TEIL Ⅰ: Wirkung von Cistanche-Tubulosa-Extrakten auf die männliche Fortpflanzungsfunktion bei Streptozotocin-Nicotinamid-induzierten diabetischen Ratten

Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com

Zwe-Ling Kong® Athira Johnson® Fan-Chi Ko, Jia-Ling He und Shu-Chun Cheng

Abstrakt:Diabetes ist eine chronische Erkrankung, die durch Hyperglykämie aufgrund verringerter Insulinspiegel oder der Unfähigkeit des Gewebes, es effektiv zu nutzen, gekennzeichnet ist. Unfruchtbarkeit ist als Hauptfolge von Diabetes bekannt und beeinträchtigt das männliche Fortpflanzungssystem, indem sie eine Beeinträchtigung der Spermien und eine Funktionsstörung der Keimdrüsen verursacht.Cistanche tubulosaist eine parasitäre Pflanze, die das Gedächtnis, die Immunität und die sexuellen Fähigkeiten verbessern, Impotenz reduzieren und Verstopfung minimieren kann. Diese Studie konzentrierte sich auf die Untersuchung der entzündungshemmenden und schützenden Wirkung von Echinacosid (ECH).Cistanche tubulosa-Extrakt(CTE) auf das männliche Fortpflanzungssystem diabetischer Ratten. Die antioxidativen, entzündungshemmenden und schützenden Wirkungen von CTE wurden sowohl durch In-vitro- als auch In-vivo-Methoden bewertet. Die In-vitro-Ergebnisse zeigen, dass ECH die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) hemmte und die Proteinexpression von StAR, CYP11A1, CYP17A1 und HSD17p3 verbesserte. Die In-vivo-Analyse wurde mit drei Dosen Echinacosid (ECH) (80, 160 und 320 mg/kg) in CTE durchgeführt. Insgesamt wurden 0,571 mg/kg Rosiglitazon (RSG) als Positivkontrolle verabreicht. Diabetes wurde durch Streptozotocin (STZ) (65 mg/kg) und Nicotinamid (230 mg/kg) in Kombination mit einer fettreichen Ernährung (45 Prozent) induziert. Die In-vivo-Studien bestätigten, dass das ECH den Blutzuckerspiegel, die Insulinresistenz, die Leptinresistenz und die Lipidperoxidation verbesserte. Es kann die Expression von Kisspeptin 1 (KiSS1), G-Protein-gekoppeltem Rezeptor GPR 54, Suppressor of Cytokine Signaling 3 (SOCS-3) und Sirtuin 1 (SIRT1) Boten-Ribonukleinsäure (mRNA) im Hypothalamus wiederherstellen und die Sexualität wiederherstellen Hormonspiegel. Somit bestätigte diese Studie die antioxidativen, entzündungshemmenden und steroidogenese Wirkung von CTE.

Schlüsselwörter:Diabetes; Unfruchtbarkeit;Cistanche tubulosa-Extrakt (CTE); Echinacosid (ECH); entzündungshemmende Aktivität; antioxidative Aktivität; Effekte der Steroidogenese

Behandlung von Diabetes:Cistanche tubulosa-Extrakt(CTE)

1. Einleitung

Diabetes mellitus (DM) ist ein Zustand, bei dem aufgrund der Unfähigkeit der Bauchspeicheldrüse, genügend Insulin zu produzieren, oder der Unfähigkeit des Körpers, es effektiv zu nutzen, ein erhöhter Glukosespiegel im Blut auftritt. Laut WHO stieg die Zahl der Menschen mit Diabetes von 108 Millionen im Jahr 1980 auf 422 Millionen im Jahr 2014 [1]. Es gibt vier Hauptkategorien: Prädiabetes (ein Stadium vor Diabetes), Typ 1 (bei dem die Bauchspeicheldrüse kein Insulin produziert), Typ 2 (der Körper verwendet kein Insulin) und Schwangerschaftsdiabetes (der während der Schwangerschaft auftritt). Oxidativer Stress tritt aufgrund des Ungleichgewichts zwischen der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Antioxidantien auf [2] und führt schließlich zum diabetischen Zustand. Zu den Komplikationen von Diabetes gehören Nierenversagen, Nervenschäden, Erblindung, Schlaganfall, Herzinfarkt, Tod des Fötus und Unfruchtbarkeit. [1]. Studien zeigen, dass Spermienkerne, Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Mitochondrien bei männlichen Diabetikern signifikant geschädigt wurden [3]. Oxidativer Stress während des Spermientransports verändert den Prozess des männlichen Fortpflanzungssystems [4,5].

