Echinacoside kehrt den myokardialen Umbau um und verbessert die Herzfunktion

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Yajuan Ni1|Jie Deng1|Xin Liu1|Qing Li1|Juanli Zhang1|Hongyuan Bai1|Jingwen Zhang2

Abstrakt

Der myokardiale Umbau ist eine wichtige pathologische Grundlage von Herzinsuffizienz, mitochondrialer oxidativer Stress ist ein Förderer von myokardialer Hypertrophie, Fibrose und Apoptose. ECH ist der Hauptwirkstoff des traditionellen chinesischen Arzneimittels Cistanches Herba, viele Studien weisen darauf hin, dass es eine starke antioxidative Kapazität in Nervenzellen und Tumoren besitzt, es hemmt mitochondrialen oxidativen Stress, schützt die mitochondriale Funktion, aber der spezifische Mechanismus ist unklar. SIRT1/FOXO3a/MnSOD ist eine wichtige antioxidative Achse, eine Studie zeigt, dass ECH kovalent an SIRT1 als Ligand bindet und die Expression von SIRT1 in Gehirnzellen hochreguliert. Wir gehen davon aus, dass ECH den myokardialen Umbau umkehren und die Herzfunktion von Herzinsuffizienz verbessern kann, indem es die SIRT1/FOXO3a/MnSOD-Signalachse reguliert und den mitochondrialen oxidativen Stress in Kardiomyozyten hemmt. Hier induzieren wir zunächst ein zelluläres Modell des oxidativen Stresses durch ISO mit AC-16-Zellen und behandeln mit ECH, dem Niveau der mitochondrialen ROS, der oxidativen Verletzung der mtDNA, MMP, carbonyliertem Protein, Lipidperoxidation, intrazellulärem ROS und Apoptose nachgewiesen werden, bestätigen die Wirkung von ECH auf mitochondrialen oxidativen Stress und funktionieren in vitro. Dann etablieren wir ein HF-Rattenmodell, das von ISO induziert wird, und behandeln es mit ECH vor. Indizes der Herzfunktion, myokardialer Umbau, mitochondrialer oxidativer Stress und Funktion, Expression der SIRT1/FOXO3a/MnSOD-Signalachse werden gemessen, die Daten zeigen, dass ECH die Herzfunktion verbessert, myokardiale Hypertrophie, Fibrose und Apoptose hemmt, die Expression von SIRT1/FOXO3a/ MnSOD-Signalachse, reduziert die mitochondrialen oxidativen Schäden, schützt die mitochondriale Funktion. Wir schließen daraus, dass ECH den myokardialen Umbau umkehrt und die Herzfunktion verbessert, indem es die SIRT1/FOXO3a/MnSOD-Achse hochreguliert und den mitochondrialen oxidativen Stress bei HF-Ratten hemmt.

SCHLÜSSELWÖRTERSechinacosid, Herzinsuffizienz, mitochondrialer oxidativer Stress, myokardialer Umbau

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1|EINLEITUNG

Herzinsuffizienz (HF) ist das Endergebnis der meisten Herz-Kreislauf-Erkrankungen mit hoher Prävalenz und schlechter Prognose, und mit dem sich verschärfenden Trend einer alternden Bevölkerung haben die Krankenhauseinweisungen und die Sterblichkeit aufgrund von chronischer Herzinsuffizienz (CHF) weltweit stark zugenommen.1 In den letzten 20 Jahren hat die medikamentöse Behandlung von Herzinsuffizienz große Fortschritte gemacht, aber die Wirkung ist sehr begrenzt, so dass neue Medikamente dringend benötigt werden. Die myokardiale Remodellierung ist eine wichtige pathologische Grundlage der Herzinsuffizienz und ist gekennzeichnet durch Myokardhypertrophie, Apoptose, interstitielle Fibrose, die Myokardzellen sind desorganisiert und führen zu einer Verringerung der Ejektionsfraktion (LVEF), einer Zunahme der linksventrikulären enddiastolischen und systolischen Dimensionen (LVIDd und LVIDs) und Abnahme der linksventrikulären fraktionalen Verkürzung (LVFS).2 Aber die zugrunde liegenden Mechanismen waren noch nicht vollständig verstanden. In den letzten Jahren haben zahlreiche Studien bestätigt, dass oxidativer Stress ein wichtiger Förderer des myokardialen Umbaus ist.3-7

Oxidativer Stress ist ein Zustand, bei dem reaktive Sauerstoffspezies (ROS) oder freie Radikale übermäßig erzeugt werden und zu einer oxidativen Schädigung von Zellkomponenten führen, was wiederum zu Zellstörungen führt.8 Mitochondrien sind die Hauptquelle für intrazelluläre ROS Austreten aus der Atmungselektronentransportkette, und Mitochondrien sind die empfindlichste Position für die ROS-Effekte.9 Studien bei Herzinsuffizienz identifizierten eine erhöhte ROS-Erzeugung aus Komplex I der Atmungskette.8 Eine erhöhte ROS-Produktion greift zuerst die mitochondrialen Komponenten an und führt zu übermäßigem oxidativem Stress , manifestiert sich als Carbonylierung von Proteinen, Lipidperoxidation und DNA-Schädigung,10 und Dysfunktion von Mitochondrien, die folglich zu einer übermäßigen Bildung von ROS führen,8 bildet einen Teufelskreis. Es wurde gezeigt, dass anhaltender oxidativer Stress Myokardhypertrophie und Myokardfibrose verursachen kann,11-13 und Apoptose von Myokardzellen durch Aktivierung von mitochondrienabhängiger Apoptose als Ergebnis der Carbonylierung von mitochondrialen Membranproteinen und Verlust des mitochondrialen Membranpotentials verursachen kann.14 So , wird davon ausgegangen, dass die Hemmung des mitochondrialen oxidativen Stresses eine neue Strategie sein könnte, um myokardialen Umbau und sogar Herzinsuffizienz zu verhindern.15-17

