Cistanche: Echinacosid unterdrückt das Wachstum des Pankreas-Adenokarzinoms durch Induktion der Apoptose über den Mitogen-aktivierten Proteinkinase-Signalweg

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WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG und XINFENG LI

Abstrakt.

Die klinische Anwendung von Naturstoffen aus der traditionellen chinesischen Medizin hat in der Krebschemotherapie an Aufmerksamkeit gewonnen.Echinacosid(ECH), eines der Phenylethanoide, isoliert aus den Stängeln vonCistanche(eine chinesische pflanzliche Medizin) hat gewebeschützende und anti-apoptotische Wirkungen auf das zentrale Nervensystem. Es bleibt jedoch weitgehend schwer fassbar, ob ECH eine tumorsuppressive Aktivität besitzt. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass ECH die Proliferation von Pankreas-Adenokarzinom-Zellen deutlich hemmen kann, indem es die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und die Störung des mitochondrialen Membranpotentials induziert und somit die Apoptose auslöst. Des Weiteren wurde klargestellt, dass ECH(Echinacosid)unterdrückt das Tumorzellwachstum durch Modulation der MACK-Aktivität. Zusammenfassend zeigt diese Studie eine neuartige Funktion von ECH(Echinacosid) bei der Verhinderung der Krebsentstehung und impliziert, dass die Verwendung von ECH eine potenzielle chemotherapeutische Strategie für Krebs sein könnte.

Einleitung

Der p53-Tumorsuppressorweg über die Induktion des Tumorsuppressors ARF mildert den onkogenen E3-Ligase-Maus-Double-Minute-(MDM)2-vermittelten p53-Abbau (3). Dies ist ein autoregulierter, selbstschützender Mechanismus, der die maligne Transformation von Zellen verhindert. Insbesondere kann p53 die Myc-Aktivität unterdrücken, indem es beispielsweise miR-145 transkriptionell aktiviert, das aufMycmRNA für Translations-Silencing (4,5) und bildet damit eine negative Rückkopplungsregelungsschleife.

Die einfachste und effektivste Strategie zur Behandlung von Krebs besteht darin, die Krebszellen abzutöten. Die häufig verwendeten Krebsmedikamente wie Cisplatin (6), Actinomycin D (7) und Adriamycin (8) hemmen nachweislich das Tumorwachstum, indem sie die Apoptose fördern. In jüngster Zeit haben sich immer mehr Beweise dafür gezeigt, dass eine Reihe von Naturstoffen und Derivaten aus Pflanzen, insbesondere aus Heilpflanzen, die in der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) verwendet werden, eine tumorsuppressive Funktion aufweisen, indem sie die Apoptose von Krebszellen induzieren und das Potenzial für eine klinische Anwendung in der Krebstherapie haben (9). Zum Beispiel wird das natürliche Anthrachinon-Emodin aus zahlreichen Arten von Krebszellen isoliert (10,11). Camptothecin, abgeleitet vom chinesischen "glücklichen Baum",Camptotheca Akuminieren, ist ein wertvolles Naturprodukt, das die Ligatur der DNA nach Topo-I-vermittelten Strangbrüchen hemmt (12). In einer weiteren retrospektiven populationsbasierten Kohortenstudie mit insgesamt 729 Patientinnen mit fortgeschrittenem Brustkrebs wurde vermutet, dass die TCM-Therapie zur Krebsbehandlung beitragen kann. Von dieser Kohorte waren 115 Patienten TCM-Anwender, während 614 Patienten TCM nicht verwendeten. Die multivariate Analyse zeigte, dass die Anwendung von TCM im Vergleich zu Nicht-Anwendern mit einem signifikant verringerten Risiko für eine Gesamtmortalität verbunden war (13). Alle oben genannten Ergebnisse zeigten, dass die TCM eine wichtige Komplementär- und Alternativmedizin ist, die bei der Behandlung von Krebs eingesetzt werden kann.

