Einfluss der Kalzium- und Phosphatbeladung in der Nahrung auf die Kinetik der Calciprotein-Partikel bei Erwachsenen mit normaler und eingeschränkter Nierenfunktion

Abstrakt

Plasma nähert sich hinsichtlich seines Kalzium- und Phosphatgehalts der Metastabilität, wobei nur geringfügige Störungen der Ionenaktivität erforderlich sind, um das Kristallwachstum nach der Keimbildung aufrechtzuerhalten. Physiologisch gesehen werden Kalzium und Phosphat jeden Tag intermittierend aus der Nahrung aufgenommen, die Plasmakonzentrationen dieser Ionen weichen jedoch postprandial nur minimal ab. Dies impliziert die Existenz eines durch das Blut übertragenen Mineralpuffersystems, um Calciumphosphate zu binden und das Risiko einer Ablagerung im Weichgewebe zu minimieren. Calciprotein-Partikel (CPP), endogene Mineral-Protein-Kolloide, die das Plasmaprotein Fetuin-A enthalten, könnten diese Funktion erfüllen, es fehlen jedoch eindeutige Beweise für einen Zusammenhang zwischen der Mineralstoffzufuhr in der Nahrung und ihrer Bildung. Hier zeigen wir, dass CPP als normale physiologische Reaktion auf die Nahrungsaufnahme bei gesunden Erwachsenen gebildet wird und dass dies trotz minimaler Veränderung der herkömmlichen Serummineralmarker geschieht. Darüber hinaus zeigen wir bei Personen mit chronischer Nierenerkrankung (CKD), bei denen der Umgang mit Mineralien beeinträchtigt ist, dass sowohl der Nüchternspiegel als auch der postprandiale Spiegel von CPP-Vorläufern deutlich erhöht sind und stark umgekehrt mit der Nierenfunktion korrelieren. Diese Studie unterstreicht den wichtigen, aber oft vernachlässigten Beitrag der kolloidalen Biochemie zur Mineralstoffhomöostase und liefert neue Einblicke in die Fehlregulation des Mineralstoffwechsels bei chronischer Nierenerkrankung.

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Einführung

Calcium und Phosphat bilden in wässriger Lösung schwer lösliche Salze, und während der Stoffwechsel in allen lebenden Organismen von diesen essentiellen Nährstoffen abhängt, birgt ihre Koexistenz in biologischen Flüssigkeiten ein inhärentes Mineralisierungsrisiko und erfordert eine strenge Regulierung1. Die meisten extrazellulären Flüssigkeiten wie Plasma gelten hinsichtlich ihrer Calcium- und Phosphationenaktivitäten2 als metastabil oder nähern sich der Metastabilität und unterstützen bei Keimbildung problemlos das Kristallwachstum. Diese Tendenz zur Ausfällung von Kalzium und Phosphat wurde von Wirbeltieren aufgrund ihrer einzigartigen biomechanischen Eigenschaften während der Entwicklung des Skelett- und Zahngewebes genutzt. Dies erforderte jedoch gleichzeitig Mechanismen für eine schnelle Mobilisierung und einen effizienten Massentransport von Mineralvorläufern, um den Anforderungen des Wachstums und der Reparatur dieser Hartgewebe gerecht zu werden, sowie Strategien zur Beschränkung der Mineralisierung auf diese Stellen und zur Verhinderung unerwünschter Verkalkung in Weichgewebe3 . Tatsächlich sind selbst geringfügige Erhöhungen der Plasma-Kalzium- und Phosphatkonzentrationen mit einem erhöhten Risiko einer pathologischen Verkalkung der Arterien und Gewebe verbunden4. Da überschüssiges Kalzium und Phosphat fast ausschließlich über die Niere ausgeschieden werden, ist dieses Risiko zusammen mit den damit verbundenen kardiovaskulären Folgen bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung (CKD) wesentlich höher, bei denen Störungen im Mineralstoffwechsel mit relativ geringen Rückgängen der glomerulären Filtration deutlich werden Rate (GFR)5,6. Angesichts der Fülle an Kalzium und Phosphat in der Nahrung, der Säugetiere zeitweise ausgesetzt sind, könnte man vermuten, dass das Risiko einer ektopischen Mineralisierung nach einer Mahlzeit aufgrund des zu erwartenden Anstiegs der aus dem Darm absorbierten Mineralionen am höchsten ist. Doch entgegen dieser Erwartung ändern sich die Plasma-Kalzium- und Phosphatkonzentrationen in der postprandialen Phase nur minimal, und obwohl eine erhöhte Harnausscheidung zur Aufrechterhaltung der Homöostase beiträgt7, erfolgt diese Reaktion nicht sofort und verzögert sich einige Stunden nach der Einnahme von millimolaren Mengen an Kalzium und Phosphat8. Als Lösung für diese physiologische Herausforderung wird seit langem ein durch das Blut übertragenes System zur Pufferung und zum Transport von Mineralien vermutet9, und in jüngster Zeit richtet sich die Aufmerksamkeit auf kolloidale Mineral-Protein-Komplexe, die diese Funktion erfüllen und den intermittierenden Transport von Mineralien durch die Extrazellulärzone sicher überwachen könnten Flüssigkeit an Orte der Verwendung oder Entsorgung10.

