Echinacosid induziert den apoptotischen Tod von Krebszellen, indem es das Nukleotidpool-Desinfektionsenzym MTH1 hemmt

Teil Eins Wie hemmt Echinacosid die Zellapoptose und verbessert das Gedächtnis?

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Abstrakt:Die Hemmung des den Nukleotidpool sanierenden Enzyms MTH1 verursacht umfangreiche oxidative DNA-Schäden und Apoptose in Krebszellen und kann daher als Antikrebsstrategie eingesetzt werden. Da Naturstoffe eine reichhaltige Quelle für medizinische Chemikalien sind, haben wir in der vorliegenden Studie die MTH1--katalysierte enzymatische Reaktion als Hochdurchsatz-in-vitro-Screening-Assay verwendet, um nach natürlichen Verbindungen zu suchen, die MTH1 hemmen können.Echinacosid, eine aus den Heilpflanzen Cistanche und Echinacea gewonnene Verbindung, hemmte in einem In-vitro-Assay wirksam die katalytische Aktivität von MTH1. Behandlung verschiedener menschlicher Krebszelllinien mitEchinacosidführte zu einem signifikanten Anstieg des zellulären Gehalts an oxidiertem Guanin (8-oxoguanin), während der Gehalt an zellulären reaktiven Sauerstoffspezies unverändert blieb, was darauf hindeutetEchinacosidhemmte auch die Aktivität von zellulärem MTH1. Folglich,EchinacosidDie Behandlung induzierte einen sofortigen und dramatischen Anstieg der DNA-Schadensmarker und eine Hochregulierung des G1/S-CDK-Inhibitors p21, gefolgt von einem deutlichen apoptotischen Zelltod und einem Zellzyklusstillstand bei Krebszellen, jedoch nicht bei Nicht-Krebszellen. Zusammengenommen identifizierten diese Studien eine natürliche Verbindung als MTH1-Hemmer und legen nahe, dass Naturprodukte eine wichtige Quelle für Antikrebsmittel sein können.

Schlüsselwörter:Echinacosid, MTH1, 8-oxoG, DNA-Schädigung,Apoptose, Zellzyklusarrest.

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Einführung

Der zelluläre und mitochondriale Pool von Nukleosidtriphosphat (NTP) und Desoxynukleosidtriphosphat (dNTP) ist ein bedeutendes Ziel verschiedener reaktiver Sauerstoffspezies (ROS).1–3 Da die Spezifität von DNA-Polymerasen nicht perfekt ist,4,5 können oxidierte dNTPs es sein in neu synthetisierte DNA eingebaut, um genetische Aberrationen zu verursachen, wenn sie nicht behoben werden.6 Zum Beispiel kann die oxidierte Hauptbase im Nukleotidpool, 8-Oxoguanin (8-oxoG), Basenpaare mit Cytosin und Adenin eingehen. Wenn es während der DNA-Replikation in entgegengesetztes Adenin eingefügt wird, kann es möglicherweise eine T: A=G: C-Transversion verursachen,7 was eine der häufigsten Mutationen bei menschlichen Krebserkrankungen ist.8,9 Obwohl die meisten der oxidierten freien dNTPs von Enzymen zur Reinigung des Nukleotidpools entfernt werden, haben Studien in der Vergangenheit gezeigt, dass der Nukleotidpool immer noch eine wichtige Quelle für oxidierte Basen in DNA-Molekülen und ein wesentlicher Faktor für oxidative DNA-Schäden ist.3,10 Säugetierzellen sind mit ausgeklügelten Abwehrmechanismen ausgestattet Minimierung von ROS-induzierten genomischen Läsionen. Nukleotidpool-Desinfektionsenzyme hydrolysieren oxidierte dNTPs und NTPs und verhindern so deren Einbau in DNA- und RNA-Moleküle.11,12 MTH1, ein Mitglied der Nudix-Hydrolase-Superfamilie (daher auch als NUDT1 bezeichnet),13 ist eine Triphosphatase, die für die Entfernung oxidierter Purin-NTPs verantwortlich ist dNTPs (8-oxodGTP, 2-OH-dATP, 8-OH-GTP und 2-OH-ATP) aus den Nukleotidpools.14 Seit 8-oxoguanine (8-oxoG) ist die wichtigste oxidierte Base in Zellen, MTH1 ist das wichtigste Enzym für die Sanierung von Nukleotidpools.15 Trotzdem befindet sich ein erheblicher Teil der oxidierten dNTPs auch unter der Überwachung durch die Nukleotidpool-sanitären Enzyme in DNA eingebaut, und Basen in DNA-Molekülen können auch direkt durch ROS oxidiert werden.6 Zellen verlassen sich dann auf ausgefeiltere Strategien, an denen verschiedene DNA-Glycosylasen wie OGG1 und MUTYH und DNA-Reparaturprozesse, einschließlich Basenexzisionsreparatur (BER) und Fehlpaarungen, beteiligt sind Repair (MMR), um problematische Basen in DNA-Molekülen zu reparieren.10, 16,17 BER und MMR reparieren normalerweise täglich zahlreiche oxidierte Basen in der DNA und spielen somit eine wichtige Rolle beim Schutz der Integrität und Stabilität des Genoms.