Echinacosid (ECH), ein natürliches Phenylethanoidglykosid, ist der Hauptwirkstoff von Cistanches Herba, einer traditionellen chinesischen Medizin. In den letzten Jahren wurde ECH ausführlich im Nervensystem und in Tumoren untersucht, und es wurde berichtet, dass es eine Vielzahl von pharmakologischen Wirkungen besitzt, wie z. B. antioxidative, entzündungshemmende, Anti-Apoptose- und Anti-Tumor-Eigenschaften.18,19In Nervenzellen erhöht ECH die antioxidative Kapazität signifikant, reduziert die ROS-Produktion, verbessert das mitochondriale Membranpotential (MMP) und erhöht die Zelllebensfähigkeit,20 zeigt schützende Wirkungen auf die mitochondriale Funktion und hemmt mitochondrialen oxidativen Stress, es schützt vor oxidativen Verletzungen und verbessert das Gedächtnis, verhindert schließlich Neurodegeneration.21,22 ECH erhöht auch die Aktivität von SOD und spielt eine schützende Rolle im Gehirngewebe und Netzhautgewebe,19,23 aber der spezifische Mechanismus für seine antioxidative Wirkung ist unklar.

SIRT1 ist eng mit oxidativem Stress verbunden, und die SIRT1/FOXO3a/MnSOD-Signalachse ist die wichtigste antioxidative Achse und für die Unterdrückung von mitochondrialem oxidativem Stress verantwortlich, MnSOD verteilt sich weit in den Mitochondrien und ist somit in erster Linie für die Beseitigung von mitochondrialen ROS verantwortlich oxidativen Stress hemmen, können Verbindungen, die diese antioxidative Achse aktivieren, oxidativen Stress hemmen.24,25 Jüngste Studien haben gezeigt, dass ECH seine pharmakologischen Wirkungen über die Regulierung mehrerer Signalwege ausübt, wie z. B. p-AKT, mTOR/STAT3, TGF-beta 1/Smads , und SIRT1-Signalweg.26-29 Eine neue Studie stellt fest, dass ECH kovalent an SIRT1 als Liganden bindet und die Expression von SIRT1 in Gehirnzellen hochreguliert.26Es deutet darauf hin, dass ECH den mitochondrialen oxidativen Stress in Kardiomyozyten und umgekehrtem Myokard hemmen kann Umbau. Die Forschung zu den Wirkungen von ECH hat sich jedoch auf das Nervensystem oder den Tumor konzentriert, die Wirkungen und Mechanismen von ECH auf mitochondrialen oxidativen Stress in Kardiomyozyten und Myokardumbau bleiben unbekannt. Hier induzieren wir zunächst ein zelluläres Modell von oxidativem Stress durch ISO und bestätigen die Wirkung von ECH auf mitochondrialen oxidativen Stress und Funktion in vitro. Dann etablieren wir ein durch ISO induziertes HF-Rattenmodell und zeigen, dass ECH den myokardialen Umbau umkehrt und die Herzfunktion verbessert, indem es die SIRT1/FOXO3a/MnSOD-Signalachse hochreguliert und den mitochondrialen oxidativen Stress bei HF-Ratten hemmt. Die Ergebnisse sollen experimentelle Hinweise für die Entwicklung neuer Medikamente zur Vorbeugung von Herzinsuffizienz liefern.

2|MATERIALEN UND METHODEN

2.1|Zellkultur und Behandlung

AC16-Zellen werden von Bena Culture Collection bezogen. Die Zellen werden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit hohem Glukosegehalt (DMEM; Hyclone, GE Healthcare, USA) gehalten, das mit 10 % fötalem Rinderserum (10 % FBS; Gibco) in T-75-Kolben (Corning Glassworks, Corning, USA) ergänzt wird. New York, USA). Die Bedingungen werden bei 37 Grad in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 Prozent CO2 gehalten. Sobald die Zellen 70 Prozent -80 Prozent Konfluenz erreichen, werden die Zellen der Gruppe ISO (Sigma, USA) mit einem Medium, das 10 uM ISO (Sigma, USA) enthält, für 24 Stunden inkubiert, die Zellen der ECH-Gruppe werden mit 50 uM ECH (MCE , USA) für 30 Minuten vor der ISO-Belichtung. Kontrollzellen (Strg) werden nicht behandelt.

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2.2|Nachweis des mitochondrialen ROS-Spiegels mittels Luminol-Chemilumineszenz

Mitochondrien werden aus AC-16-Zellen unter Verwendung des Mitochondria Isolation Kit (Sigma, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert und gereinigt. Proteinkonzentrationen werden durch das BCA-Protein-Assay-Kit (Biotech) bestimmt. Mitochondrialer ROS-Spiegel wird durch Luminal (3-Aminophthalsäurehydrazid 5-Amino-2,3-Dihydro-1,4-Phthalazindion) unter Verwendung eines Elisa-Kits nachgewiesen (GERMED SCIENTIFIC INC, USA), es reagiert mit ROS und verursacht die Emission von Photonen, was ein Bandspektrum mit einer Spitze bei etwa 460 nm ist, und die relative Lichteinheit (RLU) wird durch ein Chemilumineszenz-Messinstrument erfasst und in RLU/ug umgewandelt mitochondriales Protein.