Der Prozess der Spermatogenese wird durch die Achse Hypothalamus-Hypophyse-Gonaden (HPG) gesteuert. Das vom Hypothalamus produzierte Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) stimuliert die Produktion des luteinisierenden Hormons (LH) und des follikelstimulierenden Hormons (FSH). Leydig-Zellen befinden sich neben dem Hodenkanälchen und produzieren Testosteron unter der Kontrolle von LH. FSH löst die Produktion von Antigen-bindendem Protein (ABP) aus, das hilft, das männliche Hormon auszuscheiden. So entstehen Unfruchtbarkeit und andere Probleme hauptsächlich aufgrund der Störungen, die in der HPG-Achse auftreten. Die Verabreichung der Kombination von Streptozotocin-Nicotinamid induziert Diabetes bei Versuchsratten. Streptozotocin ist eine chemische Verbindung, die für insulinproduzierende P-Zellen in der Bauchspeicheldrüse toxisch ist, und Nicotinamid ist ein wasserlösliches Vitamin, das die P-Zellen vor einer vollständigen Schädigung schützt [6].

Cistanche tubulosa ist eine Wüstenpflanzenart, die auch als "Rou Cong-Rong" bekannt ist [7]. Es ist eine nicht chlorophyllartige parasitäre Pflanze, die hauptsächlich an der Wurzel des Calotropis-Procera-Baums wächst und in den Trockengebieten von Gansu, Qinghai, Xinjiang, der Mongolei, dem Iran und Indien weit verbreitet ist. Der gebräuchliche Name von Cistanche tubulosa ist "Wüstenhyazinthe". Es ist in der traditionellen chinesischen Medizin weithin anerkannt und hat den Namen "Ginseng der Wüste" erhalten. Es wird im medizinischen Bereich häufig zur Behandlung von krankhaftem Leukorrhoe, starker Metrorrhagie, chronischen Nierenerkrankungen, Verstopfung, Impotenz und Unfruchtbarkeit verwendet. Chemische Bestandteile vonCistanche tubulosabestehen aus nichtflüchtigen Phenylethanoidglykosiden (PHGs), Iridoiden, Lignanen, ätherischen Ölen, Alditolen, Oligosacchariden und Polysacchariden [8]. Studien zeigen, dass Echinacosid aus diesem Kraut den geschädigten Fibroblasten schützt, indem es den ROS-Spiegel reguliert [9]. Diese Verbindung erzeugt antioxidative, vasorelaxierende und entzündungshemmende Aktivitäten zusammen mit Neuroprotektion und Osteoporose-Prävention [10,11].

Diese Studie hatte zum Ziel, die zu untersuchenWirkung von Cistanche tubulosa-Extraktmit ECH über die reproduktive Dysfunktion der Streptozotocin-Nicotinamid-induzierten diabetischen Ratte.