In Zellen, die unter erhöhtem oxidativem Stress stehen, kann der verstärkte Einbau oxidierter Nukleotide in die DNA die zelluläre Reparaturkapazität überfordern und eine DNA-Schadensreaktion (DDR) auslösen.18 Anhaltende DDR-Signale werden somit zu einem Stillstand des Zellzyklus, vorzeitiger zellulärer Seneszenz oder Apoptose führen eine Barriere für die Tumorentstehung setzen.19 Doch obwohl Krebszellen eine stark erhöhte oxidative Spannung aufweisen und eine potenziell tödliche Belastung durch oxidierte Nukleotide erzeugen,20 können sie die DDR-assoziierte Seneszenz oder Apoptose überleben.21 Eine große Anzahl von Studien hat gezeigt, dass MTH1, durch die effektive Entfernung des gefährlich reichlich vorhandenen 8-oxodGTP und 2-OH-dATP in Tumorzellen, spielt eine Schlüsselrolle bei der Entstehung von Krebs.22 Es wurde festgestellt, dass MTH1 bei verschiedenen Krebsarten überexprimiert wird,23– 25- und 8-oxoG-Spiegel, und das Ausmaß oxidativer DNA-Läsionen war in Tumoren geringer als in den umgebenden normalen Geweben.26–28 Funktionell reduzierte die Überexpression von MTH1 die Betäubung signifikant Er von DNA-Mutationen, die in MMR-defizienten embryonalen Fibroblasten der Maus beobachtet wurden10, und ermöglichte es den Zellen, die onkogene Ras-induzierte vorzeitige zelluläre Seneszenz und Apoptose zu überwinden,29 während die Unterdrückung von MTH1 die Entwicklung von Krebs in OGG1--defizienten Mäusen30 verhinderte und ROS förderte -induzierte DDR und zelluläre Seneszenz in Ras-transformierten Zellen.3,29,31 Obwohl MTH1 eine schützende Rolle spielt, indem es ROS-induzierte Mutationen in gesunden Zellen verhindert, haben diese Studien ergeben, dass MTH1 besonders für die Entstehung und das Überleben von Krebs erforderlich ist Zellen. Jüngste Studien haben mehr Beweise für die Rolle von MTH1 bei der Krebsentstehung geliefert.31–34 Die Unterdrückung von MTH1 durch RNAi oder niedermolekulare Inhibitoren in verschiedenen Krebszelllinien führte zu einem deutlich erhöhten Einbau von 8-oxodG in die genomische DNA, was zur Folge hatte zu ausgedehnten DNA-Schäden, apoptotischem Zelltod und reduziertem Überleben von Krebszellen. 32,33 In Maus-Xenograft-Studien unterdrückte die Hemmung von MTH1 effizient das Wachstum von Krebsexplantaten. Wichtig ist, dass die Unterdrückung von MTH1 das Wachstum und Überleben normaler Zellen nicht beeinflusst, wahrscheinlich weil normale Zellen eine niedrigere ROS haben und daher für das Überleben weniger von MTH1 abhängig sind.32,33 Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Hemmung von MTH1 eine vielversprechende neue Strategie zur Krebsbekämpfung ist .

Naturprodukte sind eine reiche Quelle medizinischer Verbindungen.35 Viele moderne Therapeutika, einschließlich Krebsmedikamente, wurden aus pflanzlichen oder botanischen Präparaten gewonnen.36–39 Dennoch wurde vorgeschlagen, dass eine große Anzahl traditioneller Kräuter verschiedene therapeutische Eigenschaften besitzen, um zu bleiben zu charakterisieren, hauptsächlich aufgrund von Schwierigkeiten bei der Kontrolle ihrer Zusammensetzung, um ihre Wirksamkeit und Wirkungsmechanismen eindeutig zu definieren.40 Es werden neue Ansätze benötigt, die den Nachweis aktiver Verbindungen und die Analyse molekularer Mechanismen ermöglichen. In dieser Hinsicht kann ein zielgerichtetes Hochdurchsatz-In-vitro-Screening bei der Suche nach mechanistisch definierten Arzneimitteln aus natürlichen Ressourcen hilfreich sein. In der vorliegenden Studie haben wir die MTH1--katalysierte enzymatische Reaktion als Hochdurchsatz-In-vitro-Assay verwendet, um nach natürlichen Verbindungen zu suchen, die MTH1 hemmen können. Überraschenderweise hat das Screening das ergebenEchinacosid, ein Naturprodukt, das am besten für seine starke antioxidative Aktivität bekannt ist, ist in der Lage, MTH1 zu hemmen.

