein-Komplexes basiert [38,39]. Die Ergebnisse zeigten, dass alle Dosierungen von Disomin (2,5–160 nM) die COM-Kristallinvasion durch die ECM dosisabhängig signifikant verstärkten (Abb. 6). Interessant,Diosminbei 160 nM könnte die COM-Kristallinvasion vergleichbar mit Albumin fördern, das der bekannte potente Promotor für die COM-Kristallinvasion ist [41] (Abb. 6). Diese Ergebnisse zeigen, dass Diosmin die Invasion von COM-Kristallen durch die ECM stark fördert.
Abb. 1. Wirkung vonDiosminauf COM-Kristallisation. Der Kristallisationsassay wurde mit einem gleichen Volumen (4 ul) Kristallisationspuffer (Blindkontrolle), DMSO (Negativkontrolle) oder Diosmin (2,5–160 nM) durchgeführt. (A): Kristallmorphologie in jedem Zustand nach 1- h Kristallisation. Die ursprüngliche Vergrößerung war 400× für alle Tafeln. (B): Kristallgröße. (C): Kristallnummer. (D): Die Kristallmasse (siehe Formel 1 in "Materialien und Methoden") wurde von mindestens 100 Kristallen in 15 HPFs analysiert. Jeder Balken stellt den Mittelwert ±SEM der Daten dar, die aus 3 unabhängigen Experimenten stammen. *=S< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" dmso.="">
Abb. 2. Wirkung vonDiosminüber das Wachstum von COM-Kristallen. Der Kristallwachstumsassay wurde nach Abschluss der Kristallisation (um Neokristallisation zu verhindern) mit einem gleichen Volumen (4 ul) Kristallisationspuffer (Leerwertkontrolle), DMSO (Negativkontrolle) oder Diosmin (2,5–16 0 nM) durchgeführt. (A): Kristallmorphologie in jedem Zustand bei T0 und T60. Die ursprüngliche Vergrößerung war 400 × für alle Panels. (B)-(J): Histogramme von Kristallgrößen, gemessen von einzelnen Kristallen bei T0 und T60 in jeder Gruppe. (K): Δ Kristallgröße (siehe Formel 2 in "Materialien und Methoden") wurde von mindestens 100 Kristallen in 15 HPFs analysiert. Jeder Balken stellt den Mittelwert ± SEM der Daten dar, die aus 3 unabhängigen Experimenten stammen. *= p < 0,05="" vs.="" blindkontrolle;="" #="p">< 0,05="" gegenüber="">
Abb. 3. Wirkung vonDiosminauf COM-Kristallaggregation. Der Kristallaggregationsassay wurde mit einem gleichen Volumen (4 ul) Kristallisationspuffer (Blindkontrolle), DMSO (Negativkontrolle) oder Diosmin (2,5–160 nM) durchgeführt. (A): Mikroaufnahmen der aggregierten COM-Kristalle (markiert mit gepunkteten Kreisen). Die ursprüngliche Vergrößerung war 400 × für alle Tafeln. (B): Anzahl der Kristallaggregate wurde von mindestens 15 zufälligen HPFs in jeder Vertiefung gezählt. Jeder Balken stellt den Mittelwert ± SEM der Daten dar, die aus 3 unabhängigen Experimenten stammen. *=S< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="" dmso.="">
Abb. 4. Wirkung vonDiosminauf COM-Kristallzellenadhäsion. Der Kristallzell-Adhäsionsassay wurde mit einem gleichen Volumen (4 ul) Kristallisationspuffer (Leerwertkontrolle), DMSO (Negativkontrolle) oder Diosmin (2,5–160 nM) durchgeführt. (A): Mikroaufnahmen der verbleibenden Kristalle, die fest an der Zellmonoschicht haften, nachdem die ungebundenen Kristalle durch kräftiges Waschen mit PBS entfernt wurden. Die ursprüngliche Vergrößerung war 200 × für alle Tafeln. (B): Die Anzahl der anhaftenden Kristalle wurde aus mindestens 15 Zufallsfeldern in jeder Vertiefung gezählt. Jeder Balken stellt den Mittelwert ±SEM der Daten dar, die aus 3 unabhängigen Experimenten stammen. *= S<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p"><0.05 vs.="">
