Wirkung von Cistanche Tubulosa-Extrakten auf die männliche Fortpflanzungsfunktion bei Streptozotocin-Nicotinamid-induzierten diabetischen Ratten

Schlüsselwörter:Diabetes; Unfruchtbarkeit;Cistanche tubulosaExtrakt(CTE);Echinacosid(EM);AntiphlogistikumAktivität;AntioxidansAktivität;SteroidogeneseAuswirkungen

Weitere Informationen zu den Vorteilen des Cistanche-Extraktpulvers

1. Einleitung

Diabetes mellitus (DM) ist ein Zustand, bei dem erhöhte Glukosespiegel im Blut bedingt sindauf die Ineffizienz der Bauchspeicheldrüse bei der Produktion von genügend Insulin oder die Unfähigkeit des Körpers, es zu verwendeneffektiv. Laut WHO stieg die Zahl der Menschen mit Diabetes von 108 Millionen im Jahr 1980 anauf 422 Millionen im Jahr 2014 [1]. Es gibt vier Hauptkategorien: Prädiabetes (ein Stadium vor Diabetes), Typ 1(wo die Bauchspeicheldrüse kein Insulin produziert), Typ 2 (der Körper kann kein Insulin verwenden) und SchwangerschaftDiabetes (der während der Schwangerschaft auftritt). Oxidativer Stress entsteht durch das Ungleichgewicht zwischen denProduktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Antioxidantien [2] führt schließlich zum diabetischen Zustand.Zu den Komplikationen von Diabetes gehören Nierenversagen, Nervenschäden, Erblindung, Schlaganfall, HerzAttacke, Tod des Fötus und Unfruchtbarkeit. [1]. Studien zeigen, dass Spermienkerne, Desoxyribonukleinsäure (DNA),und Mitochondrien wurden bei männlichen Diabetikern signifikant geschädigt [3]. Oxidativer Stress währendDer Transport von Spermien verändert den Prozess des männlichen Fortpflanzungssystems [4,5]. 

Der Prozess der Spermatogenese wird durch die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden (HPG) gesteuert.Achse. Das vom Hypothalamus produzierte Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) stimuliert dieProduktion von luteinisierendem Hormon (LH) und follikelstimulierendem Hormon (FSH). Es werden Leydig-Zellen gefundenangrenzend an die Hodenkanälchen und produzieren Testosteron unter der Kontrolle von LH. FSH-Triggerdie Produktion von Antigen-bindendem Protein (ABP), das hilft, das männliche Hormon zu passieren. Also Unfruchtbarkeitund andere Probleme entstehen hauptsächlich aufgrund der Störungen, die in der HPG-Achse auftreten. Verwaltung vondie Kombination von Streptozotocin-Nicotinamid induziert Diabetes bei Versuchsratten. Streptozotocinist eine chemische Verbindung, die für die Insulinproduktion toxisch ist Zellen in der Bauchspeicheldrüse und Nicotinamid ist einwasserlösliches Vitamin, das die schützt Zellen vor vollständiger Schädigung [6]. Cistanche tubulosaist eine Wüstenpflanzenart, die auch als "Rou Cong-Rong" bekannt ist [7]. Es ist einnicht chlorophyllartige parasitäre Pflanze, die hauptsächlich an der Wurzel des wächstCalotropis proceraBaum und istweit verbreitet im trockenen Land von Gansu, Qinghai, Xinjiang, der Mongolei, dem Iran und Indien. Das GemeineName vonCistanche tubulosaist "Wüstenhyazinthe". Es ist in der traditionellen chinesischen Medizin weithin anerkanntund hat den Namen "Ginseng der Wüste" erhalten. Es ist im medizinischen Bereich weit verbreitetBehandlung von krankhaftem Fluor, starker Metrorrhagie, chronischen Nierenerkrankungen, Verstopfung, Impotenz undUnfruchtbarkeit. Chemische Bestandteile vonCistanche tubulosabestehen aus nichtflüchtigen Phenylethanoidglykosiden(PHGs), Iridoide, Lignane, flüchtige Öle, Alditole, Oligosaccharide und Polysaccharide [8]. Studienzeigen, dass Echinacosid aus diesem Kraut die geschädigten Fibroblasten schützt, indem es den ROS-Spiegel reguliert [9]. Diese Verbindung erzeugt zusammen mit antioxidativen, vasorelaxierenden und entzündungshemmenden AktivitätenNeuroprotektion und Osteoporoseprävention [10,11]. Diese Studie zielte darauf ab, die Wirkung von zu untersuchenCistanche tubulosaExtraktmit ECH auf derreproduktive Dysfunktion der Streptozotocin-Nicotinamid-induzierten diabetischen Ratte.