Materialen und Methoden

Materialien

Natürliche Kräuterverbindungen wurden von Yuanye Biological Technology Co., Shanghai, Volksrepublik China, bezogen. Der Name, die Katalognummer, die Registrierungsnummer des Chemical Abstracts Service (CAS) und die Reinheit jeder Verbindung sind in Tabelle S1 aufgeführt. Vorratslösungen der Verbindungen wurden in 100 Prozent Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) hergestellt, und Arbeitslösungen wurden in Assaypuffer oder vollständigem Zellkulturmedium hergestellt. Als Vehikelkontrolle wurde die gleiche Lösung ohne die Testverbindung, aber mit der gleichen Menge an DMSO verwendet. (S)-Crizotinib wurde von Selleck Chemicals, Houston, TX, USA bezogen.

In-vitro-Screening

Der enzymatische In-vitro-Assay, der zum Screenen natürlicher pflanzlicher Verbindungen verwendet wurde, folgte den von Gad et al. beschriebenen Verfahren. Acetat (pH 8,0), 40 mM NaCl, 10 mM Mg-Acetat, 0,005 % Tween 20 und 1 mM DTT. Als nächstes wurden 0,5 nM rekombinantes menschliches MTH1 (Abcam, Cambridge, UK), 100 μM dGTP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) und 0,2 U/ml anorganische Pyrophosphatasen (Thermo Fisher Scientific) hinzugefügt, und die Platten wurden inkubiert auf einem Plattenschüttler für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Das endgültige Reaktionsvolumen betrug 100 μl auf einer 96-Well-Platte. Am Ende der Reaktion wurde Malachitgrün (J&K Scientific, Peking, Volksrepublik China) zugegeben,41 und die Platten weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absorption bei 630 nm wurde mit einem BioRad 680-Mikroplattenlesegerät (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) gemessen. Die Werte der Hemmkonzentration (IC50) wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse unter Verwendung der GraphPad Prism-Software bestimmt.

Zellkultur

Menschliche MG-63-Osteosarkom-, SK-HEP-1-Hepatokarzinom-, MCF7-Brustkrebs-, SW480-Darmkrebs-, HEK293-Embryonalnieren- und Maus-NIH/3T3-Fibroblasten-Zelllinien stammten aus der American Type Culture Collection und der menschliche Normalwert Die Leberzelllinie L-O2 wurde von KenGen Biotech, Nanjing, Volksrepublik China erworben. Diese Zellen wurden bei 37 Grad in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 Prozent CO2 gemäß den Anweisungen der Anbieter gehalten. Für die Verwendung dieser Zelllinien war keine Ethikerklärung des institutionellen Prüfungsausschusses erforderlich.

Messung von intrazellulärem 8-oxoG

Die intrazellulären {0}}oxoG-Spiegel wurden durch Färbung mit Cy3--konjugiertem Avidin gemessen.42 Insgesamt 1 × 104 Zellen wurden auf einem runden Deckglas in 12--Well-Platten ausgesät. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM oder 80 μM behandeltEchinacosidfür 5 Stunden, 12 Stunden oder 24 Stunden und wurden dann mit eiskaltem Methanol für 20 Minuten fixiert, gefolgt von einer Inkubation in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) mit 0,1 Prozent Triton X -100 (Sigma-Aldrich) für 15 Minuten. Die Proben wurden in TBS mit 0,1 % Triton X-100 und 15 % fötalem Rinderserum für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert und dann mit Cy3--konjugiertem Avidin (0,5 ug/ ml) (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, USA) in Blockierlösung für 1 Stunde bei 37 Grad. Nach dreimaligem Waschen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 5 Minuten wurden die Deckgläser auf Glasobjektträgern in VECTASHIELD Eindeckmedium mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (Vector Laboratories, Burlingame, CA , VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA). Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop Zeiss LCM 510 aufgenommen und analysiert.

Messung von intrazellulärem ROS

Intrazelluläre ROS-Spiegel wurden durch Durchflusszytometrie unter Verwendung eines zellbasierten ROS-Assay-Kits (Beyotime Biotechnology, Haimen, Volksrepublik China) gemessen. In Platten mit sechs Vertiefungen gezüchtete Zellen wurden mit 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM oder 80 μM behandeltEchinacosidfür 5 Stunden, 12 Stunden oder 24 Stunden, zweimal mit PBS gewaschen und mit 10 μM Dichlorfluoresceindiacetat für 30 Minuten bei 37 Grad inkubiert. Die Zellen wurden dann trypsiniert und mit dem FACSCaliber-Durchflusszytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) analysiert. Die intrazellulären ROS-Spiegel wurden als durchschnittliche Dichlor-Dihydro-Fluorescein-Fluoreszenzintensität der Zellen ausgedrückt. Die gezeigten Zahlen waren Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten.