Abb. 5. Wirkung vonDiosminüber die Internalisierung von COM-Kristallen in renale Tubuluszellen. Der Kristallinternalisierungsassay wurde unter Verwendung von FITC-markierten COM-Kristallen (FITC-COM) durchgeführt, während die einfachen (nicht markierten) COM-Kristalle für die Subtraktion von Hintergrund/Rauschen verwendet wurden. Der Assay wurde mit einem gleichen Volumen (4 ul) Kristallisationspuffer (Blindkontrolle), DMSO (Negativkontrolle) oder Diosmin (2,5–16 0 nM) durchgeführt. (A): Durchflusszytometrische Dot-Plot-Analyse der Größe (y-Achse) und FITC-Fluoreszenzintensität (x-Achse) der Zellen nach dem Entfernen von nicht internalisierten Kristallen mit 0,1 Prozent Trypsin/2,5 mM EDTA. (B): Prozentsatz der Zellen mit internalisierten FITC-markierten COM-Kristallen. Jeder Balken stellt den Mittelwert ± SEM der Daten dar, die aus 3 unabhängigen Experimenten stammen. *= S<0.05 vs.="" fitc-com="" +="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" fitc-com="" +="" dmso.="">
Abb. 6. Wirkung vonDiosminauf COM-Kristall-Invasion durch das ECM. Kristallinvasion durch ECM-Assay wurde unter Verwendung von COM-Kristallen durchgeführt, die mit Kristallisationspuffer (Leerwertkontrolle), DMSO (Negativkontrolle), Albumin (Positivkontrolle) oder Diosmin (2,5–160 nM) beschichtet waren. (A): Mikroaufnahmen der COM-Kristalle, die in die ECM-Migrationskammer eingedrungen sind oder durch diese gewandert sind. Die ursprüngliche Vergrößerung war 100 × für alle Tafeln. (B): Die Entfernung der Kristallinvasion wurde von mindestens 15 zufälligen LPFs in jeder Kammer gemessen. Jeder Balken stellt den Mittelwert ±SEM der Daten dar, die aus 3 unabhängigen Experimenten stammen. *= p<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="">
4. Diskussion
Die Nierensteinerkrankung wird durch die Bildung von Steinen im Inneren verursachtNiereund Beckenbodensystem. Übliche Nierensteinbildungsprozesse umfassen COM-Kristallisation, -Wachstum, -Aggregation, -Retention durch Kristallzelladhäsion und Invasion durch das mit ECM reiche Niereninterstitium [21,22]. Es gibt mehrere Versuche, dieser Krankheit mit einer Vielzahl von Medikamenten und/oder Nahrungsergänzungsmitteln vorzubeugen. Viele neuere Beweise haben berichtet, dass Flavonoide, Flavonglykoside und andere aus Zitrusfrüchten extrahierte Verbindungen vorbeugende Wirkungen auf Nierensteinerkrankungen und andere Erkrankungen haben können [23-25]. Unter diesen,Diosmin, ein natürliches Flavonglykosid und Hesperidinderivat, das hauptsächlich in Zitrusfrüchten vorkommt [1,2], wurde vorgeschlagen, eine vorbeugende Rolle gegen Verletzungen und Schäden von zu spielenNiereGewebe [13,42]. Darüber hinaus wurde seine Anti-Urolithiasis-Rolle in einigen früheren Studien mit Tiermodellen berichtet [26,27]. Dennoch blieben die positiven Wirkungen und zugrunde liegenden Mechanismen von Diosmin bei der Vorbeugung von Nierensteinen verschwommen. Wir haben daher die modulatorische Aktivität von Diosmin auf COM-Kristalle untersucht. Die systematischen Analysen wurden auf verschiedenen Stufen von COM durchgeführtNiereSteinbildung, einschließlich Kristallisation, Kristallwachstum, Aggregation, Kristallzelladhäsion, Internalisierung in tubuläre Nierenzellen und Invasion durch ECM.