2.3|8-OHdG wird verwendet, um die oxidative Schädigung der mitochondrialen DNA zu bewerten

Die oxidative Schädigung der mitochondrialen DNA wird durch den Nachweis des Gehalts an 8-Hydroxy-2-desoxyguanosin (8-OHG) bewertet. Gereinigte Mitochondrien in Zellen werden unter Verwendung eines Mitochondrien-Isolierungskits wie oben (Sigma) isoliert. Proteinkonzentrationen werden durch das BCA-Protein-Assay-Kit (Biotech) bestimmt. Dann werden sie dissoziiert, um den Gehalt an 8-OHdG unter Verwendung eines Elisa-Kits (GERMED SCIENTIFIC INC, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen. Die Extinktion der Farbänderung wird in einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen. Die Konzentration von 8-OHdG in den Proben wird dann durch Vergleich der OD der Proben mit der Standardkurve bestimmt und in ng/ml umgerechnet.

2.4|Messung von MMP durch JC-1

Mitochondrien werden isoliert und von AC-16 gereinigt und die Proteinkonzentration wird wie oben erwähnt bestimmt. Dann werden die Mitochondrien bei einer Konzentration von 1 mg/ml resuspendiert, das MMP wird unter Verwendung eines JC-1-Testkits gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Die Fluoreszenzintensität wird bei Anregungswellenlänge: 490 nm, Schlitz 5 nm, Emissionswellenlänge: 590 nm, Schlitz 5 nm mit einem Spektrophotometer-Instrument gemessen,30 die Ergebnisse werden als FLU/ugP dargestellt.

2.5|Nachweis apoptotischer Zellen durch Durchflusszytometrie in AC-16-Zellen

Durchflusszytometrie wird verwendet, um die zelluläre Apoptose zu beurteilen. Ein Annexin V-FITC/PI-Apoptose-Nachweiskit (CWBIO, China) wird verwendet, um apoptotische und nekrotische Zellen gemäß den Anweisungen des Lieferanten nachzuweisen. Apoptose im Frühstadium, Apoptose im Spätstadium oder Nekrose, Zelltrümmer und lebensfähige Zellen werden als Annexin V (plus)/PI (–), Annexin V (plus)/PI (plus), Annexin V (–)/PI identifiziert ( plus ) bzw. Annexin V (–)/PI (–). Fluoreszenzintensitäten werden unter Verwendung eines Durchflusszytometers (BD FACSVerse TM Flow Cytometer, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) analysiert. Jeder Versuch wird dreimal wiederholt.

2.6|Beurteilte die intrazelluläre ROS durch Durchflusszytometer

Nach der Behandlung werden die Zellen trypsinisiert und zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellen werden dann in PBS resuspendiert, mit DCFH-DA (Beyotime, China) in der Endkonzentration von 1 μM gefärbt und für 1 h bei 37 Grad in einem Inkubator mit CO2 inkubiert und dann in einem Durchflusszytometer bei 488 nm Anregung getestet . Die Fluoreszenzintensität repräsentiert den Gehalt an intrazellulärem ROS.

2.7|Testen Sie den Carbonylproteingehalt in Mitochondrien von AC-16-Zellen

Nach der Behandlung werden gereinigte Mitochondrien isoliert und auf Eis beschallt und mit 1 Prozent Streptomycinsulfat behandelt, um mitochondriale Nukleinsäuren auszufällen, die Proteinkonzentration wird bestimmt. Der Carbonylproteingehalt wird mit einem Elisa-Kit (GERMED SCIENTIFIC INC, USA) basierend auf der Derivatisierung der Carbonylgruppe mit Dinitrophenylhydrazin (DNPH) gemäß den Anweisungen des Kits getestet, die OD wird mit einem Mikroplatten-Reader gemessen und in nmol/ mg Protein durch Vergleich mit der Standardkurve.

2.8|Bestimmung des Lipidperoxidationsniveaus in Mitochondrien von AC-16-Zellen

Nach der Behandlung werden Zellen gesammelt und lysiert, Mitochondrien werden isoliert und gereinigt und durch Ultraschall gecrackt, die Proteinkonzentration wird durch das BCA-Protein-Assay-Kit (Biotech) bestimmt, die Lipidperoxidation wird durch den Gehalt an Malondialdehyd (MDA) über den TBARS-Assay bestimmt , unter Verwendung eines Kits (Nan jing Jian cheng, China) und der MDA-Level wird gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen. OD wird bei 586 nm durch einen Mikroplattenleser detektiert und durch Vergleich mit der Standardkurve in μmol/g Protein umgerechnet.