Cistanche tubulosa

2. Materialien und Methoden

2.1.Materialien

ECH und CTE wurden von Sinopharm Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan) erworben. Advanced Glycation Endproducts (AGEs) wurden von Biovision (San Francisco, CA, USA) bezogen. LC-540- und TM3-Zelllinien wurden vom Food Industry Research and Development Institute (Hsinchu, Taiwan) erworben. Fünf Wochen alte männliche Sprague-Dawley (SD)-Ratten wurden vom National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) gekauft. Feed Lab Diet® wurde von PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan) gekauft. 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) wurde von Sigma (St. Louis, MO, USA) erhalten. Methanol und 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) wurden ebenfalls von Sigma gekauft. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium/F12 und Trypsin-EDTA wurden von GIBCO (New York, NY, USA) bezogen. 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT), Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA), Dimethylsulfoxid (DMSO) und Nitroblautetrazolium (NBT) wurden von Sigma erworben. Glucose-Enzymkits wurden von Kyokutoseiyaku, Tokio, Japan, erhalten. Insulin-ELISA-Kits wurden von Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Schweden) erworben. Das T-PER-Gewebeprotein-Extraktionsreagenz wurde von Thermo Scientific (Chicago, IL, USA) erworben. Polyklonale Anti-Mensch/Maus/Ratte-Nuklearfaktor-kappa B NF-kB-Antikörper wurden von Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA bezogen. Polyklonale Anti-Maus/Ratte-Rezeptor für fortgeschrittene Glykationsendprodukte (RAGE), polyklonale Anti-Mensch/Maus/Ratte-StAR-Antikörper und monoklonale Anti-Mensch/Maus/Ratte-Cytochrom-P450 17A1-Antikörper wurden von Gene Tex erworben (Irvine, Kalifornien, USA). Polyklonale Anti-Mensch/Maus/Ratte-CYP11A1-Antikörper wurden von Cell Signaling Technology (Beverly, PA, USA) erhalten. Das Easy-Blue-Reagenz wurde von Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA) bezogen. Agarose und DNA-Marker 100 bp wurden von Promega, Corporation (Madison, WI, USA) erhalten. RNeasy Lipid Tissue Mini Kit wurde von QIAGEN, Hilden, Deutschland bezogen.

2.2.Methoden

2.2.1. In-vitro-Analyse

LC{0}}- und TM3-Zellkultur: Die LC-540-Zelllinien wurden bei 37 °C in Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)-Medium, ergänzt mit Natriumbicarbonat (1,5 g/L), L -Glutamin (2 mM), nicht essentielle Aminosäuren (0,1 mM), Natriumpyruvat (1,0 mM) und fötales Rinderserum (FBS) (10 Prozent) in einem 5 Prozent CO2-Inkubator (CO2-Inkubator, Napco 5410, Taiwan). Die TM3-Zelllinie wurde in Dulbecco/s modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit Glucose (4,5 g/l), Natriumpyruvat (0,5 mM), L-Glutamin (2,5 mM), Natriumbicarbonat (1,2 g/l), 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES, 15 mM) und fötales Kälberserum (FCS, 10 %) oder Pferdeserum (5 %) bei 37 °C in einer 5 Prozent CO2 Inkubator.

Bestimmung der Zellviabilität von Echinacosid (ECH): 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Reagenz war für den Zellviabilitätsassay verwendet. Die Zellkonzentration wurde auf 2 × 10 5 Zellen/ml in einer 96--Well-Platte eingestellt. Dann wurden 20 &mgr;l ECH (verdünnt in 2 % Medium) zugegeben und für 24 h bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO 2 inkubiert. Später wurden 100 &mgr;l MTT-Reagenz zugegeben und für 4 Stunden 37°C unter dunklen Bedingungen inkubiert. Die Extinktion wurde bei 570 nm gemessen (ELISA-Lesegerät, Dynatech MR5000, Kloten, Schweiz).

Unruhiges CeH viabiHiy (Prozent)=[(AProbe bei 570 nm – Blind bei 570 nm)]/[(AKontrolle bei 570 – Blank bei 570)] x 100.

Nitroblue Tetrazolium (NBT)-Reduktionsassay und 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)-Assay: Die Anzahl der Zellen wurde auf 1 x 1{{10}}6 Zellen/ml eingestellt . Dann wurden 5 0 mg/ml ECH, Resveratrol (RES) und Endprodukte der fortgeschrittenen Glykation (AGEs) (Kontrolle) zugegeben und 18 Stunden bei 37 °C co-kultiviert. Dann wurden 0,3 ml NBT-Lösung (0,1 mg/ml NBT, 5 % FBS und 3 % Dimethylsulfoxid (DMSO), gelöst in 10 ml DMEM) zugegeben und bei 37 °C in 5 % CO2 für 1 h inkubiert. Nach Zentrifugation (bei 800 xg für 3 min) wurde der Überstand entfernt und 200 &mgr;l DMSO wurden zugegeben und 5 min in einem Ultraschalloszillator (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwan) geschüttelt. Die Extinktion wurde bei 630 nm gemessen. Für den DPPH-Radikaltest wurde Trolox (in 95 Prozent Alkohol) als Standard genommen. Dann wurden 75 &mgr;l 0,5 mM DPPH-Lösung mit 25 &mgr;l Proben gemischt und bei Raumtemperatur an einem dunklen Ort für 30 min reagieren gelassen. Die Mischung wurde geschüttelt und die Extinktion bei 517 nm gemessen.