Nach oraler Einnahme vonDiosmin, sein Plasmaspiegel beim Menschen liegt im Bereich von {{0}},5 bis 200 ng/ml (oder 0,8–300 nM) [43,44]. Die maximale Plasmakonzentration (Cmax) beträgt ungefähr 50 ng/ml (oder 85 nM) [43,44]. Daher lagen die in unserer vorliegenden Studie verwendeten Dosierungen von Diosmin (2,5–160 nM) im pharmakologisch relevanten Bereich für seine Pharmakokinetik. Da DMSO als Verdünnungsmittel verwendet wurde, um Diosmin gemäß der Empfehlung vollständig aufzulösen, wurde DMSO in dieser Studie zusätzlich zur Blindkontrolle als Negativkontrolle verwendet, um sicherzustellen, dass es keine Auswirkungen des Verdünnungsmittels selbst gab, die die Dateninterpretation beeinträchtigen könnten. In allen Assays zeigten die Daten, dass keine signifikanten Wirkungen von DMSO beobachtet wurden und alle quantitativen Daten, die von der Negativkontrolle abgeleitet wurden, mit denen der Blindkontrolle vergleichbar waren.
Der COM-Kristallisationstest ergab, dass alle Konzentrationen vonDiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 und 160 nM) konnten die COM-Kristallgröße reduzieren, erhöhten aber andererseits die Anzahl der Kristalle. Da die Kristallmasse das Endprodukt sowohl der Kristallgröße als auch der Anzahl ist und relevanter ist, um den Grad der COM-Kristallisation widerzuspiegeln, haben wir dann bewertet, ob Diosmin diesen Kristallindex beeinflusst. Die Daten zeigten, dass alle Konzentrationen von Diosmin die fördernde Wirkung auf die COM-Kristallmasse hatten, was mit den Daten zur Kristallzahl übereinstimmt. Nach der Kristallisation können COM-Kristalle für den nächsten Schritt weiter auf die größere Größe wachsenNiereSteinbildung.
Im Gegensatz zur Kristallisation zeigte Diosmin bei allen Konzentrationen die hemmende Wirkung auf das COM-Kristallwachstum in dosisabhängiger Weise. Einige frühere Studien haben berichtet, dass die Löslichkeit von CaOx-Kristallen durch Derivate von Hydroxyanthrachinonen mit Glykosylierung erhöht werden kann [45]. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von Zuckern in solchen bioaktiven Verbindungen möglicherweise aufgrund der Hydroxylgruppen in der Molekülstruktur an freie Calciumionen binden, wodurch die Bildung von CaOx-Kristallen gehemmt wird [45,46]. Diosmin könnte auch den Übergang der solubilisierten Calcium- und Oxalationen in die kristallinen COM-Partikel in der renalen Tubulusflüssigkeit im Prozess der COM-Kristallisation basierend auf diesem Mechanismus beeinflussen.
Dennoch wurde die COM-Kristallaggregation um 10–160 nM gefördertDiosmin, was die Fähigkeit von Diosmin impliziert, als Linker oder Haftmolekül zu wirken, um einzelne Kristalle zu rekrutieren, damit sie sich aneinander binden, um die Kristallaggregate zu bilden. Diese Bindung führt auch zum Fortschreiten von Adhäsionsbrücken zwischen einzelnen Kristallen und kann die Bildung großer Strukturen von COM-Kristallen induzieren, die leicht zur Ablagerung von Steinnidus im Inneren beitragenNiere[32].