2. Materialien und Methoden

2.1. Materialien

ECH und CTE wurden von Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan) erworben. FortschrittlichGlykationsendprodukte (AGEs) wurden von Biovision (San Francisco, CA, USA) bezogen. LC-540und TM3-Zelllinien wurden vom Food Industry Research and Development Institute erworben(Hsinchu, Taiwan). Fünf Wochen alte männliche Sprague-Dawley (SD)-Ratten wurden von der gekauftNationales Versuchstierzentrum (Taipeh, Taiwan). Feed Lab Diät® wurde von PMI gekauftNutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) wurde erhaltenvon Sigma (St. Louis, MO, USA). Methanol und 4-(2-Hydroxyethyl)-1-PiperazinethansulfonsäureSäure (HEPES) wurden ebenfalls von Sigma bezogen. Dulbeccos modifizierter Eagle Medium/F12 undTrypsin-EDTA wurden von GIBCO (New York, NY, USA) erhalten. 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT), Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA), DimethylSulfoxid (DMSO) und Nitroblautetrazolium (NBT) wurden von Sigma bezogen. Glukose enzymatischKits wurden von Kyokutoseiyaku, Tokyo, Japan erhalten. Es wurden Insulin-ELISA-Kits gekauftvon Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Schweden). T-PER-GewebeproteinextraktionDas Reagenz wurde von Thermo Scientific (Chicago, IL, USA) bezogen. Anti-Mensch/Maus/Ratte nuklearFaktor-kappa B NF-κB polyklonale Antikörper wurden von Santa Cruz Biotechnology, Santa erworbenCruz, Kalifornien, USA. Anti-Maus/Ratte-Rezeptor für fortgeschrittene Glykationsendprodukte (RAGE), polyklonalAntikörper, polyklonale Anti-Mensch/Maus/Ratte-StAR-Antikörper und Anti-Mensch/Maus/RatteMonoklonale Cytochrom-P450 17A1-Antikörper wurden von Gene Tex (Irvine, CA, USA) gekauft.Polyklonale Anti-Mensch/Maus/Ratte-CYP11A1-Antikörper wurden von Cell Signaling bezogenTechnologie (Beverly, PA, USA). Das Easy-Blue-Reagenz wurde von Invitrogen, Thermo Fisher bezogenWissenschaftlich (Carlsbad, CA, USA). Agarose und DNA-Marker 100 bp wurden von Promega bezogen,Corporation (Madison, WI, USA). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit wurde von QIAGEN bezogen,Hilde, Deutschland.

5 Prozent CO2 Inkubator (CO2 Inkubator, Napco 5410, Taiwan). Die TM3-Zelllinie wurde in Dulbecco's kultiviertmodifiziertes Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit Glucose (4,5 g/l), Natriumpyruvat (0,5 mM),L-Glutamin (2,5 mM), Natriumbicarbonat (1,2 g/L), 4-(2-Hydroxyethyl)-1-PiperazinethansulfonsäureSäure (HEPES, 15 mM) und fötales Kälberserum (FCS, 10 Prozent) oder Pferdeserum (5 Prozent) bei 37◦C in 5 ProzentCO2 Inkubator.

Bestimmung der Zellviabilität von Echinacosid (ECH): 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Reagenz wurde für den Zelllebensfähigkeitsassay verwendet. Die Zellkonzentrationwurde auf 2 eingestellt× 105Zellen/ml in einer 96-Well-Platte. Dann, 20µL ECH (verdünnt in 2 Prozent Medium)zugegeben und 24 h bei 37 inkubiert◦C in einem 5-prozentigen CO2 Inkubator. Später, 100µL MTT-Reagenz warzugegeben und 4 h bei 37 inkubiert◦C unter dunklen Bedingungen. Die Extinktion wurde bei 570 nm gemessen(ELISA-Reader, Dynatech MR5000, Kloten, Schweiz).Relative Zelllebensfähigkeit ( Prozent )=[(AProbe bei 570 nm− Aleer bei 570 nm)]/[(AKontrolle bei 570− Aleer bei 570)] × 100.