Im Plasma ist das aus der Leber stammende Glykoprotein Fetuin-A11 der stärkste und am häufigsten vorkommende Proteinmineralisierungsregulator, der mit entstehenden kolloidalen Mineral-Protein-Komplexen interagiert, um Calciprotein-Partikel (CPP) zu bilden12,13. Analog zur Art und Weise, wie Apolipoproteine ​​ihre Lipidfracht für den Transport solubilisieren, stabilisiert FetuinA schwerlösliche Calciumphosphate, verhindert Kristallwachstum und Ausfällung und erleichtert gleichzeitig deren Aufnahme in Gewebe zur Nutzung oder Beseitigung14–16. Die Unfähigkeit, CPP herzustellen oder ausreichend zu stabilisieren, wie es bei Fetuin-A-Knockout-Mäusen beobachtet wird, führt zu einem der schwersten bekannten Phänotypen ektopischer Verkalkung17, bei dem mineralhaltige Komplexe direkt im Lumen des Mikrogefäßsystems ausfallen, was zu Verschluss, Ischämie, Nekrose und Fbrose18. CPP wird durch eine Reihe geordneter Schritte erzeugt, zunächst durch die Bindung spontan gebildeter Cluster von Calcium- und Phosphationen an Fetuin-A, wodurch Calciprotein-Monomere (CPM)19 entstehen, die dann als Bausteine ​​für größere Polymerstrukturen dienen; Zunächst verschmelzen sie zu kugelförmigem primärem CPP (CPP-I), das amorphes Calciumphosphat enthält, bevor sie sich in größeres und dichteres ellipsoides sekundäres CPP (CPP-II) mit kristallinem Hydroxylapatit umwandeln12.

Über die angebliche physiologische Rolle der CPP-Bildung bei der Sequestrierung und Verteilung überschüssiger Mineralien hinaus werden erhöhte Werte auch bei Zuständen mit gestörtem Mineralstoffwechsel beobachtet, einschließlich bei CKD20. In diesem Fall wurden höhere Serumspiegel von CPM und CPP mit einem erhöhten Risiko für kardiovaskuläre Ereignisse21–25 und Mortalität22 in Verbindung gebracht. Präklinische Studien deuten darauf hin, dass CPP direkt die Verkalkung glatter Gefäßmuskelzellen26,27, die Aktivierung zellulärer Entzündungs- und zytotoxischer Wege28,29 sowie Gefäßluminal- und Endothelläsionen30 induzieren kann. Insgesamt wurde vorgeschlagen, dass eine längere Exposition gegenüber chronisch erhöhten Serum-CPP-Spiegeln dazu beitragen könnte, die Zusammenhänge zwischen überschüssigen Nahrungsmineralien und schlechten Patientenergebnissen bei CKD zu erklären14,31. Interessanterweise deuten neuere Daten auch darauf hin, dass zirkulierendes CPM am Glomerulus gefiltert wird29, was darauf hindeutet, dass eine Nierenfunktionsstörung den CPP-Metabolismus über mehrere Mechanismen beeinflussen kann.

Jüngste methodische Fortschritte ermöglichen die direkte Quantifizierung von CPM32, CPP-I und CPP-II33, wobei diese Tests nun in mehreren beobachtenden und interventionellen klinischen Studien angewendet werden24,25,34–39. Eine weitere neuartige ergänzende Methode zur Bewertung dieses Systems ist der T50-Test, eine funktionelle Bewertung der Fähigkeit des Serums, der ex vivo-Bildung von CPP-II zu widerstehen, wenn es mit übersättigten Mengen an Kalzium und Phosphat in Kontakt gebracht wird40. Ein niedrigerer T50-Wert wurde bei Personen mit normaler Nierenfunktion41 sowie in verschiedenen CKD-Kohorten, darunter sowohl nicht-dialysepflichtige22,42,43 als auch dialyseabhängige CKD44, durchgängig mit einem erhöhten Risiko für Gefäßerkrankungen und Mortalität in Verbindung gebracht. Zusätzlich zur Kinetik der CPP-II-Bildung kann auch die Größe (hydrodynamischer Radius) der im T50-Assay erzeugten CPP-II-Moleküle gemessen werden40,45 und kann zusätzliche prognostische Informationen über das Gefäßrisiko liefern46,47.

Die Annahme eines ernährungsbedingten Ursprungs von CPP wird stark durch die Beobachtung gestützt, dass eine phosphatreiche Ernährung in Tierversuchen mit erhöhten CPM48- und CPP33-Werten in der Umgebung sowie mit einer Verringerung der CPM34- und CPP37-Werte im Serum bei Hämodialysepatienten, die mit intestinalen Phosphatbindern behandelt wurden, verbunden ist. Es fehlen jedoch definitive Beobachtungen der Auswirkung der Mineralstoffaufnahme über die Nahrung auf die akute CPP-Kinetik beim Menschen. Darüber hinaus muss der Einfluss von CKD auf den postprandialen CPP-Metabolismus noch dokumentiert werden. Um diese wichtigen Evidenzlücken zu schließen, führten wir eine kontrollierte Studie über die Auswirkung einer standardisierten Nahrungsaufnahme auf die Serum-CPM-, CPP-I-, CPP-II-, T50- und CPP-II-Größe bei nüchternen Erwachsenen mit normaler oder eingeschränkter Nierenfunktion durch.

Cistanche-Extrakt

Methodik

1. Studienpopulation.

Wir untersuchten 14 Personen mit chronischer Nierenerkrankung und 16 gesunde Kontrollpersonen gleichen Alters und Geschlechts. Um teilnahmeberechtigt zu sein, musste jeder Teilnehmer mindestens 18 Jahre alt sein. Teilnehmer wurden ausgeschlossen, wenn sie: (i) eine Vorgeschichte von Mineralstoff- oder Knochenerkrankungen hatten, die nicht mit einer chronischen Nierenerkrankung in Zusammenhang standen; (ii) mit einem intestinalen Phosphatbinder oder Calcitriol behandelt wurden; oder (iii) eine Magen-Darm-Störung hatte, eine Laktoseintoleranz in der Vorgeschichte hatte oder nicht bereit war, die Studienmahlzeit zu sich zu nehmen. Für die CNI-Gruppe rekrutierten wir sieben Personen mit einer geschätzten glomerulären Filtrationsrate (eGFR) zwischen 30 und 60 ml/min/1,73 m2 und sieben mit einer eGFR<30 mL/min/1.73 m2, excluding participants who required dialysis or with a previous kidney transplant. Healthy controls had no history of chronic medical conditions and had normal kidney function (eGFR>60 ml/min/1,73 m2). Die Studie wurde von der Deklaration von Helsinki durchgeführt.