Die Retention von COM-Kristallen durch die Adhäsion von Kristallen auf den Oberflächen der Nierentubuli wurde als ein weiterer wichtiger Schritt für die Bildung von Nierensteinen etabliert [47]. Unsere Daten zeigten, dass Diosmin die Adhäsionsfähigkeit von COM-Kristallen zur Bindung an apikale Oberflächen von MDCK-Nierenröhrenzellen verringern könnte. Einige frühere Studien haben gezeigt, dass Glykosaminoglykane (Polysaccharidverbindungen), die auf CaOx-Kristallen aufgetragen oder auf Nierentubuluszellen exprimiert werden, die Adhäsionsfähigkeit von CaOx-Kristallen auf Nierentubuluszellen beeinträchtigen können [48]. Darüber hinaus ist die Expression von Kristallrezeptoren auf Nierentubuluszellen einer der entscheidenden Mechanismen, die die Kristallzelladhäsion bestimmen [21]. Während CaOx-Kristalle eine Schädigung der apikalen Membranen, insbesondere der Mikrovilli, induzieren, können einige Polyphenole wie Epigallocatechingallat (EGCG) die Kristall-Zell-Adhäsion und Zellschädigung verhindern [49]. Darüber hinaus wurde früher berichtet, dass Flavonoidsubstanzen in verschiedenen Pflanzenextrakten den pH-Wert im Urin erhöhen, was zu einer Hemmung der Kristallzelladhäsion führt [50,51]. Vielleicht,Diosminkönnte auch eine solche durch COM induzierte Zellschädigung abschwächen, wodurch die Kristallzellenadhäsion verringert wird.
Es wurde gezeigt, dass die Internalisierung von COM-Kristallen hauptsächlich durch Endozytose über den Aktin-Zytoskelett-vermittelten Makropinozytose-Weg auftritt [40]. Es wurde berichtet, dass Flavonoide wie Quercetin das für die Makropinozytose erforderliche Aktin-Zytoskelett beeinflussen [52,53]. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Diosmin die Fähigkeit von MDCK-Zellen, COM-Kristalle zu internalisieren, signifikant reduzierte. Eine solche hemmende Wirkung von Diosmin könnte mit dem Aufbau oder der Organisation des Aktin-Zytoskeletts innerhalb der Zellen verbunden sein, das den Makropinozytose-Weg direkt beeinflusst [54,55].
Nach der Internalisierung wurden die COM-Kristalle durch Endolysosomen abgebaut, was zu einem Anstieg freier Calcium- und Oxalat-Ionen im Niereninterstitium führte [37]. Solche Erhöhungen von Calcium- und Oxalationen können zu einer COM-Neokristallisation im Niereninterstitium führen [56,57]. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von interstitiellen COM-Kristallen auf Defekte von Tight Junction und parazellulären Adhäsionsbarrieren zurückzuführen sein, was zu einer erhöhten parazellulären Permeabilität und Kristalltranslokation führt [58–60]. Diese Kristalle können dann durch die ECM in das Niereninterstitium eindringen und anschließend mehrere Entzündungsreaktionen und Gewebeschäden auslösen [58–60]. In dieser Studie beobachteten wir, dass die Invasion von COM-Kristallen durch die ECM-Migrationskammer durch alle Konzentrationen von Diosmin induziert wurde. Diosmin könnte an die COM-Kristalloberflächen binden und mit dem Plasminogen-Plasmin-System interagieren, das die Kristallmigration in der ECM-Migrationskammer antreibt [38,39].
Cistanche für Niere
DaDiosmininduzierte sowohl hemmende als auch fördernde Wirkungen auf verschiedene Prozesse der COM-Steinbildung, wir haben daher ihre Beziehung unter Verwendung des Pearson-Korrelationstests bestimmt. Die Korrelationsanalyse ergab, dass die Kristallzahl sowohl mit der Kristallgröße als auch mit dem Kristallwachstum (Δ Kristallgröße) umgekehrt korrelierte (Fig. 7A und B). Die Kristallgröße korrelierte stark mit dem Kristallwachstum (Fig. 7C), korrelierte jedoch umgekehrt mit der Kristallmasse (Fig. 7D). Schließlich korrelierte die Kristallmasse stark sowohl mit der Kristallzahl als auch mit der Kristallaggregation (Fig. 7E und F). Aus der Korrelationsanalyse zeigen die Daten, dass Kristallzahl und Kristallmasse relevanter sind, um die Kristallisation widerzuspiegeln, als die Kristallgröße (Abb. 7A, D und E). Darüber hinaus hängt die Größe der Neokristalle während der Kristallisation mit dem Wachstum der vorgeformten Kristalle zusammen (Abb. 7C), während der Kristallisationsgrad (wie durch Kristallzahl und Kristallmasse wiedergegeben) eng mit dem Grad der Kristallaggregation zusammenhängt (Abb. 7E und F). Diese Korrelationen sind jedoch höchstwahrscheinlich spezifisch für die Diosmin-Effekte, wohingegen Effekte von anderen Modulatoren dieselben Korrelationen aufweisen können oder nicht. Beispielsweise verringert Fibronektin die Kristallmasse und hemmt das Kristallwachstum, fördert jedoch die Kristallaggregation [31]. Darüber hinaus erhöht intaktes lebensfähiges Escherichia coli die Kristallgröße und -masse, hat aber keine Auswirkungen auf die Kristallzahl [33]. Diese Daten zeigen, dass die Korrelationen zwischen verschiedenen COM-Kristall-Assays nicht für alle Modulatoren universell sind.