Analyse des Gehalts an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS):

Die Zellzahl wurde angepasst2 × 105Zellen/mlin einer 12-Well-Platte mit 2 % FBS. Dann 50µL/ml ECH, RES und AGEswurden auf die Platte gegeben und bei 37 inkubiert◦C für 24 Std. Nach 24 Std., 20 ,70 -Dichlorfluoresceindiacetat(DCFH-DA) wurde hinzugefügt und bei 37 inkubiert◦C für 30 min. Nach Zentrifugation (400× g, 5 Minuten),

und AGEs wurden hinzugefügt und bei 37 inkubiert◦C in einem 5-prozentigen CO2 Inkubator für 24 Std. Danach 400µL von T-PERwurden hinzugefügt, die Zellen abgekratzt und bei 125 °C zentrifugiert,000× g 20 Minuten (4◦C). Der Überstandgesammelt und gelagert wurde−80 ◦C (−80 ◦C Freezer, Nuaire, Plymouth, MN, USA) zur weiteren Analyse.

Bicinchoninsäure (BCA)-Kit wurde zur Proteinquantifizierung verwendet. Dann, 10µL Standard-Zelllösungund 200µL BCA-Reagenz wurden zu 8--Well-Platten gegeben und bei 37 °C inkubiert◦C in einem 5-prozentigen CO2 Inkubatorfür 30 min. Die Extinktion wurde bei 562 nm gemessen. Eine Proteinidentifikationsanalyse wurde durchgeführtdurch Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE)-Elektrophorese. Proben warenhergestellt durch Zugabe von Proteinlysat zu Proteinladepuffer und Western-Blot-Analyse wurde durchgeführtum die spezifischen Proteine ​​nachzuweisen.

2.2.2. In-vivo-Analyse

Design des Tiermodells: Sechzig 4- Wochen alte männliche Sprague-Dawley (SD)-Ratten wurden von der gekauftNationales Versuchstierzentrum (Taipeh, Taiwan). Jede Ratte wurde einzeln in Desinfektionsmittel gehaltenEdelstahlkäfige unter kontrollierter Temperatur (23± 1 ◦C) und Luftfeuchtigkeit (40–60 Prozent) mit 12 hLicht-/12-Stunden-Dunkel-Zyklus. Futter und Wasser wurden ad libitum zur Verfügung gestellt. Jede Ratte wurde zuerst domestiziertWoche und erhielten Labornagetierfutter 5001 als Hauptfutter. Alle Verfahren folgten dem Standarddes Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-Zulassung Nr. 101026) des NationalTaiwan Ocean University, Taiwan. Nach der Domestizierung wurden die Ratten in zwei Gruppen eingeteilt: die KontrolleGruppe (Con), die mit Labordiät 5001 gefüttert wurde, und die Diabetikergruppe, die mit einer fettreichen Diät gefüttert wurde(HFD, 40 Prozent) für das gesamte Experiment. Nach 4-wöchiger Ernährung mit dem HFD die DiabetikergruppeRatten wurde Streptozotocin (65 mg/kg) (STZ) injiziert, um Diabetes mellitus (DM) zu induzieren. Innerhalb15 min Injektion von STZ, Nicotinamid (230 mg/kg Körpergewicht) wurde injiziert. Eine Woche nach der Injektion,ein oraler Glukosetoleranztest (OGTT) wurde durchgeführt, um die erfolgreiche Induktion von Diabetes zu bestimmenMellitus (DM). Danach wurden die Tiere in sechs Gruppen eingeteilt: die Kontrolle (gefüttert mit Labordiät5001); DM-Gruppe (DM plus 45 Prozent HFD); DMR-Gruppe (DM plus Rosiglitazon: 0,571 mg/kg KG) plus 45 Prozent HFD;DME1-Gruppe (DM plus CTE: 80 mg/kg KG) plus 45 Prozent HFD; DME2-Gruppe (DM plus CTE: 160 mg/kg KG)plus 45 Prozent HFD; und DME4-Gruppe (DM plus CTE: 320 mg/kg KG) plus 45 Prozent HFD. Rosiglitazon (RSG) warals Positivkontrolle genommen. Drei CTE-Dosen (80, 160 und 320 mg/kg) wurden gemäß verwendetdie Empfehlung der Taiwan Food and Drug Administration (TFDA) Health Food FunctionalBewertungsrichtlinien. Die Behandlungen wurden bis zum Ende des Experiments gegeben. Alles Versuchsrattenwurden nach 6 Wochen getötet. Das den Ratten entnommene Blut wurde bei 3000 U/min zentrifugiert15 Minuten um 4◦C. Der Überstand wurde für die folgende Analyse untersucht:Gesamtglukose, Triglyzeride und Cholesterin