Mäuse mit akuter Lungenverletzung (16,17). Auch ECH(Echinacosid)Es wurde gezeigt, dass sie schützende Wirkungen auf Nervengewebe haben und Verhaltensstörungen in murinen Modellen der Parkinson-Krankheit verbessern (18). Insbesondere wurde festgestellt, dass ECH die Zellproliferation fördert und die Apoptose in den intestinalen epithelialen MODE-K-Zellen der Maus hemmt (19). Bisher wurde der möglichen Rolle von ECH bei der Krebsprävention jedoch weniger Aufmerksamkeit geschenkt.

In dieser Studie wurde untersucht, ob die ECH-Behandlung das Wachstum und die Proliferation von Tumorzellen beeinflusst und ob ECH(Echinacosid)induziert Apoptose, erhöht die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und reduziert das mitochondriale Membranpotential (MMP) und unterdrückt folglich das Tumorzellwachstum. Darüber hinaus zielte die vorliegende Studie darauf ab, die molekularen Mechanismen zu identifizieren, die für die ECH-vermittelte Zellwachstumshemmung verantwortlich sind.

Materialien und Methodik

Zelle Linie Reagenz und Antikörper.SW1990 Pankreas-Adenokarzinom-Zellen (ATCC, Manassas, VA, USA) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium kultiviert, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 50 U/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin bei 37°C in einer 5% CO2-befeuchteten Atmosphäre. ECH(Echinacosid)wurde von Jrdun Biotechnology Corp. (Shanghai, China) gekauft. Antikörper gegen AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 und GAPDH wurden von Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) gekauft; Anti-Bax und Anti-Bcl-2 wurden von Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) gekauft; und Anti-Caspase-3 wurde von Abcam (Shanghai, China) gekauft.

Zelle LebensfähigkeitProbe. Um die Rate des Tumorzellwachstums zu beurteilen, ist Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA) wurde nach Herstellerangaben verwendet. Zellsuspensionen wurden bei 5.000 Zellen pro Well mit ECH-Behandlung für 0, 12, 24, 48 oder 72 h in 96-Well-Kulturplatten ausgesät. Die Zellwachstumshemmung wurde durch Zugabe von WST-8-Reagenz aus dem CCK-8-Kit in einer Endkonzentration von 10% zu jeder Vertiefung bestimmt, und die Absorption der Proben wurde bei 450 nm mit einem Mikroplattenleser (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA).

Hoechst | 33342 Färbung.Zellen (60% Konfluenz) wurden mit Hoechst 33342 (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China) in einer Endkonzentration von 1 behandelt.µg/ml, 15 min im 37°C Inkubator inkubiert, zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, 30 min bei Raumtemperatur in 4% Paraformaldehyd fixiert und auf Objektträger montiert. Die morphologischen Veränderungen der Zellkerne wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet (Olympus BX51, Melville, NY, USA). Die normalen Kerne waren rund und hellblau gefärbt, während die apoptotischen Kerne geschrumpft und hellblau gefärbt waren.

Fluoreszenz-aktiviert Zelle Sortieren (FACS) Analysen.Für die Beurteilung der Apoptose wurde das Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, Shanghai, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Kurz gesagt, 5x104 Zellen wurden mit eiskaltem PBS gewaschen, in 0,1 ml Bindungspuffer (Beyotime Institute of Biotechnology) resuspendiert und mit 10 ml FITC-konjugiertem Annexin V (10 mg/ml) und 10 ml Propidiumiodid (PI) (50 mg/ml) angefärbt. Nach der Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln und der Zugabe von 400 ml Bindungspuffer wurden die Zellen mit einem Durchflusszytometer (C6; BD Biosciences, Shanghai, China).

Messung von reaktiv Sauerstoff Spezies (ROS).Um die Produktion von ROS zu bewerten, wurde das Reactive Oxygen Species Assay-Kit (Vigorous Biotechnology, Peking, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Kurz gesagt, Zellen (80% Konfluenz) wurden geerntet und mit PBS gewaschen, bevor sie mit der Dihydroethidium (DHE) -Lösung (Beyotime Institute of Biotechnology) gefärbt wurden. Die Zellen wurden dann durch durchflusszytometrische Analysen analysiert.