Alle Personen gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab und die Studie wurde von der örtlichen Ethikkommission (Melbourne Health Human Research Ethics Committee MH2018.363) genehmigt.

2. Vorgehensweise.

Jeder Teilnehmer wurde nach einer Fastennacht untersucht und die Probenentnahme begann zwischen 7.3{7} und 9.30 Uhr. Zu Beginn des Studienzeitraums wurde eine intravenöse Kanüle eingeführt. Vor der Entnahme jeder Blutprobe wurde zunächst eine 5-ml-Entnahme aus der Kanüle verworfen. Zwei anfängliche Nüchternblutproben wurden im Abstand von 30 Minuten entnommen, um die Schwankung der Ausgangswerte zu berücksichtigen. Als „Zeitpunkt 0“ wurden die Mittelwerte dieser beiden Zeitpunkte verwendet. Unmittelbar nach der Entnahme der zweiten Nüchternprobe nahmen die Teilnehmer eine standardisierte Mahlzeit (Sanitarium Up&Go Flüssigfrühstück; 250 ml, Vanillegeschmack) zu sich, die 815 kJ Energie, 300 mg Kalzium und 188 mg Phosphat enthielt (Tabelle 1). Die Teilnehmer wurden angewiesen, das gesamte Getränk innerhalb von 5 Minuten zu konsumieren. Zu fünf postprandialen Zeitpunkten (30, 60, 120, 180 und 240 Minuten) nach Beginn der Mahlzeit wurden serielle Blutproben entnommen. Während des Studienzeitraums durften die Teilnehmer Wasser trinken, jedoch keine anderen Nahrungsmittel oder Getränke zu sich nehmen.

3. Ergebnismaße.

Zur wiederholten Messung neuer Marker des Mineralstoffwechsels (CPM-, CPP-I-, CPP-II-, T50- und CPP-II-Größe) wurde zu jedem Zeitpunkt Blut gesammelt. Aufgrund seiner Rolle als wichtigstes mineralbindendes Protein in CPM und CPP wurde zu jedem Zeitpunkt Fetuin-A gemessen. Wir haben außerdem zu jedem Zeitpunkt Serumphosphat, Gesamtkalzium, Magnesium, Albumin und Bicarbonat sowie zu drei Zeitpunkten ({{12 }}, 120 und 240 Min.). Serumcitrat wurde nach 0, 30 und 60 Minuten gemessen. Serumharnstoff, Kreatinin und 1,25-Dihydroxy-Vitamin D wurden einmal zu Beginn des Fastens (0 Minuten) gemessen. Blutproben für neuartige Marker des Mineralstoffwechsels, PTH, iFGF23, 1,25-Dihydroxy-Vitamin D und Serumcitrat, wurden vor der Zentrifugation 30 Minuten lang gerinnen gelassen, und dann wurden Serumaliquots bis zur Chargenanalyse bei –80 Grad gelagert. Alle anderen biochemischen Messungen wurden zum Zeitpunkt der Probenentnahme unter Verwendung von Standardlabormethoden durchgeführt.

4. Gelfiltration und durchflusszytometrische Tests für CPM und CPP.

Wir verwendeten zwei komplementäre Tests, um verschiedene Fraktionen des zirkulierenden CPP-Pools zu quantifizieren. Beide Tests verwenden das fluoreszenzmarkierte Bisphosphonat-Derivat OsteoSense 680EX (Perkin Elmer), das spezifisch an Festphasen-Calciumphosphat und bevorzugt an kristalline Phasen (z. B. Hydroxylapatit) bindet. Die „Gelfiltration“-Methode von Miura et al.32 wurde verwendet, um kleine (<50 nm diameter), low-density mineral-laden fetuin-A colloids. Briefly, frozen serum samples were thawed for 24 h at 25 °C to induce aggregation of CPM and phase transition to crystalline calcium phosphate. Samples were then centrifuged for 30,000g for 2 h at 4 °C to remove larger CPP-I and CPP-II, leaving less dense crystal-laden fetuin-A monomer and multimers for staining with OsteoSense (0.5 µM) in HEPES-buffered DMEM (pH 8.0). Unbound dye was subsequently removed by gel filtration (Micro Bio-Spin® Columns with Bio-Gel® P-30, Bio-Rad) and the resultant fluorescence was measured using an infrared scanner (Odyssey CLx, LI-COR; EX 685 nm, EM 700 nm). Miura and colleagues32 referred to the mineral detected as low-density (L)-CPP, however, here we refer to them as CPM to reflect the origin of this mineral fraction in vivo. In our hands, the mean interassay analytical coefficient of variation (CVA) for the CPM assay was 4.9%.

Für die durchflusszytometrische Analyse wurden Aliquots des gefrorenen Serums unter Verwendung der zuvor beschriebenen standardisierten Verfahren verarbeitet50. CPP-I und CPP-II wurden wie zuvor beschrieben unter Verwendung eines BD FACSVerse-Durchflusszytometeraufbaus zur Partikelauflösung gemessen<200 nm from the background and operate with fluorescence triggering on OsteoSense-positive events33,37. In this assay, CPP is distinguished from membrane-delimited mineral-containing extracellular vesicles using phosphatidyl serine–binding cadherin-FITC (Haematologic Technologies Inc., Essex Junction, VT). CPP-I and CPP-II were distinguished by differences in side scatter (SSC) intensity (related to particle size) and OsteoSense fluorescence intensity. Interassay CVA for CPP-I and CPP-II were<15% and<10%, respectively.