2.9|Tiere und Behandlung

Junge männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 120-140 g werden vom Labortierzentrum der Xi'an Jiao tong University (Shaanxi, China) erworben. Die Untersuchung entspricht dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, veröffentlicht von den US National Institutes of Health (NIH-Veröffentlichung Nr. 85-23, überarbeitet 1996), und die Versuchsprotokolle wurden von den örtlichen Behörden genehmigt ( Komitee für biomedizinische Ethik der Medizinischen Fakultät der Xi'a Jiao Tong Universität). Das Rattenmodell von HF wird wie zuvor von uns beschrieben etabliert.31 Kurz gesagt, Isoproterenol (10 mg/kg) wird einmal täglich durch intraperitoneale Injektion für 2 Wochen (definiert als HF-Gruppe) verabreicht, ECH wird mit 20 verabreicht ug/g einmal täglich durch intraperitoneale Injektion 30 Minuten vor der Behandlung mit ISO (definiert als ECH-Gruppe), und die Verabreichung dauert 2 Wochen. Kontrolltieren wird 0,9 Prozent NaCl (definiert als Ctrl-Gruppe) verabreicht. Echokardiographische Messungen werden durchgeführt, um die Herzfunktion zu beurteilen.

2.10|Echokardiographische Messungen

Die Tiere werden durch eine intraperitoneale Injektion von 300 mg/kg Chloralhydrat anästhesiert. Für echokardiographische Untersuchungen wird das Ultraschallsystem SONOS-2500 mit einem Ultraschallwandler von 7,5 MHz (HP, USA) verwendet. Die linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF), linksventrikuläre fraktionale Verkürzung (LVFS), linksventrikuläre enddiastolische Dimensionen (LVIDd), linksventrikuläre endsystolische Dimensionen (LVIDs), Herzfrequenz (HR), interventrikuläre Septumdicke in der Diastole (IVSTd ), linksventrikuläre Hinterwanddicke in der Diastole (LVPWTd) werden wie zuvor von uns beschrieben gemessen.32

ABBILDUNG 1 50μmol ECH hemmt effektiv den mitochondrialen oxidativen Stress von AC-16-Zellen, der durch 10μmol/L ISO induziert wird, schützt die mitochondriale Funktion und reduziert die Apoptose.

2.11|Das Verhältnis von Herzgewicht zu Körpergewicht (HW/BW) wird gemessen

Die Ratte wird vor der Betäubung gewogen, das frische Herz wird isoliert und Blut mit 0,1 mol/l PBS ausgewaschen, Gefäße und anderes überflüssiges Gewebe weggeschnitten und das Herz wird gewogen, dann HW/BW (mg/100 g). berechnet.

2.12|Histologische Färbung

Die Herzen von Ratten werden präpariert und in 4 % Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und in 5 μm dicke Scheiben geschnitten. Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung wird verwendet, um die pathologischen Veränderungen zu beobachten, und Masson's Trichrom wird verwendet, um Kollagenfasern von Myokardgewebe von Ratten zu bewerten. Die kardiale Kollagenvolumenfraktion (CVF) und die Querschnittsfläche der Kardiomyozyten werden mit Image-Pro Plus 6 gemessen. 0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA).

2.13|TUNEL-Färbung

Myokardgewebe aus dem linken Ventrikel wird gesammelt und der TUNEL-Assay wird wie zuvor von uns beschrieben durchgeführt32

2.14|Transmissionselektronenmikroskop

Frisches Herzgewebe wird in 2,5 % Glutaraldehyd bei 4 Grad fixiert, das Gewebe wird dann in 1 mm3 Volumen geschnitten und erneut in 2,5 % Glutaraldehyd bei 4 Grad für 2 Stunden fixiert, dann wird es mit 0,1 mol/l PBS gewaschen, fixiert in 1-prozentiger Osminsäure, dehydriert mit Aceton, eingebettet in Epoxidharz, werden ultradünne Scheiben mit einer Dicke von etwa 800 nm hergestellt, mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und dann unter einem Transmissionselektronenmikroskop (H{ {13}}, Hitachi Limited, Japan). Um die Schutzwirkung von ECH in der mitochondrialen Morphologie zu quantifizieren, werden der mittlere mitochondriale Umfang, die mittlere mitochondriale Querschnittsfläche, der Prozentsatz der Degeneration und der Prozentsatz der Vakuolisierung in Mitochondrien statistisch mit Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, USA) analysiert.

2.15|Quantitative PCR

Gesamt-RNA wird aus linksventrikulärem Gewebe mit Trizol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, USA) präpariert. cDNA wird unter Verwendung des TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Japan) synthetisiert. Spezifische Primersequenzen von Kollagen I, die für Echtzeit-PCR verwendet werden, lauten wie folgt: Vorwärts: 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTC-3′, Rückwärts: 5′-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3′. GAPDH forward 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3', reverse 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'.Quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) wird mit SYBRPremix Ex durchgeführt Taq (Perfekte Echtzeit) (Takara, Japan). Der relative mRNA-Spiegel wird durch Normalisierung auf GAPDH gemäß der 2-ΔΔCT-Methode berechnet.

2.16|Western-Blot-Analyse der Proteinexpression von SIRT1, FOXO3a, MnSOD

Gesamtprotein des linksventrikulären Gewebes wird auf Eis unter Verwendung von kaltem RIPA-Puffer (BioRad, USA) mit Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma-Aldrich) extrahiert. Die Konzentration wird nach der BCA-Methode bestimmt. Western-Blot-Verfahren wurden zuvor beschrieben.33 Kurz gesagt, die Proteinprobe wird auf 15-prozentigen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen fraktioniert, auf PVDF-Membranen (BioRad, USA) übertragen, mit 5-prozentiger Magermilch blockiert und mit MYH-Antikörper aus der Maus inkubiert (verdünnt 1:200, Santa Cruz, USA). Dann inkubiert mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziege-Maus-Antikörper (1:2 verdünnt, 000, Santa Cruz, USA). Der relative Proteinspiegel wird berechnet, indem der mittlere Strahlwert auf -Aktin normalisiert wird. Proteinbanden werden durch ein Chemilumineszenzsystem (ChemiDoc XRS, BioRad) nachgewiesen.

