Echinacosid unterdrückt die Dexamethason-induzierte Wachstumshemmung und Apoptose in osteoblastischen MC3T3-E1-Zellen

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Abstrakt.

Glucocorticoide (GCs) werden häufig zur Behandlung chronischer Krankheiten eingesetzt. Eine verlängerte und/oder Überdosierung von GCs hat viele Nebenwirkungen auf die menschliche Gesundheit, einschließlich GC-induzierter Osteoporose (GIOP). Ziel dieser Untersuchung war es, den Einfluss zu beurteilenEchinacosid aus Cistanche(ECH) wirkt auf mit Dexamethason behandelte murine osteoblastische MC3T3-E1-Zellen. Wir haben festgestellt, dass die EM(Echinacosid aus Cistanche) (5, 10, 20, and 40 mg/l) inhibited dexamethasone (1,000 nM)-suppressed cell viability as demonstrated by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. The dose of 10 mg/l was selected for the following experiments because this dose had a better effect than the dose of 5 mg/l, and the doses >10 mg/l hatten eine ähnliche Wirkung wie diese Dosis. EM(Echinacosid aus Cistanche)(10 mg/l) oder Pifithrin- (PFT-) (ein p53-Inhibitor, 20 µM) unterdrückten die Dexamethason-induzierte MC3T3-E1-Apoptose, wie durch Annexin V/Propidiumiodid (PI)-Doppelmarkierungs-Durchflusszytometrie-Analyse veranschaulicht . EM(Echinacosid aus Cistanche)oder PFT-Behandlung verringerte auch die Wirkung von Dexamethason, die Bcl-2-Expression zu inhibieren, sowie die Wirkung von Dexamethason, die Expression von p53 und Bax zu stimulieren. Darüber hinaus kehrte die Lentivirus-vermittelte p53-Überexpression die Wirkungen von ECH um(Echinacosid aus Cistanche)in mit Dexamethason behandelten MC3T3-E1-Zellen, was darauf hindeutet, dass ECH(Echinacosid aus Cistanche)induzierte antiapoptotische Wirkungen in mit Dexamethason behandelten Osteoblasten über einen ap53--abhängigen Weg. Zusammenfassend EM(Echinacosid aus Cistanche)hat eine schützende Wirkung gegen durch Dexamethason induzierte Apoptose von Osteoblastenzellen, was darauf hindeutet, dass ECH(Echinacosid aus Cistanche)könnte das Potenzial für eine klinische Anwendung bei der Behandlung von GIOP haben.

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Einführung

Glukokortikoide(GCs) werden häufig zur Behandlung eines breiten Spektrums chronischer Krankheiten eingesetzt, darunter Entzündungen, Krebs und Autoimmunerkrankungen (1). Eine längere und/oder Überdosierung von GCs hat jedoch viele Nebenwirkungen, wie Bluthochdruck, Hyperglykämie, Glaukom, Osteonekrose und Osteoporose (2-4). Es ist klar, dass die Verwendung von GC den Knochenverlust und das Frakturrisiko erhöht (3-6). GCs können die Apoptose von Osteoblasten induzieren und die Funktion dieser Zellen beeinträchtigen. Beispielsweise kann Dexamethason, ein GC-Hormon, die Expression von p53 in osteoblastischen MC3T3-E1-Zellen hochregulieren und so Zellapoptose verursachen (7,8). Die Apoptose von Osteoblasten führt zu einer verminderten Knochenbildung. Die orale Anwendung von Bisphosphonaten (Alendronat und Risedronat) (9,10) wurde zur Behandlung von GC-induzierter Osteoporose (GIOP) eingeführt. Niedrige Adhärenzraten begrenzen jedoch die Wirksamkeit von oralen Bisphosphonaten. Andere Medikamente haben ebenfalls Einschränkungen, wie etwa eine unbequeme Verabreichung [Zoledronsäure (11)] und hohe Kosten [PTH 1-34 (Teriparatid) (12,13)]. Folglich besteht ein Bedarf an der Entwicklung neuer Behandlungsoptionen für GIOP.