Analyse des Gehalts an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS): Die Zellzahl wurde auf 2 x 105 Zellen/ml in einer 12-Well-Platte mit 2 % FBS eingestellt. Dann wurden 50 &mgr;l/ml ECH, RES und AGEs zu der Platte hinzugefügt und bei 37°C für 24 h inkubiert. Nach 24 h wurde 2Z,7Z-Dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) zugegeben und 30 min bei 37°C inkubiert. Nach Zentrifugation (400 x g, 5 min) wurde der Überstand entfernt und die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Nachdem die Zellen in 1 ml PBS suspendiert worden waren, wurden die ROS-Spiegel unter Verwendung eines Durchflusszytometers (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, USA) bestimmt.

Identifizierung und quantitative Analyse von Protein: Proteine ​​wurden unter Verwendung von Proteinextraktionsreagenz (T-PER) extrahiert. Die Zelldichte wurde auf 2 × 10 5 Zellen/ml in einer 12--Well-Platte eingestellt und 50 &mgr;l/ml ECH, RES und ein Rezeptor für den Advanced Glycation Endproduct (RAGE)-Antagonisten und AGEs wurden hinzugefügt und bei 37 OC in einem Inkubator mit 5 % CO2 für 24 h inkubiert. Danach wurden 400 &mgr;l T-PER zugegeben, die Zellen abgekratzt und bei 125,000xg für 20 min (4°C) zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und zur weiteren Analyse bei -80 OC (-80 OC Freezer, Nuaire, Plymouth, MN, USA) gelagert. Bicinchoninsäure (BCA)-Kit wurde zur Proteinquantifizierung verwendet. Dann wurden 10 &mgr;l Standardzelllösung und 200 &mgr;l BCA-Reagenz zu 8--Well-Platten gegeben und bei 37 ° C in einem 5-prozentigen CO 2 -Inkubator für 30 Minuten inkubiert. Die Extinktion wurde bei 562 nm gemessen. Die Proteinidentifikationsanalyse wurde durch Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE)-Elektrophorese durchgeführt. Proben wurden durch Zugabe von Proteinlysat zu Proteinladepuffer hergestellt und eine Western-Blot-Analyse wurde durchgeführt, um die spezifischen Proteine ​​nachzuweisen.