Immunfluoreszenzfärbung

Auf Deckgläsern gewachsene Zellen wurden mit 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM oder 80 μM behandeltEchinacosidfür 5 Stunden, 12 Stunden oder 24 Stunden und dann einmal mit PBS gewaschen, mit 4 Prozent Paraformaldehyd in PBS für 20 Minuten fixiert und in TBS mit 0,1 Prozent Triton X-100 und 15 Prozent blockiert fötales Rinderserum für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Fixierte Zellen wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit einem primären Antikörper gegen 8-oxoG (Maus-monoklonales Anti-8-oxoG, Abcam), 53BP1 (Kaninchen-anti-53BP1); Bethyl Laboratories, Montgomery, gefärbt , TX, USA) oder aktive Caspase-3 (Kaninchen-Anti-Caspase-3, Bioss, Peking, Volksrepublik China), gefolgt von Färbung mit einer Alexa 488-konjugierten Esel-Antimaus ( Abcam) oder Cy3--konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach dreimaligem Waschen in PBS für 5 Minuten wurden die Deckgläser auf Glasobjektträgern in VECTASHIELD-Eindeckmedium mit DAPI (Vector Laboratories) versiegelt. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop Zeiss LCM 510 aufgenommen.

Koloniebildungsassay

Am Tag vor der Behandlung wurden Zellen in einer Platte mit sechs Vertiefungen in einer Konzentration von 1 × 104 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Sie wurden dann 7 Tage lang mit 0 μM, 60 μM oder 80 μM Echinacosid behandelt. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit eiskaltem Methanol fixiert und mit Kristallviolettlösung (Sigma Aldrich) (0,5 Prozent in 25 Prozent Methanol) gefärbt. Die Bilder wurden nach dem Trocknen der Platten über Nacht fotografiert. Die Kristallviolett-Kristalle wurden durch Zugabe von 70 Prozent Ethanol gelöst und die Extinktion bei 595 nm wurde mit einem BioRad 680 Mikroplatten-Lesegerät gemessen. Die Daten wurden mit der Software GraphPad Prism analysiert.

MTT-Assay

Einen Tag vor der Behandlung wurden die Zellen in Platten mit 96- Vertiefungen in einer Konzentration von 1 × 104 Zellen pro Vertiefung ausgesät, gefolgt von einer 24- oder 48-stündigen Behandlung mit Reihenverdünnungen von Echinacosid oder einer 5-stündigen Behandlung mit 60 μM Echinacosid , 12 Stunden oder 24 Stunden. Das Medium wurde entfernt und die Zellen wurden mit PBS gewaschen und dann mit 20 μl 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,

5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Lösung (5 mg/ml in PBS, pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific) wurde in jede Vertiefung gegeben. Die Platten wurden weitere 4 Stunden bei 37 Grad inkubiert. Am Ende wurde die MTT-Lösung entfernt und 150 &mgr;l DMSO wurden in jede Vertiefung gegeben. Die Platten wurden 10 Minuten lang auf einem Plattenschüttler inkubiert, und die Extinktion bei 570 nm wurde mit einem BioRad 680-Mikroplattenlesegerät gemessen. Jedes Experiment wurde zweimal in dreifacher Ausführung durchgeführt. Die Daten wurden mit der Software GraphPad Prism analysiert. IC50-Werte wurden mittels nichtlinearer Regressionsanalyse bestimmt.

Analyse des Zellzyklus

Zellen in Platten mit sechs Vertiefungen wurden 24 Stunden lang mit 0 μM, 6{{10}} μM oder 80 μM Echinacosid behandelt und mit Trypsin geerntet (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). , zweimal mit PBS gewaschen und dann mit eiskaltem Ethanol (70 Prozent) für 2 Stunden bei –20 Grad fixiert. Fixierte Zellen wurden zweimal in kaltem PBS gewaschen und in 300 ul frisch zubereitetem PBS mit 0,1 % Triton X-100, 0,2 mg/ml DNase-freier RNase A (Sigma Aldrich), 10 ug/ml Propidiumiodid (PI ) (Hoffmann-La Roche AG, Basel, Schweiz). Nach 20-minütiger Inkubation bei 37 Grad im Dunkeln wurden die Zellen durch ein Falcon-Nylonsieb (BD Biosciences) filtriert, auf das FAC-Calibur-Durchflusszytometer geladen und unter Verwendung der ModFit-Software (BD Biosciences) analysiert.