Echinacosid aus Cistanche (ECH)ist ein aus der traditionellen chinesischen Medizin isoliertes PhenylethanoidglykosidKräuterCistanchen(14). EM(Echinacosid aus Cistanche)hat schützende Wirkungen auf das Neuronensystem (15-20), die Leber (21,22) und die Lunge (23), indem es die Zellproliferation fördert und die Entzündungsreaktion, die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und die Zellapoptose hemmt. Obwohl die EM(Echinacosid aus Cistanche)auch die osteoblastische Knochenregeneration fördern kann und in den Rattenmodellen eine außergewöhnliche antiosteoporotische Aktivität aufweist (24,25), gibt es keine existierenden Aufzeichnungen, die die Wirkungen von ECH beschreiben(Echinacosid aus Cistanche)auf GC-induzierte osteoblastische Zellapoptose. Daher untersuchten wir den Einfluss, den ECH(Echinacosid aus Cistanche)wirkt auf Dexamethason-induzierte osteoblastische Zellapoptose und klärte den vorläufigen Mechanismus in MC3T3-E1-Zellen auf.

Materialen und Methoden

Anbau von Zellen. Die Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) stellte die osteoblastischen MC3T3-E1-Zellen der Maus zur Verfügung. Das Zellwachstum fand in essentiellem Minimalmedium (-MEM) (Hyclone; GE Healthcare, Logan, UT, USA) statt, das 10 % fötales Rinderserum (FBS; Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Grand Island, NY, USA) enthielt ) und Penicillin/Streptomycin (Beijing Solar Science and Technology Co., Ltd., Peking, China). Die Wartung der Zellen wurde in einer Umgebung mit 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid bei einer Temperatur von 37 °C durchgeführt.

DasProduktionvonLentivirenp53 überexprimieren. Um das p53-Expressionskonstrukt zu erzeugen, wurde die Region der proteinkodierenden Sequenz (CDS) des murinen p53-Gens synthetisiert und inseriertÖkoRI/BamHI-Restriktionsstellen des lentiviralen Expressionsvektors pLVX-puro (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA) von Genewiz, Inc. (Peking, China). Das Konstrukt wurde durch DNA-Sequenzierung verifiziert. 293T-Zellen (Shanghai GeneChem Co., Ltd., Shanghai, China) wurden mit einer Mischung von Plasmiden transfiziert, einschließlich viraler Verpackungsplasmide und p53-Expressionsplasmid (pLVX-p53) oder Kontrollplasmid (pLVX) über Lipofectamine 2000 (Invitrogen: Thermo Fisher Scientific, Inc., Carlsbad, CA, USA) nach Angaben des Herstellers. Der virale Überstand wurde 48 h nach der Transfektion gesammelt und zur Infektion von MC3T3-E1-Zellen verwendet. Die Auswertung der p53-Expression wurde 48 h nach der viralen Infektion durchgeführt.

QuantitativPolymeraseKetteReaktion(qPCR). Wir verwendeten TRIzol-Reagenz (Invitrogen: Thermo Fisher Scientific, Inc.) zur Trennung von Gesamt-RNA und MC3T3-E1-Zellen und RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers zur reversen Transkription von Gesamt-RNA. Die p53-mRNA-Konzentration wurde mittels qPCR auf dem ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems: Thermo Fisher Scientific, Inc., Foster City, CA, USA) nachgewiesen. Die Primer waren wie folgt: 5'-CCC CTGTCATCTTTTGTCCCT-3' und 5'-AGCTGGCAGAAT AGCTTATTGAG-3' für p53, 5'-CTGCCCAGAACATCA TCC-3' und 5'-CTCAGATGCCTGCTTCAC{{ 18}}' für GAPDH.

Dann bewerteten wir die p53-mRNA-Spiegel über die 2^-ΔΔCT-Methode (26) mit GAPDH als interne Kontrolle.

Western-Blotting. Die Lyse von MC3T3-E1-Zellen fand in Radioimmunpräzipitations-Assay-Puffer mit Protease-Inhibitoren (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) statt, und die Zentrifugation der Lysate wurde 15 Minuten lang bei einer Temperatur von 4 °C und 9.600 xg fortgesetzt damit Niederschlag entfernt werden kann. Anschließend bewerteten wir die Proteinmenge mit dem BCA-Assay-Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Eine gleiche Proteinmenge wurde auf eine 10- oder 15-prozentige SDS-PAGE gegeben und auf eine Nitrozellulosemembran (EMD Millipore, Bradford, MA, USA) übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % Magermilch blockiert und mit primären Antikörpern sondiert. Nach dreimaligem Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurde eine Inkubation der Membranen mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Sekundärantikörper (1:1, 000; Kat.-Nr. A0208; Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China) durchgeführt . Wir führten Western-Blotting-Tests mit einem Kit für verbesserte Chemilumineszenz (ECL) (EMD Millipore) durch. Als interner Standard wurde GAPDH verwendet. Die Quellen der primären Antikörper waren wie folgt: Bax (Sc-493) und Bcl-2 (Sc-492), beide von Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA); p53 (Nr. 2524) und GAPDH (Nr. 5174), beide von Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA).