Abschließend haben wir die Ergebnisse aus verschiedenen Assays zusammengefasst und mit den pathogenen Mechanismen integriertNiereSteinkrankheit (siehe Schemata in Abb. 8). Aus der Korrelationsanalyse fördert Diosmin die Kristallisation (Fig. 8A). Zwischen Kristallisation und Kristallwachstum,Diosminhält ein gutes Gleichgewicht, indem es die Kristallisation fördert, aber andererseits das Kristallwachstum hemmt (Fig. 8B). Bezüglich aller Wirkungen auf COM-Kristalle allein (ohne Berücksichtigung von Zellen und ECM, die ebenfalls eingreifen) ist die fördernde Wirkung von Diosmin stärker ausgeprägt als seine hemmende Wirkung auf COM-Kristalle, da es sowohl die Kristallisation als auch die Kristallaggregation fördert, aber nur das Kristallwachstum hemmt ( Abb. 8C). Obwohl die Kristallisation zunimmt, nimmt die Kristallgröße ab und ist mit der Wachstumshemmung verbunden (Fig. 7C). Diese Daten stimmen mit den von Kavanagh et al. [61–63], die zeigen, dass die Zunahme der Kristallisation zu einer Abnahme der Übersättigung von Calcium- und Oxalationen in der Lösung führt, wodurch das Wachstum verringert wird. Das Kristallwachstum ist jedoch nicht der einzige bestimmende FaktorNiereSteinpathogenese [64], insbesondere wenn die Kristallmasse überwältigt und mit der Zunahme der Kristallaggregation verbunden ist (Abb. 7F), die die Wahrscheinlichkeit erhöhen kann, dass Kristallmaterialien in kleinen röhrenförmigen Segmenten stecken bleiben (in der intratubulären Hypothese), wodurch sie zunehmen die Möglichkeit der Steinbildung. Darüber hinaus hat eine frühere Studie gezeigt, dass die Daten mit unseren Ergebnissen übereinstimmen, was darauf hinweist, dass die Zunahme der Kristallzahl mit der Zunahme der Kristallaggregation und der Steinvergrößerung verbunden ist [63].
Abb. 7. Korrelationsanalyse. (A)–(F): Korrelationen zwischen COM-Kristallzahl, Kristallgröße, Δ Kristallgröße, Kristallmasse und einer Reihe von Kristallaggregaten wurden mit dem Pearson-Korrelationstest analysiert.
Abb. 8. Schematische Darstellung der modulatorischen Wirkungen vonDiosminauf COMNiereSteinbildungsprozesse. (A): Wirkungen von Diosmin auf die COM-Kristallisation. (B): Wirkungen von Diosmin auf die COM-Kristallisation und das Kristallwachstum. (C): Wirkungen von Diosmin auf die Kristallisation, das Wachstum und die Aggregation von COM. (D): Wirkungen von Diosmin auf die gesamten COM-Prozesse der Nierensteinbildung.