2.2.2.In-vivo-Analyse

Design des Tiermodells: Sechzig {{0}} Wochen alte männliche Sprague-Dawley (SD)-Ratten wurden vom National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) gekauft. Jede Ratte wurde einzeln in desinfizierenden Edelstahlkäfigen bei kontrollierter Temperatur (23°C 1 Grad) und Feuchtigkeit (40-60 Prozent) mit einem 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkel-Zyklus gehalten. Nahrung und Wasser wurden ad libitum zur Verfügung gestellt. Jede Ratte wurde in der ersten Woche domestiziert und erhielt Labornagetierdiät 5001 als Hauptdiät. Alle Verfahren folgten dem Standard des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Approval No. 101026) der National Taiwan Ocean University, Taiwan. Nach der Domestizierung wurden die Ratten in zwei Gruppen eingeteilt: die Kontrollgruppe (Con), die mit Labordiät 5001 gefüttert wurde, und die Diabetikergruppe, die während des gesamten Experiments mit einer fettreichen Diät (HFD, 40 Prozent) gefüttert wurde. Nachdem sie 4 Wochen lang mit dem HFD gefüttert worden waren, wurde den Ratten der Diabetikergruppe Streptozotocin (65 mg/kg) (STZ) injiziert, um Diabetes mellitus (DM) zu induzieren. Innerhalb von 15 Minuten nach der Injektion von STZ wurde Nicotinamid (230 mg/kg Körpergewicht) injiziert. Eine Woche nach der Injektion wurde ein oraler Glukosetoleranztest (OGTT) durchgeführt, um die erfolgreiche Induktion von diabetischem Mellitus (DM) zu bestimmen. Danach wurden die Tiere in sechs Gruppen eingeteilt: die Kontrolle (gefüttert mit Labordiät 5001); DM-Gruppe (DM plus 45 Prozent HFD); DMR-Gruppe (DM plus Rosiglitazon: 0,571 mg/kg KG) plus 45 Prozent HFD; DME1-Gruppe (DM plus CTE: 80 mg/kg KG) plus 45 Prozent HFD; DME2-Gruppe (DM plus CTE: 160 mg/kg KG) plus 45 Prozent HFD; und DME4-Gruppe (DM plus CTE: 320 mg/kg KG) plus 45 Prozent HFD. Rosiglitazon (RSG) wurde als Positivkontrolle genommen. Drei CTE-Dosen (80, 160 und 320 mg/kg) wurden gemäß den Empfehlungen der taiwanesischen Food and Drug Administration (TFDA) Health Food Functional Evaluation Guidelines verwendet. Die Behandlungen wurden bis zum Ende des Experiments durchgeführt. Alle Versuchsratten wurden nach 6 Wochen getötet. Das von den Ratten gesammelte Blut wurde bei 3000 U/min für 15 min bei 4 Grad zentrifugiert.

Mian wirksame Inhaltsstoffe von Cistanche Tubulosa

Der Überstand wurde für die folgende Analyse untersucht

Gesamtglukose-, Triglycerid- und Cholesterinbestimmung: Die Glukosebestimmung wurde mit enzymatischen Glukosekits durchgeführt. Dann wurden 20 Blutplasmaproben zu den Reagenzien gegeben und 5 Minuten bei 37 Grad gehalten. Die Gesamttriglyceride und die Gesamtcholesterinkonzentration wurden unter Verwendung von Triglycerid- und Cholesterin-Enzymkits bestimmt. Anschließend wurden den Reagenzien 10 µL Blutplasma zugesetzt und der Versuch nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Extinktion wurde bei 510 nm gemessen.

Gesamtglukose/Triglycerid/Cholesterin im Plasma (mg/dL)=(-ABblank)/(Astandard - ABblank) x 200.

A-Probe: Extinktion von Blutproben, ABleer: Extinktionswert von Kits ohne Probe, A-Standard: Extinktionswert des Standardreagenzes, 200: Standardreagenzien bei einer Konzentration von 200 mg/dL.

Bestimmung von Insulin, Leptin und homöostatischem Modell zur Bestimmung der Insulinresistenz (HOMA-IR): Der Insulinspiegel wurde durch Insulin-ELISA-Kits bestimmt. Hier wurden 25 Blutplasma zu den Reagenzien gegeben und die Extinktion bei 450 nm gemessen. Der Gesamt-Leptingehalt wurde unter Verwendung eines Leptin-Enzym-immunometrischen Assay-Kits bestimmt. Dann wurden 100 Plasma analysiert und die Extinktion bei 450 nm unter Verwendung eines ELISA-Lesegeräts gemessen. Das gesamte Experiment wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Der HOMA-IR-Wert wurde aus der Homöostase-Modellbewertungsgleichung=Nüchtern-Plasma-Insulinkonzentration (mU/ml) x Nüchtern-Plasma-Glukosekonzentration (mmol/l)/22,5 bestimmt.

Plasma-Lipid-Peroxidation: Hier wurden {{0}},5 ml Blutplasma mit 1 ml Reagenz (15 %, w/v Trichloressigsäure in 0,25 N Salzsäure (HCl) gemischt ) und 0,375 Prozent, w/v Thiobarbitursäure in 0,25 N HCl) und in ein Wasserbad (Wasserbad, BÜCHI461, Zürich, Schweiz) bei 100 Grad C für 15 Minuten gegeben. Nach dem Abkühlen wurde 1 ml n-Butanol zugegeben, kräftig geschüttelt und 10 min bei 1500 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und die Extinktion bei 532 nm gemessen [12].