5. Andere Mineralmarker.

Serum T50 wurde von Caldiscon AG, Biel, Schweiz, wie zuvor beschrieben mit einem Nephelostar-Nephelometer (BMG Labtech, Ortenberg, Deutschland)40 gemessen. Der mittlere Interassay-CVA für T50 betrug 3,4 Prozent. Der hydrodynamische Radius von CPP-II wurde durch dynamische Lichtstreuung mit einem DynaPro Plate Reader II (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA) gemessen, wie von Chen et al.47 beschrieben. Der Interassay-CVA für die CPP-II-Größe betrug 4 Prozent. Kommerzielle Immunoassays wurden verwendet, um iFGF23 (Kainos Laboratories, Tokio, Japan), 1,25 Dihydroxy Vitamin D Immunodiagnostic Systems, Boldon, UK) und Fetuin-A (R&D Systems, Minneapolis, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers zu messen. Der mittlere Interassay-CVA betrug 3,8 Prozent, 5,5 Prozent bzw. 3,2 Prozent. Serumcitrat wurde mithilfe eines kolorimetrischen Tests (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Deutschland) mit einem mittleren CVA zwischen den Tests von 3,5 Prozent gemessen.

6. Statistische Analyse.

Using GLIMPSE, a validated linear mixed model power and sample size calculator51, we estimated that 10 participants would provide>90 Prozent Leistung zur Erkennung einer Verdoppelung des CPP in der postprandialen Periode mit einer Typ-I-Fehlerrate von 0,05. Die Studie war nicht darauf ausgelegt, einen Unterschied zwischen den Gruppen festzustellen.

Demografische und biochemische Daten zum Fasten wurden zwischen den Gruppen unter Verwendung eines ungepaarten T-Tests oder Kruskal-Wallis-Tests für normale bzw. verzerrte kontinuierliche Variablen und eines Chi-Quadrat-Tests für kategoriale Variablen verglichen.

Unser Ziel war es, die postprandiale Reaktion innerhalb und zwischen der Gruppe für jeden wiederholten Parameter zu beschreiben. Zu diesem Zweck haben wir für jeden Parameter lineare Mixed-Effects-Modelle (LMM) angepasst, wobei wir einen eingeschränkten Maximum-Likelihood-Ansatz und eine unstrukturierte Kovarianzmatrix52 verwendeten. Für jedes LMM modellierten wir Gruppe, kategoriale Zeit und gruppenweise Interaktion als feste Effekte, und für jeden Teilnehmer wurde ein zufälliger Schnittpunkt einbezogen, um die Korrelation wiederholter Messungen zu berücksichtigen. Als Referenzwerte für die Gruppe bzw. die Zeit wurden die Kontrollgruppe und die Zeit „0“ verwendet. Koeffizientenschätzungen für gruppenweise Interaktionsterme wurden verwendet, um Unterschiede in der postprandialen Reaktion zwischen der CKD- und der Kontrollgruppe zu testen. Nach der Anpassung jedes LMM führten wir auch post-hoc-paarweise Vergleiche durch, um Unterschiede in den Mittelwerten zwischen den Gruppen zu jedem Zeitpunkt zu testen und um Abweichungen von der Nüchtern-Grundlinie innerhalb jeder Gruppe zu testen. Für diese paarweisen Vergleiche haben wir die Bonferroni-Korrekturmethode verwendet, um mehrere Vergleiche auszugleichen. CPM, CPP-I, CPP-II, CPP-II-Größe, PTH und iFGF23 wurden vor dem Anpassen von LMMs auf natürliche Weise logarithmisch transformiert, um eine normale Verteilung der Residuen sicherzustellen. Um die Interpretation zu erleichtern, wurden die Koeffizientenschätzungen für Interaktionsterme aus diesen Modellen dann potenziert, um Schätzungen der prozentualen Änderung abzuleiten. Für das LMM von CPM deuten gruppenweise Interaktionsterme auf einen signifikanten Unterschied in der postprandialen Reaktion zwischen den Gruppen hin. Um die Auswirkung der Nierenfunktion auf die postprandialen CPM-Werte weiter zu untersuchen, berechneten wir auch die Fläche unter der Kurve (AUC) für CPM mithilfe der kubischen Spline-Methode (Zeit 0 bis 240 Minuten) und untersuchten die Beziehung zwischen eGFR , AUC und maximale CPM-Konzentration (unter Verwendung der Spearman-Rangkorrelation) sowie zwischen CKD und dem Zeitpunkt der maximalen CPM-Konzentration (unter Verwendung des Chi-Quadrat-Tests).

Mehrere Proben wiesen nicht nachweisbare Mengen an CPP-I (2 Proben in der Kontrollgruppe und 6 in der CKD-Gruppe) oder CPP-II (5 in der Kontrollgruppe und 10 in der CKD-Gruppe) auf. Für die Hauptanalysen wurde die untere Quantifizierungsgrenze des Assays (133 Partikel/ml) für diese linkszensierten Werte verwendet. Um mögliche Verzerrungen durch diesen Ansatz zu ermitteln, führten wir eine Sensitivitätsanalyse durch, bei der die LMMs für CPP-I und CPP-II nach Imputation lefzensierter Werte mithilfe einer mehrstufigen Tobit-Regression neu angepasst wurden, wobei Zeit und Gruppe als unabhängige Variablen eingegeben wurden 53.

Zweiseitige p-Werte<0.05 were considered significant. All data were analyzed using Stata MP version 17.0 (StataCorp, College Station, USA) and figures were produced using GraphPad Prism version 9.2.0 (GraphPad Sofware, San Diego, USA).