Experimental Gruppierung. Um die geeignete Dexamethason-Dosis zu bestimmen, wurde die Behandlung von MC3T3-E1-Zellen mit einer Reihe von Dexamethason-Mengen (0, 1, 10, 100 und 1,000 nM; Sigma -Aldrich; Merck KGaA, St. Louis, MO, USA). 48 h nach der Inkubation der Zellen wurden Assays mit dem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) durchgeführt, um die Zellproliferation nachzuweisen.

Um die geeignete Dosis von ECH auszuwählen(Echinacosid aus Cistanche)wurde die Behandlung von MC3T3-E1-Zellen mit 1,000 nM Dexamethason und verschiedenen Dosen von ECH (0, 2,5, 5, 10, 20 und 40 mg/l; Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China). Als Kontrolle dienten unter Normalbedingungen (mock) gewachsene Zellen. Der CCK-8-Assay wurde nach 48 h Kultur durchgeführt.

Für alle anderen Experimente wurden die MC3T3-E1-Zellen in fünf Gruppen aufgeteilt: Gruppe 1 (Schein), Zellen wurden unter normalen Bedingungen kultiviert; Gruppe 2, Zellen wurden mit pLVX-Lentivirus transduziert; Gruppe 3, mit 10 mg/l ECH kultivierte Zellen(Echinacosid aus Cistanche); Gruppe 4, Zellen mit 20 &mgr;M Pifithrin – (PFT – ; Selleck Chemicals, Houston, TX, USA); Gruppe 5, Zellen, transduziert mit pLVX-p53 Lentivirus und behandelt mit 10 mg/l ECH(Echinacosid aus Cistanche). Zellen in den Gruppen 2-5 wurden mit 1,000 nM Dexamethason behandelt. Zellapoptose und Proteinexpression wurden nach 48 h Kultur gemessen.

ZelleProliferationstest.Wir haben MC3T3-E1-Zellen in 96-Well-Platten bei 3 x 10 ausgesät³Zellen/Vertiefung und kultivierte sie bei Normalbedingungen über Nacht. Die Zellen wurden wie angegeben behandelt. Nach 48 h Kultur wurde dann der CCK8-Assay (Signalway Antibody LLC, College Park, MD, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt wurde das Kulturmedium in jeder Vertiefung durch 100 &mgr;l 10-prozentige CCK-8-Lösung im Medium ersetzt. Nach Inkubation der Zellen für eine Dauer von 1 h bei einer Temperatur von 37 °C haben wir die Extinktion bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät bewertet. Die relative Zelllebensfähigkeit (Prozent) mit Verbindungen zu Kontrollvertiefungen wurde berechnet.

ZelleApoptose-Auswertung. Wir verwendeten das Annexin V-FITC-Zellapoptose-Kit (Beyotime Institute of Biotechnology) zur Quantifizierung von Zellen, die einer frühen Apoptose unterzogen werden, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt wurde das Sammeln von behandelten Zellen durch Trypsinisierung durchgeführt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit Annexin-Bindungspuffer resuspendiert. Die Inkubation der Zellen wurde über Annexin V-FITC für eine Dauer von 15 min bei einer Temperatur von 4 °C durchgeführt, gefolgt von einer Inkubation mit Propidiumiodid (PI) für 5 min bei 4 °C. Zellen im unteren rechten Quadranten (Annexin-V-FITC-positiv und PI-negativ) wurden als einer frühen Apoptose unterliegend betrachtet.