Festlegung:

Die Glukosebestimmung wardurch Glucose-Enzymkits durchgeführt. Dann, 20µL Blutplasmaproben wurden hinzugefügtReagenzien und bei 37 gehalten◦C für 5 min. Die Gesamttriglyzerid- und Gesamtcholesterinkonzentration wurden bestimmtbestimmt unter Verwendung von Triglycerid- und Cholesterin-Enzymkits. Dann, 10µL Blutplasma warenden Reagenzien zugesetzt und der Versuch nach Herstellerangaben durchgeführt.Die Extinktion wurde bei 510 nm gemessen.Gesamtglukose/Triglycerid/Cholesterin im Plasma (mg/dL)=(AProbe− ALeer)/(AStandard− ALeer) × 200. Eine Probe: Extinktion von Blutproben, ALeer: Extinktionswert von Kits ohne Probe, Standard: Extinktionswert des Standardreagenzes, 200: Standardreagenzien bei einer Konzentration von200mg/dl.Insulin-, Leptin- und homöostatische Modellbewertung – Bestimmung der Insulinresistenz (HOMA-IR):Der Insulinspiegel wurde durch Insulin-ELISA-Kits bestimmt. Hier, 25µL Blutplasma wurden zugesetztReagenzien und die Extinktion wurde bei 450 nm gemessen. Der Gesamt-Leptingehalt wurde unter Verwendung von bestimmtLeptin-Enzym-Immunometrie-Assay-Kit. Dann 100µL Plasma wurden analysiert und die Extinktionwurde bei 450 nm unter Verwendung eines ELISA-Lesegeräts gemessen. Der gesamte Versuch wurde gemdie Herstellerangaben. Der HOMA-IR-Wert wurde aus dem Homöostasemodell bestimmtBewertungsgleichung=Nüchtern-Plasma-Insulinkonzentration (mU/ml)× Nüchtern-PlasmaglukoseKonzentrationen (mmol/L)/22,5.Plasma-Lipid-Peroxidation: Hier wurden 0,5 ml Blutplasma mit 1 ml Reagenz (15 % ,w/v Trichloressigsäure in {{0}},25 N Salzsäure (HCl) und 0,375 Prozent ,w/v Thiobarbitursäure ein0,25 N HCl) und bei 100°C in ein Wasserbad (Wasserbad, BÜCHI 461, Zürich, Schweiz) gegeben◦C für15 Minuten. Nach dem Abkühlen wurde 1 ml n-Butanol zugegeben, kräftig geschüttelt und bei 1500 zentrifugiert× g für 10 min. Der Überstand wurde gesammelt und die Extinktion bei 532 nm gemessen [12]. Malondialdehyd (MDA)-Konzentration (nM/ml)=[(Eine Probebei 532nm− Aleer bei 532 nm)/ (Standardbei 532nm− Aleer bei 532 nm)] × 5. Bestimmung des Testosteronspiegels und des luteinisierenden Hormons (LH) im Plasma: Das TestosteronELISA-Kit wurde verwendet, um den Testosteronspiegel im Blutplasma zu messen. RIA-Kit wurde verwendetdie LH-Konzentration bestimmen. Dann 50µL Plasma wurden zugegeben und den Berechnungen zu Grunde gelegtvon der Konzentration des Hormons LH-RP-3 (Standard). Die weiteren Schritte erfolgten gemnach Herstellerangaben.Bestimmung des Tumornekrosefaktors (TNF)- und Interleukin-6 (IL-6) Konzentration:Der eingefangene Antikörper wurde 250-fach in Beschichtungspuffer verdünnt, zu einer 96--Well-Platte (100µL/gut),und bei 4 gehalten◦C für über Nacht. Der Überstand wurde abgesaugt und fünfzehnmal mit Waschen gewaschenPuffer (1 Mal PBS, 0,05 Prozent Tween 20). Nach Inkubation (1 h) mit 200µg Assay-Verdünnungsmittel wurden die Zellen5 mal mit Waschpuffer und 100 gewaschenµL von TNF- Standardlösung oder Testproben warenzu jeder Vertiefung gegeben und für 2 h inkubiert. Nach dem Waschen 100µL von IL-6 nachgewiesenen Antikörpern wurden hinzugefügtund 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Der Überstand wurde abgesaugt und fünfmal gewaschen. Dann,480 µL des Enzyms Avidin-Meerrettichperoxidase (HRP) wurden zugegeben und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiertTemperatur. Der Überstand wurde abgesaugt und fünfmal mit Waschpuffer gewaschen. Dann 100µL Substratlösung zugegeben und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Später, 50µL von AnschlagLösung (1 M Phosphorsäure) wurden zu jeder Vertiefung gegeben und die Extinktion wurde bei 450 nm gemessen.Analyse von Spermien- und HodenparameternSpermaprobenentnahme: Die Spermaprobenentnahme wurde gemäß der durchgeführtMethode zuvor berichtet in [13]. Die Spermien wurden aus dem Überstand gesammelt und für verwendetweitere Analyse.Anzahl der Spermien, Spermienbeweglichkeit und anormale Spermien: Die Anzahl der Spermien warberechnet mit Hämocytometer und Trypanblau-Lösung. Dann 100µL Spermaflüssigkeit warenmit Trypanblau-Lösung gemischt und die Anzahl der Spermien, Beweglichkeit und abnormen Spermien wurden bestimmtberechnet mit Hämozytometer und Mikroskop [14]. Nitroblau Tetrazolium NBT Reduktion und Lipidperoxidation von Spermien und Hoden: Das LipidPeroxidation und NBT-Reduktion wurden nach dem gleichen Verfahren der Plasmaanalyse analysiert.