Malondialdehyd (MDA)-Konzentration (nM/ml)=[(AProbe bei 532 nm – Blank bei 532 nm)/ (AStandard bei 532 nm – Blank bei 532 nm)] x 5.

Bestimmung von Testosteron- und luteinisierendem Hormon (LH)-Spiegeln im Plasma: Der Testosteron-ELISA-Kit wurde verwendet, um den Testosteronspiegel im Blutplasma zu messen. Zur Bestimmung der LH-Konzentration wurde ein RIA-Kit verwendet. Dann wurden 50 &mgr;l Plasma hinzugefügt, und die Berechnungen basierten auf der Konzentration des Hormons LH-RP-3 (Standard). Die weiteren Schritte erfolgten nach Herstellerangaben.

Bestimmung der Konzentration von Tumornekrosefaktor (TNF)-a und Interleukin-6 (IL-6): Der eingefangene Antikörper wurde 250-fach in Beschichtungspuffer verdünnt und zu einer {{4} }Well-Platte (100 &mgr;l/Well) gegeben und über Nacht bei 4 Grad C gehalten. Der Überstand wurde abgesaugt und fünfmal mit Waschpuffer (1mal PBS, 0,05 Prozent Tween 20) gewaschen. Nach Inkubation (1 h) mit 200 µg Assay-Verdünnungsmittel wurden die Zellen fünfmal mit Waschpuffer gewaschen und 100 µl TNF-a-Standardlösung oder Testproben wurden in jede Vertiefung gegeben und für 2 h inkubiert. Nach dem Waschen wurden 100 ul von IL-6 nachgewiesenen Antikörpern hinzugefügt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der Überstand wurde abgesaugt und fünfmal gewaschen. Dann wurden 480 ml des Enzyms Avidin-Meerrettichperoxidase (HRP) zugegeben und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der Überstand wurde abgesaugt und fünfmal mit Waschpuffer gewaschen. Dann wurden 100 ml Substratlösung zugegeben und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Später wurden 50 ml Stopplösung (1 M Phosphorsäure) in jede Vertiefung gegeben und die Extinktion bei 450 nm gemessen.

Der Vorteil von Cistanche Echinacoside: Antioxidation

Analyse von Spermien- und Hodenparametern

Spermaprobenentnahme: Die Spermaprobenentnahme wurde gemäß dem zuvor in [13] berichteten Verfahren durchgeführt. Die Spermien wurden aus dem Überstand gesammelt und für weitere Analysen verwendet.

Anzahl der Spermien, Spermienbeweglichkeit und anormale Spermien: Die Anzahl der Spermien wurde unter Verwendung des Hämozytometers und der Trypanblau-Lösung berechnet. Dann wurden 100 ml Spermienflüssigkeit mit Trypanblaulösung gemischt und die Anzahl der Spermien, die Beweglichkeit und die abnormalen Spermien wurden unter Verwendung eines Hämozytometers und eines Mikroskops berechnet [14].

Nitroblau-Tetrazolium-NBT-Reduktion und Lipidperoxidation von Spermien und Hoden: Die Lipidperoxidation und NBT-Reduktion wurden nach dem gleichen Verfahren der Plasmaanalyse analysiert.

Bestimmung der Superoxid-Dismutase (SOD)- und Katalase-Aktivität: Die Superoxid-Dismutase (SOD)-Aktivität wurde unter Verwendung des RANSEL-Kits analysiert. Hier wurden {{0}}.05 ml Hodenhomogenat zu 1,7 ml Reaktionslösung (0,05 mM Xanthin, 0,025 mM 2-({ {9}}Iodphenyl)- 3-(4-Nitrophenol)-5-Phenyltetrazoliumchlorid (INT)). Nach dem Mischen wurden 0,25 ml Xanthinoxidase (80 U/L) zugegeben und bei Raumtemperatur für 30 s bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Extinktion wurde bei 505 nm gemessen. Die Proteinkonzentration des Hodenhomogenats wurde mit dem Bio-Rad DC Protein-Assay-Kit bestimmt und seine spezifische Aktivität (E/mg Protein) wurde berechnet. Die Katalase (CAT)-Aktivität wurde gemäß einem zuvor berichteten Verfahren bestimmt [15].