Herba Cistanche

Diskussion

Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Studie, die über einen signifikanten postprandialen Effekt der Nahrungsaufnahme auf die Serumspiegel von CPM, CPP-I und CPP-II beim Menschen berichtet. Diese Wirkungen traten häufig bei Personen mit normaler und eingeschränkter Nierenfunktion auf; Allerdings war die postprandiale Abweichung des Serum-CPM bei CKD-Teilnehmern viel ausgeprägter. Wir fanden auch einen frühen und vorübergehenden postprandialen Effekt auf T50, der unabhängig von der Nierenfunktion vorhanden war und mit einem gleichzeitigen Anstieg des Serum-Fetuin-A einherging.

Unsere Ergebnisse stimmen mit der Annahme überein, dass die intestinale Absorption einer Nahrungsmineralbelastung direkt zur Bildung von zirkulierendem CPM, CPP-I und CPP-II führen kann. Dies wurde bereits früher vorgeschlagen10,15,16, basiert jedoch größtenteils auf Tierdaten33,48. Im Gegensatz dazu waren die Beweise beim Menschen indirekt und stammten aus Studien zu intestinalen Phosphatbindern bei Hämodialyse-abhängigen CKD-Patienten34,37,55. Eine kleine Studie von Yamada et al. deuteten auf eine tageszeitliche Schwankung des Serum-CPP mit postprandialen Spitzen hin. In dieser Studie wurde jedoch eine ältere Testtechnik verwendet, mit der CPM und CPP-Unterarten nicht getrennt quantifiziert werden konnten, und alle Teilnehmer wurden wegen der Behandlung von instabilem Diabetes ins Krankenhaus eingeliefert56. Im Gegensatz dazu waren alle Teilnehmer dieser Studie klinisch stabil, und soweit uns bekannt ist, haben wir zum ersten Mal gezeigt, dass postprandiale Exkursionen nicht nur bei Personen mit chronischer Nierenerkrankung, sondern auch bei gesunden Erwachsenen beobachtet werden, was diese Rolle untermauert der CPM- und CPP-Bildung in der normalen physiologischen Reaktion auf die Nahrungsaufnahme.

Anstiege der CPM- und CPP-Werte im Serum wurden selbst nach relativ geringen und physiologisch relevanten Nährstoffmineralienbelastungen beobachtet (Tabelle 1). Im Gegensatz dazu gab es bei den konventionelleren Markern des Mineralstoffwechsels nur minimale postprandiale Schwankungen. Frühere Studien haben ebenfalls eine begrenzte postprandiale Abweichung des Phosphatspiegels gezeigt7,57, es sei denn, die Probanden wurden einer hohen pharmakologischen Belastung ausgesetzt58,59. Im Gesundheitszustand wird das Gesamtphosphat im Körper so reguliert, dass die Nettoabsorption im Darm mit der Ausscheidung über den Urin übereinstimmt8. Diese Reaktion tritt jedoch nicht sofort ein, und es kann eine Verzögerung von mehreren Stunden auftreten, bevor es zu einer Steigerung der Phosphatausscheidung im Urin kommt, selbst wenn die Phosphatbelastung intravenös verabreicht wird8. Stattdessen haben Tiermodelle gezeigt, dass andere, nicht-renale Mechanismen dazu dienen, die Serumionenkonzentrationen über die Verteilung auf Knochen und andere Gewebe stärker aufrechtzuerhalten59–61. Es ist plausibel, dass die Bildung von CPM und CPP ein wichtiges zusätzliches temporäres Depot für Phosphat (und Kalzium) darstellt, das lokale Mineralstoffbelastungen, beispielsweise aus dem Magen-Darm-System, akut puffern kann14. Aufgrund der physikalisch-chemischen Eigenschaften von CPM und CPP können potenziell große Mengen ansonsten unlöslicher Mineralien im Kreislauf vorhanden sein, ohne dass die Gefahr einer Ausfällung besteht, was angeblich den sicheren Transport von Mineralien in großen Mengen zu Verwendungs- oder Freigabeorten erleichtert.

Wir beobachteten einen vorübergehenden Anstieg des Serum-Fetuin-A in der CNI-Gruppe. Im Gegensatz dazu schien Fetuin-A in den Kontrollen stabil zu sein. Wenn jedoch paarweise Vergleiche ohne Korrektur für mehrere Vergleiche wiederholt wurden, kam es bei den Kontrollen zu signifikanten Anstiegen nach 30 und 60 Minuten (Ergänzungstabelle S8), was darauf hindeutet, dass wir möglicherweise nicht ausreichend für die Erkennung waren ein zugrunde liegender Effekt. Abgesehen davon, dass es sich um einen negativen Akute-Phase-Reaktanten handelt, dessen Spiegel als Reaktion auf akute und chronische Entzündungen stark unterdrückt werden62, ist wenig über andere Mechanismen bekannt, die die hepatische Synthese und Sekretion von Fetuin-A direkt regulieren, und es gibt nur wenige frühere Daten über tägliche, oder akute postprandiale Variation bei jeder Art. Angesichts des beobachteten Anstiegs des Serum-Fetuin-A nach der Nahrungsaufnahme, insbesondere in der CNI-Gruppe, und der erforderlichen Rolle von Fetuin-A bei der CPM- und CPP-Bildung ist es interessant zu überlegen, ob die Nahrungsaufnahme möglicherweise über einen noch unbekannten Mechanismus „gespürt“ wird. Dies führt zur hepatischen Freisetzung von FetuinA, die mit einem Zustrom von Mineralien aus dem Darm einhergeht. Tatsächlich haben Uedono et al. haben kürzlich vorgeschlagen, dass CPP selbst ein Auslöser für die Fetuin-A-Expression in kultivierten Hepatozyten sein könnte63. Daher erfordern die Mechanismen, die die Freisetzung von Fetuin-A steuern, und ihre Reaktion auf die Mineralbeladung weitere Untersuchungen.