2.17|Messung des mitochondrialen oxidativen Stresses im Rattenmyokard

Gereinigte Mitochondrien des Rattenmyokards werden unter Verwendung des Mitochondrien-Isolationskits (Sigma, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert, mitochondriale ROS, MMP, oxidative Schädigung von mtDNA, carbonylierter Proteingehalt und Lipidperoxidationsgrad in Mitochondrien werden alle unter Verwendung der gleichen Methoden wie nachgewiesen Zellversuche oben beschrieben. Bemerkenswerterweise wird ROS in myokardialem Gewebe mit DCFH-DA-Fluoreszenzsonden nachgewiesen, die Fluoreszenzintensität wird mit dem Enzymmarkierungsmessgerät nachgewiesen, die Ergebnisse werden als RLU/ug mitochondriales Protein dargestellt.

2.18|statistische Analyse

Alle Daten sind als Mittelwerte ± SEM dargestellt. Die einfache ANOVA wird verwendet, um die Unterschiede zwischen mehreren Gruppen zu vergleichen, gefolgt vom Tukey-Post-Hoc-Test auf Signifikanz. Alle Statistiken werden mit der Software SPSS15.0 (SPSS Inc, IL, USA) ermittelt. Ein Wahrscheinlichkeitswert von P < 0,05="" wird="" als="" signifikant="">

3|ERGEBNISSE

3.1|50 μM ECH hemmt wirksam mitochondriale oxidative Schäden und Apoptose in AC-16-Zellen

Unbehandelte Zellen werden als Strg-Gruppe festgelegt. Erstens hemmt ECH, wie Abbildung 1A zeigt, mitochondriale ROS, die durch ISO induziert werden. ISO-behandelte Zellen zeigen einen signifikanten Anstieg der mitochondrialen ROS im Vergleich zu Ctrl und dieser Anstieg wird durch die Vorbehandlung mit 50 μM ECH signifikant abgeschwächt. Zweitens kann ECH die durch ISO induzierte oxidative Schädigung von mtDNA hemmen. 8-OHdG gilt als eine der häufigsten DNA-Läsionen, die durch oxidativen Stress verursacht werden, und ist ein Biomarker für oxidative DNA-Schäden und -Reparatur. Wie Abbildung 1B zeigt, wird der Gehalt an 8-OHdG in gereinigten Mitochondrien aus AC-16-Zellen nachgewiesen, die Ergebnisse zeigen, dass der Gehalt an 8-OHdG in Mitochondrien aus ISO-behandelten Zellen dramatisch angestiegen ist. aber die Änderung wurde durch 50 μM ECH rückgängig gemacht. Drittens schützt ECH effektiv die MMP, die durch ISO beeinträchtigt wird. Die Fluoreszenzintensität ist bei mit ISO behandelten Zellen im Vergleich zu Ctrl-Zellen signifikant verringert, während eine Vorbehandlung mit 50 μM ECH die Reduktion von MMP bemerkenswert dämpft, wie Abbildung 1C zeigt. Viertens schützt ECH vor oxidativer Schädigung des mitochondrialen Proteins in AC-16-Zellen. Wie Abbildung 1D zeigt, ist der Carbonylproteingehalt in Mitochondrien von ISO-Behandlungszellen signifikant erhöht und ECH schwächt die Wirkung ab. Fünftens hemmt ECH auch die durch ISO induzierte mitochondriale Lipidperoxidation in AC-16-Zellen. Wie Abbildung 1E zeigt, ist der Gehalt an Lipidperoxiden in Mitochondrien von ISO-Zellen offensichtlich höher als in Ctrl-Zellen, während dieser Anstieg durch 50 μM ECH-Vorbehandlung deutlich reduziert wird. Letztendlich hemmt ECH die Akkumulation von intrazellulärem ROS. Wie Abbildung 1F zeigt, ist der intrazelluläre ROS-Spiegel in ISO-Zellen deutlich erhöht und in ECH-vorbehandelten Zellen deutlich verringert. Abbildung 1G zeigt, dass die Apoptoserate von AC-16-Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit 10 μM ISO im Vergleich zu den Ctrl-Zellen signifikant erhöht ist, während Vorbehandlungszellen mit 50 μM ECH die ISO-induzierte Apoptose signifikant reduzieren.

ABBILDUNG 2 Die durch ISO induzierte Herzhypertrophie von Ratten mit Herzinsuffizienz wird gelindert und die Herzfunktion wird durch die ECH-Behandlung signifikant verbessert.