Messung von mitochondrial Membran potenziell (MMP).

Ein Tetramethylrhodamin-Methylester (TMRM) Assay-Kit (ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, USA) wurde verwendet, um die Veränderungen in MMP zu erkennen. Kurz gesagt, Zellen (80% Konfluenz) wurden geerntet, mit PBS gewaschen und mit TMRM für 15-20 min in einem 37 ° C Inkubator gefärbt. Die Zellen wurden dann einmal mit PBS gewaschen und durchflusszytometrischen Analysen unterzogen.

ImmunoblottierungAnalysen. Die Zellen (80% Konfluenz) wurden in RIPA-Puffer (Jrdun Biotechnology), bestehend aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, geerntet und lysiert; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1% Natriumdesoxycholsäure und 0,1% SDS und frisch zugesetzte Proteasom-Inhibitoren. Für die Immunoblotting-Analyse wurden die gleichen Mengen an klarzelligem Lysat verwendet, wie zuvor beschrieben (20).

Statistisch Analyse.Quantitative Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Statistische Unterschiede wurden durch den ungepaarten Student's t-Test mit der statistischen SPSS 15.0-Software ausgewertet. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Befund

ECH (Echinacosid)Unterdrückt Tumor ZelleWachstum. Obwohl berichtet wurde, dass ECH(Echinacosid)durch die Hemmung von Apoptose und Entzündungssignalen in somatischen Zellen wie neuronalen und intestinalen Epithelzellen eine schützende Rolle spielt (16-19), bleibt es schwer fassbar, ob ECH das Wachstum und die Proliferation von Krebszellen steuert. Um dies zu testen, wurde ein Zellüberlebensassay durchgeführt, indem SW1990-Zellen, abgeleitet von einem Pankreas-Adenokarzinom Grad II, mit titrierten Dosen von ECH behandelt wurden, wie in Abb. 1 gezeigt. Insbesondere wurde gezeigt, dass ECH die Tumorzellproliferation während einer 5-tägigen Kulturperiode dosisabhängig signifikant verzögert (Abb. 1).ECH AuslöserApoptose. Da der Verlust der Apoptose einer der wichtigsten ursächlichen Mechanismen ist, die der unkontrollierten Proliferation von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen zugrunde liegen (21), führte die vorliegende Studie eine Reihe von Experimenten durch, um festzustellen, ob ECH Apoptose auslöst. Erstens konnte durch die Färbung der Kerne von Tumorzellen mit Hoechst 33342 gezeigt werden, dass ECH dosisabhängig zu Apoptose führt (Abb. 2A). Zusätzlich wurden FACS-Analysen unter Verwendung von Annexin-V/PI-Färbungen durchgeführt, um die apoptotische Wirkung von ty ECH weiter zu bestätigen (Abb. 2B). Der durchschnittliche Prozentsatz der apoptotischen Zellen betrug unter normalen Kulturbedingungen 1,1%, während dieser Prozentsatz signifikant auf 10,6, 21,4 und 51,3% als Reaktion auf eine dosisabhängige EKH-Behandlung anstieg (Abb. 2C). Diese Ergebnisse, zusammen mit dem in Abb. 1 gezeigten Zelllebensfähigkeitsassay, zeigen, dass die ECH-Behandlung die Proliferation von Tumorzellen unterdrückt, indem sie Apoptose auslöst.

Ethidium zu erzeugen, das mit DNA interkaliert, wurde in dieser Studie verwendet, um die ROS-Produktion zu bewerten. Es wurde festgestellt, dass ECH, wie andere Krebsmedikamente, auch die ROS-Produktion dosisabhängig stimuliert, wie die erhöhte Fluoreszenzintensität bei ECH-Behandlung zeigt (Abb. 3).