T50 ist eine funktionelle Bewertung der Fähigkeit des Serums, der Bildung von CPP-II ex vivo zu widerstehen. Dabei handelt es sich um eine Kombination aus verschiedenen verstärkenden (einschließlich Calcium und Phosphat) und hemmenden (einschließlich Fetuin-A, Albumin, Magnesium, Citrat und Bicarbonat) Verkalkungsfaktoren40. Wir beobachteten einen frühen, aber vorübergehenden Anstieg von T50. Dies wurde in beiden Gruppen beobachtet, aber in der CNE-Gruppe fiel der Höhepunkt mit einem Anstieg des Serum-Fetuin-A zusammen. Darüber hinaus korrelierte die Veränderung von T50 gegenüber dem Ausgangswert bei allen Teilnehmern sehr eng mit der Veränderung von Serum-Fetuin-A (ergänzende Abbildung S2), was darauf hindeutet, dass Fetuin-A der Hauptfaktor sein könnte, der den beobachteten Veränderungen von T50 zugrunde liegt. Tatsächlich fanden wir keine entsprechenden frühen postprandialen Veränderungen bei anderen bekannten Modulatoren von T50 (Serumphosphat, Kalzium, Bicarbonat, Magnesium oder Albumin), obwohl dies subtilere Veränderungen bei einem oder einer Kombination dieser Faktoren nicht ausschließt . Beispielsweise war nach 120 Minuten eine positive gruppenweise Wechselwirkung für Serumbikarbonat in der CKD-Gruppe vorhanden, die sich mit dem Anstieg von T50 überschnitt. Was Fetuin-A betrifft, gab es auch eine Korrelation zwischen der Änderung von Bikarbonat und T50 gegenüber dem Ausgangswert (ergänzende Abbildung S4), obwohl diese im Vergleich zur Korrelation mit ersterem relativ schwach war (r=0.385 vs. r=0.839). Dennoch ist die postprandiale „alkalische Flut“ ein anerkanntes Phänomen und es ist plausibel, dass mehrere Faktoren zu den beobachteten postprandialen Veränderungen bei T5064 beigetragen haben. Die Studienmahlzeit enthielt auch eine überraschende Menge Citrat (~16 mM), ein bekanntermaßen wirksamer Inhibitor der CPP-Bildung. Obwohl in der CKD-Gruppe ein geringer Anstieg des Serumcitrats zu verzeichnen war, stimmte diese Veränderung jedoch nicht mit den beobachteten Veränderungen überein T50, noch gab es in beiden Gruppen eine allgemeine Korrelation zwischen der Veränderung von T50 und dem Serumcitrat. Andere zuvor beschriebene Modulatoren von T50, wie Pyrophosphat und Zink, wurden in dieser Studie nicht gemessen. Obwohl diese oder andere noch unbekannte Faktoren möglicherweise auch zum beobachteten postprandialen Anstieg von T50 beigetragen haben, stellen wir fest, dass im Allgemeinen recht erhebliche Konzentrationsänderungen dieser kleinen anorganischen Moleküle erforderlich sind, um einen signifikanten Einfluss auf T5065 zu haben. Im Gegensatz zu den postprandialen Effekten auf T50 blieb der hydrodynamische Radius von CPP-II in beiden Gruppen scheinbar unverändert.

Cistanche-Kapseln

Während in beiden Gruppen postprandiale CPM-Exkursionen beobachtet wurden, waren die CPM-Werte in der CKD-Gruppe zu jedem der Zeitpunkte durchweg höher, und Interaktionsterme für jede Gruppe deuteten darauf hin, dass das Ausmaß der postprandialen Reaktion deutlich größer war bei CKD-Teilnehmern als bei Kontrollpersonen. Dementsprechend gab es in der explorativen Analyse eine starke Korrelation zwischen eGFR und CPM AUC und der maximalen Konzentration. Spitzenwerte von CPM traten tendenziell auch später in der CNI-Gruppe auf. Theoretisch könnten diese Unterschiede auf eine erhöhte CPM-Produktion nach Nahrungsaufnahme und/oder eine beeinträchtigte Fähigkeit zur CPM-Beseitigung bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung hinweisen. Letzteres wird durch aktuelle Daten von Koeppert et al. gestützt, die mithilfe von Live-Zwei-Photonen-Mikroskopie zeigten, dass zirkulierendes CPM bei Mäusen überwiegend durch glomeruläre Filtration entfernt wird29. Eine vernünftige Vorhersage könnte daher sein, dass die Fähigkeit, CPM zu löschen, mit abnehmender GFR beeinträchtigt wird. Allerdings treten bei chronischer Nierenerkrankung auch häufig Veränderungen in anderen Aspekten der Mineralstoffhomöostase auf, darunter der Knochenumsatz66 und die verzögerte renale Ausscheidung akuter Phosphatbelastungen7,59, die durchaus zu einem Anstieg der postprandialen Werte beigetragen haben könnten. Jüngste Erkenntnisse haben die seit langem vertretene Annahme in Frage gestellt, dass CKD die Nettoabsorption von Phosphat im Darm beeinflusst57,67,68. Wir stellten jedoch fest, dass sechs der 14 Personen in der CNE-Gruppe Cholecalciferol einnahmen. Unter Berücksichtigung der möglichen stimulierenden Wirkung von Vitamin D auf die mineralische Absorption im Darm führten wir eine Ad-hoc-Explorationsanalyse durch, um zu testen, ob die Verwendung von Vitamin D in der Nahrung die akute Reaktion von CPM, CPP-I und CPP-II auf die Nahrungsaufnahme beeinflusst (Ergänzungstabellen). S9–S11). Abgesehen von einer einzigen positiven gruppenweisen Interaktion für CPP-I nach 30 Minuten bei denjenigen, die Cholecalciferol einnahmen, waren alle anderen Interaktionsterme und post-hoc-paarweisen Vergleiche für CPM, CPP-I und CPP-II nicht signifikant, was darauf hindeutet, dass Cholecalciferol Es war unwahrscheinlich, dass die Anwendung einen wesentlichen Einfluss auf die postprandiale CPM/CPP-Kinetik hatte. Während die geringe Probengröße und die Möglichkeit von Verwechslungen möglicherweise keine endgültigen Schlussfolgerungen ausschließen, kann die fehlende Wirkung auch darauf zurückzuführen sein, dass die Phosphatabsorption über den parazellulären Weg überwiegt, wenn das Mineral reichlich vorhanden ist, was nicht aktiv durch die Vitamin-D-Achse reguliert wird69.