3.2|ECH kehrt den myokardialen Umbau um und verbessert die Herzfunktion von ISO-induzierten HF-Ratten

Wie in Fig. 2A gezeigt, weisen die Herzen von HF-Ratten eine offensichtliche Hypertrophie auf und werden durch die Behandlung mit ECH umgekehrt. Wie die Fig. 2B-D und L zeigen, reduziert ECH das HW/BW. Echokardiographie-Ergebnisse zeigen, dass LVEF und LVFS in der Gruppe mit Herzinsuffizienz signifikant reduziert sind, LVIDd, LVIDs und IVSTd in der Gruppe mit Herzinsuffizienz signifikant erhöht sind. ECH senkt jedoch signifikant LVIDd, LVIDs, IVSTd und verbessert LVEF und LVFS, es gibt keinen signifikanten Unterschied in der HR zwischen den drei Gruppen, LVPWTd ist bei HF erhöht, aber kein Unterschied zwischen ECH und Ctrl oder zwischen ECH und HF, alle wie Abbildung 2E-K zeigt. Die Ergebnisse der HE-Färbung zeigen, dass Myokardhypertrophie, arrangierte Störung oder Degenerationsnekrose, entzündliche Zellinfiltration und interstitielle Hyperämie und Ödeme bei HF-Ratten und ECH diese Schäden signifikant lindert, Myokardhypertrophie und arrangierte Störung gelindert werden Degenerationsnekrose und entzündliches Infiltrat werden reduziert, wie in Abbildung 3A gezeigt. Die Querschnittsfläche des Kardiomyozyten wird gemessen, sie ist nach ISO signifikant erhöht und in der mit ECH behandelten Gruppe verringert, wie Abbildung 3E zeigt. Bewertungen der Kollagenablagerung durch Masson-Färbung zeigen, dass der linksventrikuläre Kollagengehalt in HF-Ratten offensichtlich erhöht und nach der Behandlung mit ECH offensichtlich verringert ist, was offensichtlich CVF verringert. Die Echtzeit-PCR-Analyse zeigt, dass Transkripte vom Prokollagentyp Ⅰ in ISO-Ratten hochreguliert und in ECH-Ratten herunterreguliert sind. Diese Ergebnisse stimmen miteinander überein, wie die Abbildungen 3B und FG zeigen. Die Daten zeigen, dass ECH die Kollagenablagerung effektiv reduziert . Die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen in Kardiomyozyten ist bei HF-Ratten im Vergleich zu Ctrl signifikant erhöht, ECH reduziert die Apoptose von Myokardzellen deutlich, und Abbildung 3C-D zeigt das repräsentative Bild von TUNEL-positiven Zellen in Feldern mit niedriger bzw. hoher Leistung und Abbildung 3H zeigt die Apoptoserate von Myokardzellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass ECH myokardiale Hypertrophie, myokardiale interstitielle Fibrose und Apoptose wirksam umkehrt und die Herzfunktion bei durch ISO induzierten HF-Ratten verbessert.

ABBILDUNG 3 Die Ergebnisse der histologischen Färbung zeigen, dass ECH den durch ISO induzierten linksventrikulären Umbau von HF-Ratten umkehrt.

3.3|ECH schützt die myokardiale Ultrastruktur bei HF-Ratten

Die Ergebnisse der Transmissionselektronenmikroskopie zeigen, dass die Schädigung der myokardialen Ultrastruktur durch ECH abgeschwächt werden könnte, wie Abbildung 4A-B zeigt. Myofibrillen sind vertikal angeordnet, die Sarkomerstruktur ist offensichtlich, die Myofilamente sind ordentlich angeordnet und die Z-Linie ist klar. Mitochondrien sind ordentlich angeordnet und die Struktur ist bei Ctrl-Ratten klar. Die Myofibrillen sind jedoch desorganisiert, gerissen und aufgelöst, die Sarkomerstruktur ist verschwommen, das Fehlen der Z-Linie, die myokardiale Kontraktionszone ist sichtbar, die Anzahl und das Volumen der Mitochondrien sind erhöht, die Mitochondrien haben unterschiedliche Formen und Größen, sind ungeordnet angeordnet, die Struktur ist unklar, Schwellung und Crista-Fragmentierung, Kollaps oder Verklumpung und Auflösung in Vakuolen bei HF-Ratten. ECH schwächt diese Veränderungen offensichtlich ab, die Mehrheit der Herzmuskelfasern sind ordentlich angeordnet und Myokardfilamente sind klar, die Z-Linie ist vorhanden, obwohl eine gewisse Auflösung der Filamente offensichtlich ist, die Sarkomerstruktur ist klar, die Dichte der Mitochondrien ist verringert, die Formen und Größen werden entlastet, ordentlicher angeordnet, Mitochondrienschwellung und Crista-Fragmentierung, Kollaps oder Verklumpung und Vakuolisierung werden durch ECH im Vergleich zu HF offensichtlich reduziert. Mitochondrienschwellung und Crista-Fragmentierung, Kollaps oder Verklumpung und partielle Vakuolisierung werden als mitochondriale Degeneration identifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass ECH die myokardiale Ultrastruktur wirksam schützt und insbesondere die mitochondriale Morphologie bei HF-Ratten schützt, wie Abbildung 4C-F zeigt.

ABBILDUNG 4 ECH schützt die Ultrastruktur von Kardiomyozyten und die mitochondriale Morphologie von ISO-induzierten HF-Ratten.

3.4|ECH reguliert die Proteinexpression von SIRT1, FOXO3a und MnSOD hoch

Die Western-Blot-Analyse zeigt, dass das Proteinexpressionsniveau von SIRT1, FOXO3a und MnSOD bei HF-Ratten signifikant herunterreguliert ist, ECH jedoch offensichtlich die verringerte Proteinexpression hochreguliert. Die repräsentativen Proteinbanden von Immunblotting- und statistischen Analyseergebnissen sind in Abbildung 5 dargestellt. Der Teil der Daten weist darauf hin, dass ECH die Proteinexpression von SIRT1, FOXO3a und MnSOD erhöht.