DNA-Fragmentierungsanalyse

In Platten mit sechs Vertiefungen gewachsene Zellen wurden 24 Stunden lang mit 0 μM, 60 μM oder 80 μM Echinacosid behandelt und 20 Minuten lang in eiskaltem 4-prozentigem Paraformaldehyd (Sigma-Aldrich) fixiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen in VECTASHIELD Mounting Medium mit DAPI (Vector Laboratories) versiegelt. Die Kernmorphologie wurde mit einem Olympus-Fluoreszenzmikroskop photographiert. Um DNA-Fragmentierung auf Agarosegelen nachzuweisen, wurde DNA unter Verwendung des QIAamp DNA-Mikrokits (Qiagen NV, Venlo, Niederlande) extrahiert, und Elektrophorese wurde auf 2-prozentigen Agarosegelen durchgeführt, die 0,1 ug/ml Ethidiumbromid enthielten.

Analyse der Apoptose durch Durchflusszytometrie

Apoptotische Zellen wurden unter Verwendung eines Annexin V-FITC-Apoptose-Nachweiskits (Best, Shanghai, Volksrepublik China) gemäß den Anweisungen des Herstellers untersucht. In 96-Well-Platten gezüchtete Zellen wurden mit 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM oder 160 μM Echinacosid für 2 Stunden, 5 Stunden, 12 Stunden oder 24 Stunden behandelt. zweimal mit PBS gewaschen und dann in einem Bindungspuffer resuspendiert. Als nächstes wurden 5 &mgr;l Annexin V-FITC und 5 &mgr;l PI (Roche) nacheinander hinzugefügt, und die Zellen wurden für 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden auf das FACSCalibur-Durchflusszytometer (BD Biosciences) geladen, und die Daten wurden unter Verwendung der Cell Quest-Software (BD Biosciences) analysiert.

Western-Blot-Analyse

In Sechs-Well-Platten gezüchtete Zellen wurden mit 0 μM, 6{{10}} μM oder 80 μM Echinacosid für 5 Stunden, 12 Stunden oder 24 Stunden behandelt. zweimal mit PBS gewaschen und mit 100 μl Radioimmunpräzipitationspuffer (150 mM NaCl, 1,0 % IGEPAL CA-630, 0,5 % Natriumdeoxycholat, 0,1 % Natriumdodecylsulfat) von der Platte abgekratzt und 50 mM Tris, pH 8,0) (Sigma-Aldrich), enthaltend 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid. Die Proben wurden bei 12,000× g für 20 Minuten bei 4 Grad zentrifugiert. Die Proteinkonzentrationen in den Überständen wurden mit dem Bradford-Reagenz (Dingguo, Changchun, Volksrepublik China) bestimmt. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 95 Grad denaturiert und auf einem 12-prozentigen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophoresegel aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine ​​auf Polyvinylidenfluoridmembranen (Millipore) übertragen, gefolgt von Blockierung in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (10 mM Tris, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,1 Prozent Tween 20), das 5 Prozent (w/v) enthielt. fettfreie Milch für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Blots wurden mit primären Antikörpern gegen p21 (Abcam), Poly(ADP-Ribose)-Polymerase (Bioss) oder aktivierte Caspase-3 (Bioss) sondiert, gefolgt von Meerrettichperoxidase-konjugierten sekundären Antikörpern (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Die Signale wurden unter Verwendung des verstärkten Chemilumineszenz-Western-Blotting-Nachweiskits (Trans gen Biotech, Changchun, Volksrepublik China) entwickelt. Die Versuche wurden dreimal wiederholt.

Messung der mitochondrialen

Membranpotential

Das mitochondriale Membranpotential wurde unter Verwendung des Farbstoffs JC{{0}} (Biotechnology) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. In Platten mit sechs Vertiefungen gezüchtete Zellen wurden mit 0 μM, 60 μM oder 80 μM Echinacosid für 5 Stunden, 12 Stunden oder 24 Stunden behandelt, zweimal in PBS gewaschen und dann mit JC-1 für 20 Minuten inkubiert. Bilder wurden unter Verwendung eines Olympus-Fluoreszenzmikroskops aufgenommen.

statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit der GraphPad Prism Software durchgeführt. Die Signifikanz wurde unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse berechnet, und P0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt.