ECH (Echinacosid)Reduziert MMP.Es wurde gezeigt, dass die mitochondriale Dysfunktion mit der Induktion der Apoptose in Verbindung gebracht wird. Es wurde gezeigt, dass die Öffnung der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore die Depolarisation des Transmembranpotentials und die Freisetzung pro-apoptotischer Faktoren induziert (23). Daher wurde getestet, ob ECH den Verlust von MMP in Tumorzellen durch die Durchführung eines TMRM-Assays induzieren könnte, was ein etablierter Ansatz ist, da die Intensität der TMRM-Fluoreszenz proportional zum Membranpotential ist. Es konnte gezeigt werden, dass die ECH-Behandlung MMP dosisabhängig signifikant reduziert (Abb. 4).ECH Steuerung Tumor Zelle Wachstum via Mitogen-aktiviertes ProteinDie molekularen Grundlagen des ECH-vermittelten Tumorzelltods, die Aktivität mehrerer lebenswichtiger Signalwege, wie MAPK und AKT (24,25), die das Überleben und den Tod von Zellen steuern, wurde untersucht. Die MAPKs sind evolutionär konservierte, Prolin-gerichtete Ser/Thr-Proteinkinasen, einschließlich extrazellulärer signalregulierter Kinasen (ERKs), c-Jun NH2-terminaler Kinase (JNKs) und der p38-Familienmitglieder, die durch dreistufige Kinase-Signalkaskaden aktiviert werden (26,27). In dieser Studie wurde die Expression von MAPKs und AKT sowie ihre aktivierten phosphorylierten Formen untersucht und es wurde gezeigt, dass ECH die JNK- und ERK1/2-Aktivität deutlich unterdrückt, aber die p38-Aktivität verstärkt (Abb. 5). Insbesondere wurde gezeigt, dass die AKT-Aktivität, die auch für die Zellproliferation von entscheidender Bedeutung ist, durch die ECH-Behandlung nicht beeinflusst wird (Abb. 5). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die ECH-Behandlung die Expression von Bax und Caspase-3 erhöht und gleichzeitig die Bcl-2-Expression reduziert (Abb. 5), was mit Abb. 2 übereinstimmt. Die Ergebnisse deuten also darauf hin, dass ECH die Tumorzellapoptose über den MAPK-Signalweg auslöst.

Diskussion

Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Studie, die zeigt, dass ECH eine tumorsuppressive Funktion hat, indem es Apoptose auslöst (Abb. 2), die ROS-Produktion fördert (Abb. 3) und eine desogenitale Membranpotentialdepolarisation induziert (Abb. 4), was folglich zu einer Hemmung des Tumorzellwachstums führt (Abb. 1). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die molekularen Grundlagen des ECH-vermittelten Tumorzelltods durch die Regulierung der MACK-Signalwege eintreten (Abb. 5). Diese Ergebnisse zeigen eine neuartige Funktion von ECH bei der Prävention von Tumorgenese und deuten somit darauf hin, dass es sich um einen Wirkstoffkandidaten für die Krebstherapie handeln könnte.

Die meisten Krebsmedikamente können Tumorzellapoptose, Seneszenz und / oder Zellzyklusstillstand induzieren, was zu einer Hemmung des Wachstums und der Proliferation von Tumorzellen führt. Der Zellzyklusstillstand ist eine zelluläre Reaktion auf milde Stresssignale, die es Zellen ermöglichen, beschädigte DNA zu reparieren, bevor sie eine replizierende DNA-Synthese oder Mitose einleiten, während Apoptose und Seneszenz (permanenter Zellzyklusstillstand) als Reaktion auf Stresssignale auftreten, die irreparable oder bösartige Zellen eliminieren (28,29). Daher wurde in dieser Studie nur die apoptotische Wirkung von ECH auf Tumorzellen untersucht, da die Abtötung von Krebszellen ein wichtiges Kriterium für die Beurteilung der Wirksamkeit eines Krebsmittels ist. Insbesondere wurde gezeigt, dass ECH die Expression vonBax(Abb. 5), ein pro-apoptotisches Gen, transkriptionell aktiviert durch den Tumorsuppressor p53 (30). Es lohnt sich also zu testen, ob ECH den p53-Signalweg aktivieren kann. Wenn ja, kann ECH auch in der Lage sein, p53-abhängigen Zellzyklus-Stillstand, Seneszenz, Apoptose oder Autophagie hervorzurufen. In dieser Studie wurde die tumorsuppressive Funktion von ECH in der SW1990-Pankreas-Adenokarzinom-Zelllinie aufgeklärt. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, die mehr Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zelllinien beobachten. Es wurde gezeigt, dass Mutationen im onkogenen Protein RAS und im Tumorsuppressor p53 mit der Entstehung von Bauchspeicheldrüsenkrebs assoziiert sind (31); Die SW1990-Zelllinie beherbergt jedoch laut der IARC p53-Datenbank (http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx) keine p53-Mutation. Daher ist es wichtig zu untersuchen, ob ECH das Wachstum und die Proliferation anderer Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zelllinien mit unterschiedlichen p53-Mutationen beeinflussen kann. Darüber hinaus wäre es interessant zu bestimmen, ob ECH in der Lage ist, Apoptose zu fördern und das Wachstum anderer Tumorarten zu hemmen.