StatistischAnalyse. Die Daten sind die Mittelwerte ± Standardabweichung für alle drei unabhängigen Experimente. Der Mehrfachvergleichstest nach Tukey und die Einweg-Varianzanalyse wurden durchgeführt, um die Unterschiede zwischen den Gruppen über die Software GraphPad Prism (Version 6.0; GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA) zu analysieren. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Ergebnisse

Einrichtungvona passende DosisvonDexamethason.Um die geeignete Dexamethason-Dosis zu bestimmen, wurden die MC3T3-E1-Zellen 48 h lang zunehmenden Mengen an Dexamethason (0, 1, 10, 100 und 1,000 nM) ausgesetzt . Wie in Abb. 1 gezeigt, war die relative Zelllebensfähigkeit, die durch den CCK-8-Assay bestimmt wurde, in Zellen erhöht, die mit niedrigen Konzentrationen von Dexamethason (1 und 10 nM) behandelt wurden, und signifikant verringert in Zellen, die hohen Konzentrationen von Dexamethason (100) ausgesetzt waren und 1,000 nM).

Die signifikanteste Reduktion wurde in Zellen mit 1,000 nM Dexamethason beobachtet. Somit wurden 1,000 nM Dexamethason in den nachfolgenden Assays ausgewählt.

Wirkung von ECH(Echinacosid aus Cistanche)auf Dexamethason‑induzierte Zellwachstumshemmung. Anschließend untersuchten wir die Wirkung von ECH(Echinacosid aus Cistanche)auf Dexamethason-induzierte Zellwachstumshemmung. Die Behandlung von MC3T3-E1-Zellen wurde mit 1,000 nM Dexamethason und verschiedenen Dosen von ECH durchgeführt(Echinacosid aus Cistanche)(0, 2,5, 5, 10, 20 und 40 mg/l; Abb. 2). Bei 48 h Nachbehandlung erfolgt die Zugabe von ECH(Echinacosid aus Cistanche)bei Dosen von 5, 10, 20 und 40 mg/l verringerte sich die Dexamethason-induzierte Zellschädigung deutlich. EM(Echinacosid aus Cistanche)bei einer Dosis von 10 mg/l hat eine deutlichere Wirkung als bei einer Dosis von 5 mg/l. Die Zelllebensfähigkeit war ähnlich bei Zellen, die mit 10, 20 und 40 mg/l ECH behandelt wurden(Echinacosid aus Cistanche). Daher 10 mg/l ECH(Echinacosid aus Cistanche)wurde in den folgenden Experimenten verwendet.

Überexpression von p53 durch Konstruktion von Lentivirus. Dexamethason kann p53 hochregulieren und dadurch Osteoblasten-Apoptose induzieren (8). Um die Auswirkungen von ECH zu untersuchen(Echinacosid aus Cistanche) on dexamethasone-induced p53 expression, we constructed a lentivirus encoding p53 (pLVX-p53) and transduced the virus into MC3T3-E1 cells. The expression of p53 was analyzed at 48 h after transduction. Fig. 3 shows that p53 mRNA and protein levels were increased to >2 mal in pLVX-p53--transduzierten Zellen im Vergleich zu Zellen mit Kontrollvirus (pLVX). p53 war an der Wirkung von ECH beteiligt (Echinacosid aus Cistanche) auf Dexamethason-induzierte Apoptose. Die MC3T3-E1-Zellen wurden mit Plavix oder pLVX-p53, 10 mg/l ECH(Echinacosid aus Cistanche), 20 µM PFT- (ein p53-Inhibitor) und 1,000 nM Dexamethason, und dann wurde die Zellapoptose mit dem Annexin V-FITC-Apoptose-Kit gemessen. Wie in 4A gezeigt, induzierte die Behandlung mit Dexamethason bemerkenswert Zellapoptose im Vergleich zu den Zellen, die unter normalen Bedingungen (Schein) kultiviert wurden. EM(Echinacosid aus Cistanche) und die PFT-Behandlung schützten die MC3T3-E1-Zellen signifikant vor Dexamethason-induzierter Apoptose. Darüber hinaus kehrte die p53-Überexpression die Schutzwirkung von ECH um (Echinacosid aus Cistanche).