3.5|ECH hemmt mitochondrialen oxidativen Stress im linksventrikulären Myokardgewebe

In diesem Teil werden mitochondriale ROS, MMP, oxidative Schädigung der mitochondrialen DNA, Carbonylproteingehalt und Lipidperoxidationsniveau in Mitochondrien im linksventrikulären Myokardgewebe von Ratten gemessen, und die Ergebnisse stimmen mit Zellexperimenten überein, das heißt, ECH verringert mitochondriale ROS, schützt MMP, lindert den Schädigungsgrad von mtDNA, reduziert den Carbonylproteingehalt und die Lipidperoxidation in Mitochondrien, wie Abbildung 6 zeigt.

ABBILDUNG 5 ECH reguliert das Proteinexpressionsniveau von SIRT1, FOXO3a und MnSOD hoch, das bei HF-Ratten herunterreguliert ist.

4|DISKUSSION

Diese Studie zeigt, dass ECH eine wirksame Rolle bei der Prävention des myokardialen Umbaus und der Verbesserung der Herzfunktion spielt, indem es die SIRT1/FOXO3a/MnSOD-Signalachse hochreguliert und den mitochondrialen oxidativen Stress hemmt.

Mitochondrien sind der Hauptort der Entstehung von ROS als Nebenprodukt der oxidativen Phosphorylierung, da aufgrund ihrer Nähe zu ROS angenommen wird, dass mitochondriale Proteine, Lipide und mtDNA die primären Ziele oxidativer Schäden nach übermäßiger Emission von mitochondrialen ROS sind,34,35 Dieser Schaden stimuliert die weitere Produktion von ROS, der Teufelskreis setzt sich fort, ROS und oxidativer Stress könnten durch Aktivierung mehrerer Signalwege zu myokardialer Hypertrophie, Apoptose, interstitieller Fibrose und Herzinsuffizienz führen Stress sind wirksam zur Verhinderung des myokardialen Umbaus. ECH ist ein natürliches Phenylethanoidglykosid, ein Bestandteil des traditionellen chinesischen Krauts Cistanche tubulosa. es wurde umfassend untersucht und es wurde in den letzten Jahren nachgewiesen, dass es verschiedene pharmakologische Aktivitäten besitzt, wie z. B. Anti-Tumor, Anti-Apoptose, Anti-Aging, neuroprotektive Wirkung und so weiter. Studien haben bewiesen, dass die pharmakologischen Wirkungen von ECH hauptsächlich von seiner Eigenschaft der antioxidativen und entzündungshemmenden Aktivität abhängen18,21 und ECH die mitochondriale ROS verringert und die mitochondriale Funktion vor oxidativen Schäden in Nervenzellen schützt.20,22 Hier haben wir das zum ersten Mal gezeigt ECH verringert die mitochondriale ROS von Kardiomyozyten und verbessert somit MMP, reduziert oxidative Schäden an mtDNA, Protein und Lipiden, hemmt wirksam oxidative Schäden an Mitochondrien und reduziert Apoptose in vitro und in vivo, kehrt also den myokardialen Umbau um und verbessert die Herzfunktion. Dies bedeutet, dass ECH ein potenzielles neues Medikament zur Prävention von myokardialem Umbau und Herzinsuffizienz ist.

Unter normalen Bedingungen wird mitochondriale ROS hauptsächlich durch MnSOD beseitigt, das sich in den Mitochondrien verteilt und vor mitochondrialen oxidativen Schäden schützt. Ang II verringert signifikant die MnSOD-Expression von Kardiomyozyten und induziert eine myokardiale Hypertrophie, Resveratrol könnte jedoch die Expression von MnSOD erhöhen und die durch Ang II induzierte myokardiale Hypertrophie hemmen.36 Bei Herzinsuffizienz ist die Aktivität von MnSOD signifikant verringert und die Bildung von mitochondrialen ROS erhöht .37,38 Bei herzspezifischen MnSOD-Gen-Knockout-Mäusen konnte mitochondriale ROS nicht beseitigt werden und ROS ist in Kardiomyozyten erhöht, was zu einer mitochondrialen Dysfunktion und fortschreitender Herzvergrößerung führte, was schließlich zu Herzversagen führte.39 In der vorliegenden Studie bestätigen wir dies dass die Expression von MnSOD signifikant verringert wird, was durch die ECH-Behandlung abgeschwächt wird, und somit die mitochondriale ROS reduziert und der mitochondriale oxidative Stress gehemmt wird. Das bedeutet, dass ECH Kardiomyozyten durch Hochregulierung der Expression von MnSOD vor oxidativen Schäden schützt, wir untersuchen weiter die molekularen Mechanismen, die diesen Effekten zugrunde liegen.