Ergebnisse

Identifizierung von Echinacosid als MTH1-Hemmer

Um nach natürlichen Verbindungen zu suchen, die MTH1 hemmen können, verwendeten wir die MTH1--katalysierte enzymatische Reaktion als Hochdurchsatz im Vitro-Screening-Assay. Neben oxidierten Purinnukleotiden kann MTH1 auch normales Desoxyguanosintriphosphat hydrolysieren, um Desoxyguanosinmonophosphat und -pyrophosphat zu erzeugen. In Anwesenheit von überschüssiger anorganischer Pyrophosphatase werden alle Pyrophosphate in anorganische Phosphate umgewandelt, die mit einem auf Malachitgrün basierenden Extinktionsassay quantifiziert werden können,41 wodurch eine indirekte Messung der MTH1-Aktivität ermöglicht wird.32 Um das Assaysystem zu testen, haben wir zuerst die gemessen Wirkung von (S)-Crizotinib, einer Verbindung mit nachgewiesener Wirksamkeit als MTH1-Hemmer.33 Das Ergebnis zeigte, dass (S)-Crizotinib MTH1 tatsächlich stark hemmte (Abbildung 1A) mit einem IC50 von 500 nM, was siebenmal höher war als der berichtete von Huber et al. (72 nM).33 Dies lag wahrscheinlich an den Unterschieden in den Nachweismethoden oder Quellen von Chemikalien und Enzymen. Wir wählten einen weniger empfindlichen chromogenen Ansatz, während Huber et al. eine hochempfindliche Biolumineszenzmethode verwendeten.33 Vor diesem Hintergrund untersuchten wir 12 kommerziell erhältliche natürliche Verbindungen (Tabelle S1), von denen jede ein Hauptbestandteil traditioneller Kräuter mit potenziellem Antitumor ist Aktivität. Echinacosid, eine aus der parasitären Heilpflanze Cistanche salsa gereinigte Verbindung (Abbildung 1C), hemmte die Reaktion signifikant (Abbildung 1B) mit einem IC50 von 7,01 ± 2,13 μM (Abbildung 1D). Die Zugabe von 50-mal mehr Pyrophosphatase hatte keinen Einfluss auf das Ergebnis, während die Zugabe von fünfmal mehr MTH1-Protein den Grad der Hemmung signifikant verringerte, was darauf hindeutet, dass Echinacosid spezifisch die Aktivität von MTH1 im enzymatischen In-vitro-Assay hemmte.

Echinacosid hemmte zelluläres MTH1, um intrazelluläres 8-oxoG zu erhöhen

Als nächstes fragten wir, ob Echinacosid die intrazelluläre MTH1-Aktivität hemmen kann. Die Hemmung von zellulärem MTH1 erhöht das intrazelluläre 8-oxoG. Es wurde gezeigt, dass Avidin mit hoher Spezifität an 8-oxoG bindet;42 daher verwendeten wir eine Immunfluoreszenzfärbung mit Cy3--konjugiertem Avidin, um die intrazellulären 8-oxoG-Spiegel in verschiedenen Krebszelllinien vor und zu vergleichen nach Echinacosid-Behandlung. Humanes MG-63-Osteosarkom, SK-HEP-1-Hepatokarzinom, MCF{{10}}-Brustkrebs und SW480-Darmkrebszellen wurden behandelt mit 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM oder 80 μM Echinacosid für 5 Stunden, 12 Stunden oder 24 Stunden. Die Färbung mit Cy{3--konjugiertem Avidin zeigte, dass die Behandlung mit 60 μM Echinacosid für 24 Stunden den Gehalt an zellulärem 8-oxoG (Cy3--Avidin-reaktive Substanz) in diesen Krebszellen deutlich und signifikant erhöhte ( Abbildung 2A und B). Eine höhere Konzentration (80 μM) von Echinacosid führte zu einer stärkeren zellulären 8-oxoG-Färbung (Abbildung 2B), was auf eine Dosis-Wirkungs-Beziehung hindeutet. Ähnliche Ergebnisse wurden durch Immunfluoreszenzfärbung mit einem monoklonalen Anti--8-oxoG-Mausantikörper erzielt (Abbildung S1A).43 Die für einen signifikanten Anstieg des zellulären 8-oxoG erforderliche Konzentration von Echinacosid (60 μM) war viel höher als die IC50 (7,01 μM) aus dem In-vitro-Assay. Dies lag wahrscheinlich an der unterschiedlichen Sensitivität der beiden Assays. Die Immunfluoreszenzfärbung ist weit weniger empfindlich als der enzymatische In-vitro-Assay; außerdem wird die Anzahl der Inhibitormoleküle, die das zelluläre MTH1 erreichen und mit ihm interagieren können, von komplexen biologischen Prozessen beeinflusst; Außerdem wird im In-vitro-Test das weniger beliebte dGTP als Substrat verwendet, und daher kann es einfacher sein (weniger Inhibitoren zu nehmen), MTH1 zu hemmen, was zu einem niedrigeren IC50 im In-vitro-Test führt.