Bestimmung der Superoxid-Dismutase (SOD) und Katalase-Aktivität: Superoxid-Dismutase(SOD)-Aktivität wurde unter Verwendung des RANSEL-Kits analysiert. Hier, 0,05 ml Hodenhomogenatwurden zu 1,7 ml Reaktionslösung (0.05 mM Xanthin, 0,025 mM 2-(4-iodphenyl)-{{0}}(4-Nitrophenol)-5-Phenyltetrazoliumchlorid (INT)). Nach dem Mischen 0,25 ml Xanthinoxidase (80 U/l)zugegeben und bei Raumtemperatur 30 s bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Absorption wargemessen bei 505nm. Die Proteinkonzentration des Hodenhomogenats wurde durch die bestimmtBio-Rad DC Protein-Assay-Kit und seine spezifische Aktivität (E/mg Protein) wurde berechnet. Die Katalase(CAT)-Aktivität wurde gemäß einem früher berichteten Verfahren bestimmt [15]. H&E (Hämatoxylin und Eosin)-FärbungDie Hoden wurden in 10 Prozent Formalin für 24 h eingeweicht und bei 4 gelagert◦C. Die Gewebe in Scheiben geschnittenMikrogröße und am Objektträger befestigt. Nach der Fixierung (95 Prozent Methanol plus 5 Prozent Essigsäure) wurden die Objektträger3 min in Hämatoxylin getaucht, 5 min mit fließendem Wasser gewaschen und dann damit getränkt50 Prozent, 70 Prozent und 90 Prozent Alkohol für eine Minute. Danach wurden die Objektträger für 10 s mit Eosin gefärbt undeine Minute lang in 100-prozentigem Alkohol eingeweicht, bis es verblasste. Abschließend wurde der Objektträger einmal in Xylol getränktMinute. Später wurde der Objektträger luftgetrocknet und versiegelt. Das gefärbte Röhrchen wurde in einen umgekehrten Phasenkontrast gebrachtMikroskop (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokyo, Japan) zu beobachtendie Morphologie.Analyse des HypothalamusDer Maus-KISS1, G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPR) 54, Suppressor der Zytokin-Signalgebung 3 (SOCS-3)und Sirtuin 1 (SIRT1)Gensequenzen wurden vom NCBI (National Center for BiotechnologyInformation) Gendatenbank und ein spezifischer Primer wurde unter Verwendung von Primer 5 entworfen.0 PREMIER Biosoft,Palo Alto, Kalifornien, USA.). Die im Experiment verwendeten Primer sind in der Tabelle aufgelistet1.