H&E (Hämatoxylin und Eosin)-Färbung

Die Hoden wurden 24 Stunden lang in 10 Prozent Formalin eingeweicht und bei 4 Grad C gelagert. Das Gewebe wurde in Mikrogröße geschnitten und auf dem Objektträger befestigt. Nach der Fixierung (95 Prozent Methanol plus 5 Prozent Essigsäure) wurden die Objektträger 3 Minuten lang in Hämatoxylin getaucht, 5 Minuten lang mit fließendem Wasser gewaschen und dann eine Minute lang mit 50-prozentigem, 70-prozentigem und 90-prozentigem Alkohol getränkt. Danach wurden die Objektträger 10 Sekunden lang mit Eosin gefärbt und eine Minute lang in 100-prozentigem Alkohol eingeweicht, bis es verblasste. Abschließend wurde der Objektträger eine Minute lang in Xylol eingeweicht. Später wurde der Objektträger luftgetrocknet und versiegelt. Das gefärbte Röhrchen wurde in ein inverses Phasenkontrastmikroskop (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokio, Japan) gegeben, um die Morphologie zu beobachten.

Analyse des Hypothalamus

Die Gensequenzen von Maus-KISS1, G-Protein-gekoppeltem Rezeptor (GPR) 54, Suppressor of Cytokine Signaling 3 (SOCS-3) und Sirtuin 1 (SIRT1) wurden aus der Gendatenbank des NCBI (National Center for Biotechnology Information) identifiziert und ein spezifischer Primer wurde unter Verwendung von Primer 5 entworfen. 0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). Die im Experiment verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Extraktion von Ribonukleinsäure (RNA) aus dem Hypothalamus. Die Extraktion von RNA aus dem Hypothalamus des Gehirns wurde mit dem RNeasy Lipid Tissue Mini Kit durchgeführt. Die erhaltenen mRNAs wurden quantitativ durch reverse Transkription (RT) und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gemessen. Die aus der RT-Analyse erhaltene komplementäre DNA wurde zur späteren Verwendung bei -20 Grad gelagert. Die extrahierte DNA wurde einer Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Analyse unter Verwendung von Taq-Polymerase unterzogen. Dann wurden 5~10 ^L des PCR-Produkts entnommen und durch Elektrophorese auf einem 1,5-prozentigen Agar-Kolloid analysiert. Das Bild wurde in einem UVP BioDoc-It-Bildgebungssystem aufgenommen. Es wurde revers transkribierte komplementäre Desoxyribonukleinsäure (cDNA) entnommen und eine PCR mit dem IQ SYBR Green Supermix Kit durchgeführt. Später wurde es mit der iQTM 5 Optical System Software analysiert. Proteine ​​wurden unter Verwendung eines Proteinextraktionsreagenzes (T-PER) extrahiert. Dann wurden 20 mg Hodenhomogenat zu 400 ^L T-PER gegeben und bei 4 Grad (125,000 xg) zentrifugiert (Hochgeschwindigkeitszentrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Deutschland). 20 Minuten. Das folgende Verfahren war ähnlich der in-vitro-Analyse "Identifizierungs- und Quantifizierungsanalyse von Protein".

2.3.Statistische Analyse

Die experimentellen Ergebnisse wurden als mittlere 土-Standardabweichung (Mittelwert 土 SD) ausgedrückt und die Daten wurden mit Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0-Software, IBM, Armonk, New York, NY, USA, analysiert. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) analysiert. Mehrfachvergleiche verschiedener Gruppen wurden mit dem Duncan-Test bei dem Wert von p < 0,05="" als="" signifikantem="" niveau="">

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