Zelluläres {{0}}oxoG wird durch ROS erzeugt, das durch Antioxidantien antagonisiert wird. Somit würde eine Erhöhung der zellulären ROS oder die Unterdrückung der Aktivität von Antioxidantien auch zu einer Erhöhung des zellulären 8-oxoG-Spiegels führen. Echinacosid selbst ist ein starkes Antioxidans44,45 und sollte daher die Aktivität von Antioxidantien eher verstärken als unterdrücken. Um zu untersuchen, ob der zelluläre ROS-Spiegel durch die Echinacosid-Behandlung verändert wurde, wurden dieselben Krebszellen mit 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM oder 80 μM Echinacosid für 5 Stunden, 12 Stunden oder 24 Stunden behandelt und dann durch Durchfluss analysiert Zytometrie nach Färbung mit der Fluoreszenzsonde 2′,7′-Dichlorfluoresceindiacetat. Die Ergebnisse zeigten, dass keine dieser Behandlungen den zellulären ROS-Spiegel veränderte (Abbildung 2C und D). Daher ist der erhöhte zelluläre 8-oxoG-Spiegel höchstwahrscheinlich auf die Hemmung von MTH1 durch Echinacosid zurückzuführen.

Echinacosid verursachte insbesondere in Krebszellen umfangreiche DNA-Schäden und Lücken werden durch Reparaturmechanismen versiegelt, die Lückenfüllung und Ligation durch DNA-Polymerasen und Ligasen umfassen.46,47 Ein schneller Anstieg der zellulären SSB kann jedoch die zelluläre Reparaturkapazität sättigen, was zur Bildung zahlreicher Doppelstrang-DNA-Brüche (DSB)18 und führt DDR-Signalisierung. Um zu untersuchen, ob der Echinacosid-induzierte Anstieg des zellulären 8-oxoG DNA-Schäden verursacht, untersuchten wir einen der frühen Marker für DNA-Schäden, 53BP1, der als früheste zelluläre Reaktion auf DSB an Stellen von DSB bindet.48 Das MG -63-, SK-HEP-1-, MCF-7- und SW480-Krebszelllinien und die Nicht-Krebszelllinien humane normale Leber L-O2,49 humane embryonale Niere HEK 293 und Maus-Fibroblasten NIH /3T3 wurden mit 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM oder 80 μM Echinacosid für 5 Stunden, 12 Stunden oder 24 Stunden behandelt. Die fluoreszierende Immunfärbung zeigte, dass die Behandlung mit 60 μM Echinacosid für 24 Stunden die Anzahl der Zellen mit fünf oder mehr stark gefärbten 53BP1-Kernherden bei allen Krebsarten, aber nicht bei allen Nicht-Krebszelllinien, spezifisch erhöhte (Abbildung 2E und F). Bereits 5 Stunden nach Beginn der Behandlung mit Echinacosid wurde ein signifikanter Anstieg der Anzahl von 53BP1-Plus-Zellen beobachtet (Abbildung 2F). Eine höhere Konzentration (80 μM) von Echinacosid oder eine längere Behandlungszeit (12 Stunden und 24 Stunden) führten zu einem stärkeren Anstieg sowohl der Anzahl der 53BP1-Plus-Zellen (Abbildung 2F) als auch der Anzahl der zellulären 53BP1-Herde. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die Hemmung von MTH1 durch Echinacosid eine 8--Oxo-Akkumulation und umfangreiche DNA-Schäden bei Krebs, aber nicht bei Nicht-Krebszellen verursachte.

Echinacosid unterdrückte die Proliferation von Krebszellen

In zyklischen Zellen verursachen nicht reparierte DNA-Strangbrüche einen Zusammenbruch von DNA-Replikationsgabeln, was dann zu einer Blockierung der Zellproliferation durch Induktion von Zellzyklusarrest und Apoptose führt.50 Um die Auswirkungen von Echinacosid auf Zellwachstum und -proliferation zu überprüfen, haben wir zuerst analysierten das Wachstum von mit Echinacosid behandelten MG-63-, SK-HEP-1-, MCF-7- und SW480-Krebszellen durch einen Koloniebildungsassay. Die Ergebnisse zeigten, dass die mit 60 μM oder 80 μM Echinacosid behandelten Krebszellen viel weniger Kolonien bildeten und die gebildeten Kolonien viel kleiner waren (Abbildung 3A und B), was auf ein stark unterdrücktes Wachstumspotenzial hinweist. Als nächstes analysierten wir die Proliferation dieser Krebszellen zusammen mit den Nicht-Krebszellen L-O2, HEK 293 und NIH/3T3 durch einen MTT-Assay. Die Ergebnisse zeigten, dass Echinacosid dosisabhängig die Proliferation von Krebs hemmte, aber nicht die Nicht-Krebszellen (Abbildung 3C). Eine Zeitverlaufsstudie von Krebszellen, die mit 60 μM Echinacosid behandelt wurden, zeigte, dass es nach 5 Stunden keinen signifikanten Unterschied zwischen Nichtbehandlungs- und Behandlungsgruppen gab, aber nach 12 Stunden wurde die Krebszellproliferation durch 60 μM Echinacosid signifikant gehemmt (Abbildung 3D).