Extraktion von Ribonukleinsäure (RNA) aus dem Hypothalamus. Die Extraktion von RNA aus derHypothalamus des Gehirns wurde mit dem RNeasy Lipid Tissue Mini Kit durchgeführt. Das ErhaltenemRNAs wurden quantitativ durch reverse Transkription (RT) und Polymerase-Kettenreaktion gemessen(PCR). Die aus der RT-Analyse erhaltene komplementäre DNA wurde bei gelagert−20 ◦C für spätere Verwendung.Die extrahierte DNA wurde einer Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Analyse unter Verwendung von Taq-Polymerase unterzogen.Dann 5~10µL des PCR-Produkts wurden entnommen und durch Elektrophorese auf einem 1,5-prozentigen Agar analysiertKolloid. Das Bild wurde in einem UVP BioDoc-It-Bildgebungssystem aufgenommen. Rückwärts transkribiert komplementärDesoxyribonukleinsäure (cDNA) wurde entnommen und eine PCR wurde unter Verwendung des IQ SYBR Green Supermix durchgeführtBausatz. Später wurde es mit der iQTM 5 Optical System Software analysiert. Proteine ​​wurden unter Verwendung von aProteinextraktionsreagenz (T-PER). Dann wurden 20 mg Hodenhomogenat zu 400 gegebenµL von T-PER und zentrifugiert (Hochgeschwindigkeitszentrifuge, Hettich CR-12, Tuttlingen, Deutschland) bei 4◦C (125,000× g) für 20 min. Das folgende Verfahren war ähnlich wie "Identifizierung und Quantifizierung".Proteinanalyse" in der In-vitro-Analyse.2.3. Statistische AnalyseDie Versuchsergebnisse wurden als Mittelwert ausgedrückt± Standardabweichung (Mittelwert± SD) und dieDaten wurden mit Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11 analysiert. 0 Software, IBM, Armonk,New York, New York, USA. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch Einweganalyse von analysiertVarianz (ANOVA). Mehrere Vergleiche verschiedener Gruppen wurden mit dem Duncan-Test analysiertWert vonp < 0.05="" as="" the="" signifificant="">

3. Ergebnisse

3.1. In-vitro-Analyse

3.1.1. Vergleich der antioxidativen Aktivitäten von ECH, CTE und RES

Langfristig hoher oxidativer Stress und chronische Entzündungen sind die Hauptursachen für DiabetesKomplikationen [16]. CTEs enthalten verschiedene Phenylethanoidglykoside wie Echinacosid(ECH) und Acteosid, mit dem Potenzial für antioxidative Aktivität [17]. DPPH-RadikalfängerZur Bewertung der antioxidativen Aktivität von ECH wurde ein Assay durchgeführt. Trolox und Resveratrol(3,5,4'-Trihydroxystilben, RES) wurden als Standard bzw. Positivkontrolle genommen. Wie gezeigtin Abbildung1zeigte ECH eine bessere Radikalfängeraktivität und die Aktivität war signifikant höherals die der Positivkontrolle (RES).

3.1.2. Zelllebensfähigkeit von ECH auf LC-540- und TM3-Leydig-ZellenDer MTT-Assay wurde durchgeführt, um die Zelllebensfähigkeit verschiedener ECH-Konzentrationen zu bewerten.LC-540-Leydig-Zellen und TM3-Leydig-Zellen zeigten nach der Behandlung mehr als 80 % der LebensfähigkeitEM (Abb2). Im Vergleich zu den anderen Konzentrationen ist ein 100-µM-Konzentration (Verdünnungen von 100µM in 2 Prozent FBS) von ECH zeigte eine bessere Zelllebensfähigkeit in TM3 Leydig-Zellen. Das Ergebnis zeigte, dass dieeine erhöhte Konzentration von ECH trägt zu keiner signifikanten Toxizität für die Zellen bei.