Im Gegensatz zu CPM beobachteten wir weder bei CPP-I noch bei CPP-II einen starken Effekt auf die Nierenfunktion. Im Gegensatz zu CPM wird zirkulierendes CPP hauptsächlich durch nicht-renale Mechanismen aus dem Blutkreislauf entfernt. Tier- und In-vitro-Modelle deuten auf eine schnelle Clearance von CPP-I vorwiegend durch sinusoidale Endothelzellen der Leber28 und von CPP-II durch residente Makrophagen der Leber und Milz70 hin. Es ist plausibel, dass die Teilnehmer unserer CKD-Gruppe zwar Hinweise auf einen veränderten CPM-Metabolismus zeigten, diese diskreten CPP-Clearance-Wege jedoch ausreichten, um normale postprandiale CPP-Profile aufrechtzuerhalten. Basierend auf früheren Studien hatten wir damit gerechnet, dass die CKD-Gruppe im Vergleich zu den Kontrollpersonen deutlich höhere CPP-Werte aufweisen würde, obwohl diese Studien Patienten mit fortgeschrittener CKD einschlossen, die dialysepflichtig waren33 oder die ältere und indirekte Methode der CPP-Messung verwendeten20,23. Personen mit fortgeschrittener CKD als die hier untersuchten Personen weisen möglicherweise größere Unterschiede im Nüchtern- und postprandialen CPP-Spiegel auf. Die fehlende CPP-Trennung zwischen unserer CKD- und Kontrollgruppe kann auch auf unsere begrenzte Teilnehmerzahl zurückzuführen sein, die auch unsere Fähigkeit einschränkte, formal auf einen Effekt des CKD-Stadiums zu testen (ergänzende Abbildung S6). Tatsächlich basierte unsere Studie auf der Untersuchung postprandialer Reaktionen und nicht auf Unterschieden zwischen Gruppen. Bemerkenswert ist, dass CPP-I bei den Kontrollpersonen offenbar früher auf das Nüchternniveau zurückkehrte als bei CKD-Teilnehmern, und es gab eine positive Gruppen-zu-Zeit-Interaktion für CPP-II bei CKD-Teilnehmern nach 120 Minuten. Beide Ergebnisse deuten möglicherweise darauf hin, dass wir in einer größeren Kohorte möglicherweise stärkere Effekte zwischen den Gruppen beobachtet haben. Eine höhere analytische Ungenauigkeit bei durchflusszytometrischen CPP-Messungen könnte ebenfalls zu den Nullergebnissen beigetragen haben.

Unsere Studie liefert nicht nur neue Einblicke in die Physiologie des CPM- und CPP-Stoffwechsels, sondern ist auch von direkter Relevanz für die Optimierung der Verwendung dieser neuartigen Marker des Mineralstoffwechsels in zukünftigen Studien. Während sich jeder dieser neuartigen Tests in der frühen klinischen Arbeit als vielversprechend erwiesen hat, haben nur sehr wenige Studien über den Nüchtern-/Absorptionsstatus berichtet43 oder ihn kontrolliert46,56. In dieser Studie hatten mehrere Personen während des Fastens und der frühen postprandialen Phase nicht nachweisbare CPP-I- oder CPP-II-Spiegel, und dieser tiefgreifende Effekt des Fastens auf den Serum-CPP ist an sich schon eine bisher nicht berichtete und bemerkenswerte Finanzierung. Im Gegensatz dazu waren die CPM-Werte im Nüchternzustand messbar und in der CKD-Gruppe signifikant höher als in der Kontrollgruppe, was darauf hindeutet, dass anhaltende CPM-Erhöhungen sich bei Patienten mit nicht dialysepflichtiger CKD nicht unbedingt in erhöhten CPP-Werten manifestieren müssen.

Frühere epidemiologische Studien haben auf Zusammenhänge zwischen erhöhten CPM- und CPP-Werten und einer Reihe von Ersatzmarkern für Gefäßerkrankungen21,23,24 sowie mit kardiovaskulären Ereignissen25 und der Gesamtmortalität22 hingewiesen. Darüber hinaus haben Laborstudien plausible Mechanismen geliefert, durch die CPP diese pathologischen Gefäßergebnisse vermitteln kann26–28. Während In-vitro-Studien darauf hindeuten, dass viele dieser Toxizitäten dosisabhängig hervorgerufen werden, wenn CPP tatsächlich eine normale physiologische Rolle für die Gesundheit spielt, ist unklar, ab wann diese Partikel schädlich werden können. Das hier offenbarte Wissen über die Auswirkung der Nahrungsaufnahme auf die CPP-Kinetik könnte sich als entscheidend für das weitere Verständnis dieses Prozesses erweisen. Eine Schwellenkonzentration für das Einsetzen pathologischer Wirkungen von CPM und CPP kann (zumindest anfänglich) in vivo erst im postprandialen Zustand erreicht werden. In diesem Fall könnten dynamische Tests der postprandialen Reaktion zusätzliche Möglichkeiten bieten, frühere Manifestationen eines gestörten Mineralstoffwechsels sowie das Risiko einer damit verbundenen Gefäßerkrankung zu bewerten. Eine weitere wichtige Möglichkeit besteht darin, dass die Zusammensetzung und damit die intrinsische Toxizität von CPP-I und CPP-II je nach Gesundheit und CKD unterschiedlich sind45.