Echinacosid-induzierter Zellzyklusarrest

In Übereinstimmung mit den Beobachtungen zu Zellwachstum und -proliferation zeigte die Western-Blot-Analyse, dass eine 24-stündige Behandlung mit 60 μM und 80 μM Echinacosid den Proteinspiegel des G1/S-CDK-Blockers und DNA-Synthese-Inhibitors p21Cip/ signifikant erhöhte. WAF1 in den MG-63-, SK-HEP-1-, MCF-7- und SW480-Krebszellen (Abbildung 4A und B). Darüber hinaus wurde ähnlich wie bei 53BP1 bereits 5 Stunden nach Beginn der Behandlung mit Echinacosid ein signifikanter Anstieg des p21-Proteinspiegels beobachtet ( 4B ). Die Analyse der Anzahl der Zellen in verschiedenen Stadien des Zellzyklus durch Durchflusszytometrie ergab, dass die Behandlung mit Echinacosid dosisabhängig den Prozentsatz der Zellen sowohl in der S- als auch in der G2/M-Phase reduzierte, während der Prozentsatz der Zellen in der G1-Phase zunahm (Abbildung 4C und D). Nach einer 24-stündigen Behandlung von MG-63-Zellen mit 80 μM Echinacosid verringerten sich die Zellen in der G2 /M-Phase von 15 Prozent auf nahezu Null und die Zellen in der S-Phase von 37 Prozent auf 17 Prozent, während die Zellen in der G0/ 1-Phase stieg von 43 Prozent auf 80 Prozent (Abbildung 4E). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung mit Echinacosid einen Zellzyklusarrest induzierte und die Krebszellen in der G1-Phase blockierte.

Echinacosid induzierte Apoptose in Krebszellen

In Übereinstimmung mit den Beobachtungen zur Zellproliferation zeigte die Western-Blot-Analyse, dass die Behandlung mit 60 μM und 80 μM Echinacosid über 24 Stunden die Konzentrationen an aktiver Caspase-3 und gespaltenen Poly(ADP-Ribose)-Polymeraseproteinen in erhöhte die Krebszellen (Fig. 5A und B), was auf die Induktion von Caspase-abhängiger Apoptose hindeutet. Wir untersuchten dann mehrere zelluläre Marker der Apoptose. Zunächst wurde die Kernmorphologie von mit Echinacosid behandelten Krebszellen durch Färbung mit dem DNA-Farbstoff DAPI aufgedeckt, was zeigte, dass eine 24-stündige Behandlung mit 60 μM und 80 μM Echinacosid die Anzahl der Merkmale der Apoptose, einschließlich Pyknose und kondensiertem Chromatin (hellere Kerne), erhöhte ) (Abbildung 5C). Zweitens wurde die aus ähnlich behandelten Krebszellen extrahierte DNA durch Elektrophorese auf Agarosegel analysiert, was ein typisches apoptotisches Leitermuster zeigte (Abbildung S1B). Schließlich wurde zellulär aktive Caspase-3 durch Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen, die starke aktivierte Caspase-3-Signale in mit Echinacosid behandelten Krebszellen zeigte (Abbildung S1C). Als nächstes wurde der Prozentsatz an apoptotischen Zellen durch Doppelfärbung mit Annexin V-FITC und PI und Durchflusszytometrie gemessen. Die Analyse von Zellen, die mit 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM oder 160 μM Echinacosid für 2 Stunden, 5 Stunden, 12 Stunden oder 24 Stunden behandelt wurden, zeigte, dass 60 μM oder höhere Konzentrationen von Echinacosid eine signifikante Apoptose induzierten die MG-63-, SK-HEP-1-, MCF-7- und SW480-Krebszellen (Abbildung 6A), aber nicht in den Nicht-Krebszellen L-O2, HEK 293 und NIH/3T3 (Abbildung S2). Nach 24-stündiger Behandlung von MG-63-Zellen mit 60 μM, 80 μM oder 160 μM Echinacosid stieg der Prozentsatz apoptotischer Zellen von 8,89 Prozent auf 33,72 Prozent, 39,01 Prozent bzw. 48,12 Prozent (Abbildung 6A). . Die Zeitverlaufsstudie zeigte, dass es nach 5 Stunden keinen signifikanten Unterschied zwischen Nichtbehandlungs- und Behandlungsgruppen gab, aber eine signifikante Apoptose wurde nach Behandlung mit 60 μM oder höheren Konzentrationen von Echinacosid für 12 Stunden beobachtet (Abbildungen 6B und S3).

Schließlich zeigte die Messung des mitochondrialen Membranpotentials durch den JC-1-Fluoreszenzfarbstoff deutlich einen deutlichen Verlust des mitochondrialen Membranpotentials nach der Behandlung mit 60 μM Echinacosid für 12 Stunden (Abbildung 6C), aber nicht nach 5 Stunden, was auf die Aktivierung von hinweist der intrinsische Apoptoseweg nach den DNA-Schäden, die durch erhöhtes 8-oxodG verursacht werden.