ROS-Erhöhung und MMP-Reduktion, die durch die EKH-Behandlung verursacht wurden, haben sich bei der Apoptose-Induktion als wesentlich erwiesen (22). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass ROS die Oxidation der mitochondrialen Poren induzieren kann, was zur Freisetzung von Cytochrom beiträgt.c, ein Zwischenprodukt der Apoptose, aufgrund einer Störung des MMP (22). Somit bleibt zu klären, ob ECH MMP indirekt durch die Induktion von ROS stört. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass ROS-ausgelöster oxidativer Stress auch an der Modulation einer Vielzahl von Signalen zur Kontrolle des Zellwachstums beteiligt ist, darunter p53, NF-κB, HIFs und PI3K (32). Es bleibt abzuwarten, ob und wenn ja, wie ECH diese wichtigen Signalwege reguliert. Insbesondere oxidativer Stress verursacht verschiedene neurodegenerative Erkrankungen aufgrund des hohen Sauerstoffverbrauchs, des schwachen antioxidativen Systems und der terminalen Differenzierungsmerkmale des zentralen Nervensystems (33). Mehrere Studien haben jedoch gezeigt, dass ECH schützende und anti-apoptotische Wirkungen auf das Nervengewebe hat. In dieser Hinsicht ist es vernünftig anzunehmen, dass ECH die ROS-Produktion in den terminal-differenzierten neuronalen Zellen reduzieren könnte. Daher bleibt auch zu klären, ob die Regulierung der ROS-Produktion durch ECH vom Zelldifferenzierungsstatus abhängig ist. Daher zeigen die vorliegenden Ergebnisse zusammen mit anderen Studien, dass ECH, die weit verbreitete TCM, eine wichtige chemotherapeutische Strategie nicht nur für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, sondern auch von malignen Karzinomen sein kann.

In letzter Zeit hat der Einsatz von TCM in der Krebstherapie zunehmend mehr Aufmerksamkeit erregt. Das Potenzial von Naturprodukten aus Heilpflanzen, die in der TCM verwendet werden, wurde von der wissenschaftlichen Gemeinschaft auch in der westlichen Welt erkannt (9). Es sind Anstrengungen erforderlich, um die zugrunde liegenden Wirkmechanismen dieser Naturstoffe aufzuklären, die schließlich zur Entwicklung effizienter und sicherer Medikamente für die Krebstherapie führen können.

Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie die tumorhemmende Funktion von ECH und arbeitet auch die molekularen Grundlagen der ECH-vermittelten Tumorsuppression aus, was auf die mögliche klinische Anwendung von ECH in der Krebstherapie hindeutet.

Bestätigungen

Diese Studie wurde vom Key Program of Scientific Research der FMU (Förderkennzeichen 09ZD014) finanziert und unterstützt. Die Autoren danken Biomedworld (Shanghai, China) für die Hilfe bei der Bearbeitung des Manuskripts.

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