Es ist bekannt, dass Bcl-2 und Bax als wichtige Apoptoseregulatoren durch p53 reguliert werden (27). Western-Blotting zeigte, dass die Veränderungen der p53- und Bax-Proteinexpression mit den Veränderungen der Zellapoptose übereinstimmten, während sich die Bcl-2-Expression in die entgegengesetzte Richtung veränderte (Fig. 4B und C). Bemerkenswerterweise wurden die Proteinspiegel von p53 durch ECH signifikant unterdrückt(Echinacosid aus Cistanche)und PFT-Behandlung in Zellen, die p53 überexprimieren und mit Dexamethason behandelt wurden (Fig. 4C). Diese Daten legen nahe, dass ECH(Echinacosid aus Cistanche)könnte über die Hemmung der p53-Expression eine schützende Wirkung auf die Dexamethason-induzierte Apoptose ausüben.

Wirkungen von Cistanche Echinacosid

Diskussion

Die Anti-Apoptose-Funktion von ECH(Echinacosid aus Cistanche)wurde im akuten Leberschädigungsmodell beschrieben, das durch D-Galactosamin (D-GalN) und Lipopolysaccharid (LPS) induziert wurde, und in humanen Neuroblastomzellen (SH-SY5Y), die durch Tumornekrosefaktor- oder 1--Methyl{{6 }}PhenylpyridiniumIon (MPP plus ) (17,22,28). Es wurde berichtet, dass eine Behandlung mit Dexamethason die Proliferation hemmen und die Apoptose von MC3T3-E1-Zellen induzieren kann (8,29). In der aktuellen Studie war die relative Zelllebensfähigkeit bei Zellen, die hohen Konzentrationen von Dexamethason (100 und 1, 000 nM) ausgesetzt waren, signifikant reduziert, was mit einer früheren Studie übereinstimmte (8). Eine zusätzliche ECH-Behandlung (5-40 mg/l) hemmte die durch Dexamethason unterdrückte Zelllebensfähigkeit bemerkenswert. Darüber hinaus stimulierte die Dexamethason-Exposition (1,000 nM) die MC3T3-E1-Zellapoptose, die durch die ECH-Behandlung in erheblichem Maße gehemmt wurde. Der Bericht lieferte eine erste Darstellung, wie ECH vor Dexamethason-induzierter Apoptose von Osteoblastenzellen geschützt ist, und deutete an, dass ECH das Potenzial für eine klinische Anwendung bei GIOP haben könnte.

Darüber hinaus haben wir versucht, den vorläufigen Mechanismus der Schutzwirkung von ECH zu untersuchen(Echinacosid aus Cistanche). Dexamethason kann die p53-Transkription verstärken und dadurch die Apoptose von Osteoblasten und den Stillstand des Zellzyklus induzieren (8). p53 wird durch ECH in SH-SY5Y-Zellen herunterreguliert (28). Hier hatte PFT- (ein p53-Inhibitor) ähnliche Schutzwirkungen wie ECH, während p53-Überexpression die Schutzwirkung von ECH umkehrte. Die Veränderungen der p53-Proteinexpression unter verschiedenen Bedingungen stimmten mit den Veränderungen der Zellapoptose überein. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass ECH über die Hemmung der p53-Expression eine schützende Wirkung auf die Dexamethason-induzierte Apoptose von Osteoblastenzellen ausüben könnte. Proteine ​​der Bcl-2-Familie, wie Bcl-2 und Bax, können die Permeabilität der mitochondrialen Membran verändern, Effektor-Caspasen aktivieren und Zellapoptose verursachen (30). Es ist bekannt, dass p53 Bcl-2 und Bax regulieren kann (27). Hier ist die Behandlung mit PFT- oder ECH(Echinacosid aus Cistanche) schwächte die hemmenden Wirkungen von Dexamethason auf die Spiegel des Anti-Apoptose-Proteins Bcl-2 sowie die stimulierenden Wirkungen von Dexamethason auf die Spiegel des Pro-Apoptose-Proteins Bax ab, während eine Überexpression von p53 die Wirkungen von ECH umkehrte. Diese Ergebnisse zeigten weiter die Beteiligung von p53 an der Schutzfunktion von ECH.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die EM(Echinacosid aus Cistanche)hat eine vielversprechende Schutzwirkung auf die durch Dexamethason induzierte Apoptose von Osteoblastenzellen, was darauf hindeutet, dass ECH das Potenzial für eine klinische Anwendung bei der Behandlung von GIOP haben könnte.

Wirkungen von Echinacosid aus Cistanche

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