Wenn Wechselwirkungen mit renalen Tubuluszellen und ECM berücksichtigt werden, ergibt sich das Gesamtbild der dualen Wirkungen vonDiosminbei COM wird die Nierensteinbildung viel deutlicher (Abb. 8D). Diosmin hemmt die Kristall-Zell-Adhäsion und reduziert dadurch die Aufnahme von Kristallen in die Zellen. Dies kann erklärt werden, dass die kleinere Größe der COM-Kristalle im Vergleich zu den größeren, wie in unserer jüngsten Studie [34] und früheren Studien einer anderen Gruppe [65] berichtet, eine geringere Adhäsionsfähigkeit zum Binden der renalen Tubuluszellen hat. Die geringere Haftfähigkeit der kleineren COM-Kristalle beruht auf ihrer geringeren Haftkraft an der Zelloberfläche und einer geringeren Anzahl der an sie gebundenen COM-Kristallrezeptoren, wie durch Rasterkraftmikroskopie bzw. Proteomanalyse bestimmt wurde [34]. Diosmin hemmt auch die Kristallinternalisierung. Beachten Sie, dass der Internalisierungsprozess ein zweischneidiges Schwert ist, das sorgfältig interpretiert werden muss. Die Internalisierung oder Endozytose ist einer der Abwehrmechanismen, die Zellen zur Beseitigung von Kristallen durch Endolysosomen verwenden. Der Abbau der intakten Kristalle erzeugt jedoch freie Calcium- und Oxalat-Ionen, die sich vom intrazellulären Kompartiment zum Niereninterstitium bewegen können, wo sie Neokristalle erzeugen können [56,57]. Andererseits fördert Diosmin die Kristallinvasion durch die ECM, was einer der Mechanismen ist, die für die Pathogenese von Nierensteinen wichtig sind (insbesondere im Randall-Plaque-Modell) [58–60]. Insgesamt fasst Fig. 8D alle dualen Modulationswirkungen von Diosmin auf COM zusammenNiereSteinbildungsprozesse. Zu beachten ist, dass das Gleichgewicht dieser fördernden und hemmenden Wirkungen nicht genau berechnet werden kann (im Gegensatz zu einer mathematischen Gleichung). Darüber hinaus gibt es mehrere andere endogene und exogene Faktoren, die ebenfalls in die Steinbildungsprozesse eingreifen können. Schließlich zeigt Diosmin auch mehrere indirekte Wirkungen auf die Bildung von Nierensteinen, einschließlich seiner antioxidativen und entzündungshemmenden Eigenschaften [5,6], die berücksichtigt werden sollten. Daher ist das Endergebnis dieser dualen modulatorischen Wirkungen vonDiosminauf COMNiereSteinbildung erfordert weitere In-vivo-Untersuchungen und prospektive Studien mit großen Kohorten.
5. Schlussfolgerungen
Zusammenfassend berichten wir hier über die dualen Wirkungen von Diosmin auf die COM-Kristallmodulation in dosisabhängiger Weise. Während es das Wachstum von COM-Kristallen, die Adhäsion von Kristallzellen und die Internalisierung in tubuläre Nierenzellen hemmt,Diosminfördert die COM-Kristallisierung, -Aggregation und -Invasion durch die ECM. Daher ist seine Anti-Urolithiasis-Rolle zweifelhaft, und bei der Verwendung bei Nierensteinerkrankungen sollte Vorsicht walten.
CRediT-Urheberschaftsbeitragserklärung
Supaporn Khamchun: Konzeptualisierung, Methodik, Software, Validierung, Formale Analyse, Untersuchung, Datenpflege, Schreiben – Originalentwurf, Visualisierung, Sunisa Yoodee: Konzeptualisierung, Methodik, Software, Validierung, Formale Analyse, Untersuchung, Datenpflege, Schreiben – Originalentwurf, Visualisierung, Besuch Thongboonkerd: Konzeptualisierung, Methodik, Software, Validierung, Ressourcen, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Betreuung, Projektverwaltung, Beschaffung von Fördermitteln.
Erklärung zu Interessenkonflikten
Die Autoren erklären KEINEN Interessenkonflikt.
Danksagungen
Wir danken Kittiya Suwannakud für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council (NXPO) über PMU-B und den Thailand Research Fund (IRN60W0004) unterstützt. VT wird auch durch das „Chalermphrakiat“-Stipendium der Medizinischen Fakultät des Siriraj-Krankenhauses unterstützt.
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