3.1.3. Wirkung von ECH auf die AGE-induzierte Superoxidproduktion durch NBT-Assay in LC-540 und TM3Zelle Leydig

AGEs verursachen oxidative Schäden im Körper aufgrund der Oxidation von Glucose und der Bildung vonfreie Radikale wie O2-, Hydroxylradikale und Carbonylgruppen [18]. Nachdem mit stimuliert wurde50 µg/ml AGEs, die LC-540 (Abbildung3a) und TM3 (Abbildung3b) Zellen wurden mit ECH und RES behandelt(5 µM und 10µM jeweils). Die Ergebnisse zeigten, dass die Produktion von Superoxidanionen erhöht warin der Kontrollgruppe (stimulierte AGEs), aber die Produktion von Superoxid-Anion war danach verringertBehandlung mit ECH und RES. Von Abbildung3, wurde davon ausgegangen, dass ECH und RES das Niveau reduzierender Superoxidproduktion und schützen die Zellen vor oxidativen Schäden. Im Fall von LC-540-Zellen,10 µM ECH zeigte fast eine ähnliche Aktivität wie die normale Gruppe. Die Superoxidproduktion in beidenZellen wurde mit einem Anstieg der Konzentration sowohl von ECH als auch von RES verringert.3.1.4. Wirkung von ECH auf H2O2 Produktion in AGE-stimulierten LC-540 Leydig-ZellenDer DCFH-DA-Assay wurde zum Nachweis des Vorhandenseins von oxidativen Spezies durchgeführt. Nach dem EintretenIn den Zellen wird der FL-Fluoreszenzfarbstoff DCFH-DA durch intrazelluläres H oxidiert2O2 und bildet Dichlorfluorescein(DCF). Wie in Abbildung gezeigt4, gab es einen signifikanten Anstieg des intrazellulären H2O2 Produktion in derAGE-stimulierte Gruppe (Kontrolle), während die Zugabe von 10µM ECH und RES deutlich reduziertdas H2O2 Produktion in Zellen. Verwaltung vom 10µM ECH führte zu nur etwa 47,1 Prozent H2O2 Produktion deutlich niedriger als in der Kontrollgruppe.

3.1.5. Wirkung von ECH auf RAGE und NF-κB-Protein-Expressionsniveaus in AGE-stimuliertem LC-540Leydig-Zellen

Eine Western-Blot-Analyse wurde durchgeführt, um das Vorhandensein von RAGE in LC-540 Leydig zu bestätigenZellen. Die Wirkung von ECH auf RAGE (Abbildung5a) und NF-κB (Abbildung5b) Proteinexpressionsniveausin AGEs-stimulierten Leydig-Zellen wurden in Abbildung gezeigt5. Die Ergebnisse zeigten, dass 50µg/mlKonzentration von AGEs induzierte höhere RAGE und NF-κB-Expression in LC-540 Leydig-Zellen und10 µDie M-Konzentration von ECH und RES hat die Expression von RAGE und NF- signifikant reduziert.κB. Der Ausdruck von NF-κB war bei RES und ECH signifikant niedriger als bei RAGE-Antagonisten. Also die Ergebnissebestätigte, dass das ECH das Entzündungsniveau reduzierte, indem es das RAGE- und NF-Niveau senkte.κB.

.1.6. Wirkung von ECH auf den Testosteronsyntheseweg in AGE-stimulierten LC-540 Leydig-Zellen.

Der Prozess der Spermatogenese und der männlichen Unfruchtbarkeit hängt von der Anwesenheit von Testosteron ab.Wie in Abbildung gezeigt6, die Ausdrücke von StAR (Abbildung6a), CYP11A1 (Abb6b), CYP17A1 (Abb6c), und HSD17 3 (Abbildung6d) Proteine ​​waren bei AGE-stimuliertem LC-540 Leydig signifikant verringertZellen (Kontrollgruppe). Die Expressionen von StAR, CYP11A1, CYP17A1 und HSD17 3 Proteine ​​warensignifikant erhöht, wenn der RAGE-Antagonist, RES und ECH hinzugefügt wurden. Die erhöhteDie Expression von StAR- und CYP11A1-Proteinen wurde sowohl in der ECH- als auch in der RES-behandelten Gruppe beobachtet.Das Expressionsniveau von CYP17A1 war in den RES- und ECH-Gruppen fast ähnlich. Die Ausdrücke derHSD17 3-Protein in ECH-behandelten Leydig-Zellen waren viel höher als die von RES und RAGEmit Antagonisten behandelte Zellen. Erhöhte Expression von StAR, CYP11A1, CYP17A1 und HSD17 3 Proteinezeigte die normale Produktion von Testosteron an.

5Zellen/ml und Behandlung mit RES und ECH(10µM) wurde für 24 h verabreicht. -Aktin wurde als interne Kontrolle genommen. Die normale Gruppe (Nor)wurde mit Medium behandelt und die Kontrollgruppe (Con) wurde mit AGEs (50µg/ml).

Ergebnissewurden als Mittelwert angezeigt±SD (n = 3). Signifikante Unterschiede (p < 0.05)="" were="" represented="" by="" letters="">analysiert durch Duncans Multiple-Range-Test.