Cistanche-Ergänzung

Einschränkungen

Wir erkennen an, dass diese Studie mehrere Einschränkungen aufweist, einschließlich der bereits erwähnten begrenzten Patientenzahlen. Bemerkenswerterweise haben wir auch eine standardisierte Mahlzeit verwendet, die nach einer Fastennacht über Nacht eingenommen wurde, und können daher nichts über die Wirkung unterschiedlicher Mahlzeitenzusammensetzung oder die Wirkung nachfolgender Mahlzeiten sagen, die über den Rest des Tages verteilt eingenommen wurden. Wir wählten die Mahlzeit aufgrund ihrer kommerziellen Verfügbarkeit aus, was eine Standardisierung zwischen den Teilnehmern ermöglichte und weil sie physiologisch relevante Nährstoffbelastungen darstellte (Tabelle 1). Es ist jedoch möglich, dass bei einer Belastung der Teilnehmer mit größeren Mineralstoffmengen eine weitere Trennung zwischen Teilnehmern mit normaler und eingeschränkter Nierenfunktion erkennbar gewesen wäre. Da wir Einzelpersonen nur vier Stunden nach der Mahlzeit beobachteten, ist es ebenfalls denkbar, dass die kumulative Wirkung nachfolgender Mahlzeiten die Gruppen ebenfalls weiter unterschieden hat.

Wir haben weder Kot noch Urin wiedergewonnen und können daher keine Angaben zu den gesamten während der Studie aufgenommenen oder ausgeschiedenen Mineralien machen. Wir gehen davon aus, dass die Veränderungen der einzelnen Messwerte nach der Fütterung in direktem Zusammenhang mit der Nahrungsaufnahme stehen. Diese Annahme wird indirekt durch detaillierte bildgebende Untersuchungen gestützt, die den Fluss von Kalzium- und Phosphationen nach der Nahrungsaufnahme zeigen57, sowie durch direkte Beweise aus Tierversuchen, die zeigen, dass eine akute orale Sondenernährung von Mäusen mit einer gepufferten Phosphatlösung zu Serumspitzen im CPM/CPP führt48. Dennoch haben wir die Teilnehmer nicht über längere Zeiträume hinweg beobachtet und können daher nicht ernährungsbedingte Tagesschwankungen bei keinem der untersuchten Parameter schlüssig erklären. Wir hatten jedoch zwei Fastenproben, deren Durchschnitt als „Zeit 0“ verwendet wurde, und die Variabilität zwischen diesen Fastenproben war im Vergleich zum Ausmaß der Veränderungen, die in der postprandialen Periode beobachtet wurden, trivial.

Wir haben die Bonferroni-Methode verwendet, um die mehreren paarweisen Post-hoc-Vergleiche zwischen und innerhalb von Gruppen für jeden Parameter zu berücksichtigen. Dies ist zweifellos ein konservativer Ansatz, der unseres Wissens nach in keiner anderen ähnlichen Fütterungsstudie zum postprandialen Mineralstoffwechsel übernommen wurde. Wir haben diesen Ansatz angesichts der großen Anzahl an Zeitpunkten und Vergleichen gewählt und festgestellt, dass es besser ist, sich auf die robustesten und signifikantesten Signale zu konzentrieren. Allerdings sind uns dadurch möglicherweise kleinere, aber potenziell relevante Effekte entgangen. Aufgrund der Wahrscheinlichkeit voneinander abhängiger physiologisch verknüpfter Veränderungen haben wir keine Korrektur für mehrere Tests verschiedener Mineralparameter vorgenommen.

Cistanche tubulosa

Abschluss

Unsere Studie hat zum ersten Mal gezeigt, dass die Aufnahme von Nahrungsmineralien zur Bildung von CPM und CPP im Blut als normale physiologische Reaktion auf die Nahrungsaufnahme führt. Diese Ergebnisse untermauern die Hypothese, dass die Bildung von CPM/CPP zum Aufbau postprandialer Mineralstoffmengen beiträgt und als temporärer zirkulierender Speicher für Calciumphosphate in großen Mengen fungiert, die letztendlich zur Nutzung/Speicherung (z. B. als Mineralvorläufer für die Knochenmineralisierung) oder zur Ausscheidung bestimmt sind. Wir beobachteten außerdem höhere Serum-CPM-Spiegel im Nüchternzustand und eine stärkere postprandiale Reaktion bei Patienten mit eingeschränkter Nierenfunktion, was darauf hindeutet, dass der CPM-Metabolismus bei CKD offensichtlich verändert ist. Die Analyse des postprandialen Umgangs mit CPM/CPP könnte neue Einblicke in die Mechanismen liefern, die eine übermäßige Kalzium- und Phosphataufnahme über die Nahrung mit einem erhöhten Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen bei Patienten mit eingeschränkter Mineralausscheidung verbinden. Im weiteren Sinne unterstreichen diese neuen Erkenntnisse den wichtigen, aber oft vernachlässigten Beitrag der kolloidalen Biochemie zur Mineralhomöostase.

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1 Abteilung für Nephrologie, The Royal Melbourne Hospital, Grattan Street, Parkville, VIC 3052, Australien.

2 Department of Medicine (RMH), University of Melbourne, Parkville, Australien.

3 Caliscon AG, Biel, Schweiz.

4 Lindenhofspital Bern, Bern, Schweiz.

5 Abteilung für Physiologie und Pathophysiologie, Johannes Kepler Universität, Linz, Österreich.