Die Expression von MnSOD wird durch FOXO3a reguliert, das ein Transkriptionsfaktor ist und in der Genpromotorregion von MnSOD bindet und zur Förderung der Gentranskription führt.40 SIRT1 ist ein stromaufwärts gelegenes Molekül von FOXO3a und kann FOXO3a durch Deacetylierung aktivieren. Die SIRT1/FOXO3a/MnSOD-Signalachse spielt eine zentrale Rolle beim Schutz vor oxidativem Stress in verschiedenen Zelltypen, die Aktivierung der Signalachse durch Estradiol hemmt oxidativen Stress und übt den Herzschutz aus24; Die Aktivierung der Signalachse durch Resveratrol hemmt den durch oxidativen Stress induzierten Zelltod40; Andernfalls hemmt Angiotensin II den SIRT1/FoxO3a/MnSOD-Weg und induziert mitochondrialen oxidativen Stress, mtDNA-Schäden in Osteoblasten,41Typ-5-Adenylylcyclase erhöht den oxidativen Stress durch Hemmung der MnSOD-Expression über den Sirt1/FoxO3a-Weg.42 Die vorliegende Studie stellt fest, dass die die Expression von SIRT1, FoxO3a und MnSOD sind alle bei HF-Ratten signifikant reduziert und die mitochondriale ROS ist erhöht und der oxidative Stress wird verstärkt, jedoch werden die Veränderungen durch ECH rückgängig gemacht. Neue Forschungsergebnisse weisen darauf hin, dass ECH SIRT1 direkt als Ligand bindet und einen Komplex mit 9 kovalenten Bindungen bildet und die Expression von SIRT1 in Nervenzellen hochreguliert.26 In Übereinstimmung mit dieser Studie zeigt die vorliegende Studie, dass ECH auch die Expression von hochreguliert SIRT1 in Kardiomyozyten reguliert es dann die Genexpression von MnSOD durch FoxO3a hoch und hemmt mitochondriale ROS und oxidativen Stress.

Langfristige chronische Ischämie kann myokardialen Winterschlaf verursachen, diese myokardialen Zellen im Winterschlaf zeigen typischerweise einen Verlust an kontraktilen Filamenten, es gibt überschüssige Glykogenkörner im Zytosol, sarkoplasmatisches Retikulum und transversale Tubuli gehen verloren,43 außerdem gibt es Anomalien in der Größe und Form der Mitochondrien , reaktive myokardiale Hypertrophie und interstitielle Fibrose, die sekundär zu Myozytenverlust führen.44 Wir beobachteten in unserer Studie auch die oben genannten Veränderungen bei HF-Ratten, während ECH diese Veränderungen signifikant linderte, da die neueste Studie über die Wiederherstellung der Herzfunktion nach ischämischem Stress berichtete Als Merkmal des myokardialen Ruhezustands45 wird auch der myokardiale Glykogenspiegel gemessen, die Ergebnisse zeigen, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen den drei Gruppen gibt, wie in Abbildung 7J gezeigt.

Die vorherige Studie entdeckte auch myokardialen Winterschlaf in einem Schweinemodell mit nicht-ischämischer Herzinsuffizienz, indem die LV-freie Wand mit hoher Frequenz stimuliert wurde,46 da mikrovaskuläre Obstruktion eine wichtige Rolle im myokardialen Winterschlaf und der daraus resultierenden kontraktilen Dysfunktion spielt, und das wird deutlich verbessert, wenn die Die mikrovaskuläre Obstruktion wird durch ein Medikament rückgängig gemacht.47 Gegenwärtig kommen einige Studien zu dem Schluss, dass die Revaskularisierungstherapie beim Überwintern des Myokards wirksam ist.43 Durch die Verwendung von HE und Masson-Färbung beobachten wir, dass die myokardiale Kapillar- und Arteriolendichte bei HF-Ratten offensichtlich reduziert und signifikant entlastet wird durch ECH, wie in Abbildung 7A-H gezeigt. Frühere Studien haben gezeigt, dass andere natürliche Verbindungen, wie Gersten-Beta-Glucan, kardioprotektive Wirkungen ausüben, indem sie die Expression von MnSOD erhöhen,48,49, und der Anstieg von MnSOD mit der erhöhten myokardialen Kapillardichte und der VEGF-Expression zusammenhängt. Wir führten RT-PCR durch, um die Expression von VEGF nachzuweisen, die Daten stimmen mit dem Befund der histologischen Färbung überein, was bedeutet, dass ECH die Angiogenese fördern und die myokardiale Kapillardichte durch Regulierung der VEGF-Expression erhöhen kann, wie in Abbildung 7I gezeigt. Die vorliegende Studie stellt fest, dass ECH die Myokardkapillaren und -arteriolen über den hochregulierenden SIRTI/FOXO3a/MnSOD-Weg und die Expression von VEGF schützen und vergrößern kann, wodurch das Myokard im Winterschlaf unterdrückt und zur Verbesserung der Herzfunktion beigetragen wird.

Cistanche trägt dazu beizuVerbesserung der Herzfunktion.

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Bemerkenswert ist, dass Kardiomyozyten-Apoptose bekanntermaßen eine wichtige pathologische Veränderung bei Herzinsuffizienz ist, und die vorliegende Studie bestätigt tatsächlich, dass eine große Menge apoptotischer Zellen in HF-Ratten und ECH die Apoptose signifikant reduziert, indem sie den SIRTI/FOXO3a/MnSOD-Weg reguliert und hemmt mitochondrialer oxidativer Stress, wie oben erwähnt.

Vor allem kehrt ECH den myokardialen Umbau um und verbessert die Herzfunktion durch Hochregulierung der SIRT1/FoxO3a/MnSOD-Signalachse, wodurch der mitochondriale oxidative Stress gehemmt und das Myokard im Ruhezustand reduziert wird. Daher wird nahegelegt, dass ECH ein potenzielles Medikament zur Vorbeugung oder Behandlung von myokardialem Umbau und Herzinsuffizienz ist.