Wirkungen von Cistanche-Glycosiden auf die synaptische morphologische Plastizität bei Seneszenz-beschleunigten Mäusen
Mar 11, 2022
Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com
LIAN Juanqi1, WANG Lu2, ZHAO Fujun3, LIN Shuai3, YAN Xusheng4, JIA Jianxin4, CAI Zhiping4
(1. Klasse 2014 der Graduiertenschule des Baotou Medical College, Baotou 014060, China)
(2. Klasse 12 der Klasse 2015 Klinische Medizin am Baotou Medical College)
(3. Klasse 1 der Klasse 2013 Forensische Medizin am Baotou Medical College)
(4. Abteilung für menschliche Anatomie des Baotou Medical College)
ABSTRAKT
Zielsetzung: Um die Wirkung von zu untersuchenGlykoside vonZistanche (GCs) über die synaptische Plastizität von Hippocampus-Neuronen in seneszenzbeschleunigten Mäusen anfällig 8 (SAMP8).Methoden: 40-Mäuse wurden zufällig in Kontrollgruppe, Vehikelgruppe, Gruppe mit niedriger Dosis (verabreichte GCs 2,5 mg/kg ·d), Gruppe mit mittlerer Dosis (verabreichte GCs 5,0 mg/kg) eingeteilt d) und Hochdosisgruppe (verabreichte GCs 10,0 mg/kg · d). Die Mäuse in der Kontrollgruppe erhielten keine Intervention; diejenigen in den verabreichten Gruppen und die Vehikelgruppe wurden einer intraperitonealen Verabreichung (GCs/Kochsalzlösung) oder Kochsalzlösung für 30 Tage unterzogen. Die Anzahl normaler Pyramidenneuronen in der hippocampalen CA1-Region wurde durch Nissl-Färbung gezählt; die Anzahl der dendritischen Stacheln in Synapsen wurde durch Golgi-Färbung gezählt, und die Proteinexpression von PSD-95 wurde durch Immunhistochemie quantifiziert.Ergebnisse: Verglichen mit denen in der Kontrollgruppe erhöhten GCs signifikant die Anzahl normaler Pyramidenneuronen in der CA1-Region des Hippocampus (P<0.05) and="" increased="" the="" number="" of="" dendritic="" spines="" in="" synapses="" (p=""><0.05). the="" expression="" levels="" of="" psd-95="" in="" administered="" groups="" were="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.05), and="" the="" effect="" in="" the="" middle="" dose="" group="" was="" the="" most="" significant.="">Fazit: GCs können die Überlebensrate hippocampaler Pyramidenzellen verbessern und die synaptische Plastizität verbessern．
SCHLÜSSELWÖRTER: Glycoside von Cistanche (GCs); Seneszenzbeschleunigte Maus; Dendritische Wirbelsäule; PSD－95
Mit der zunehmenden Alterung der gesellschaftlichen Bevölkerung nimmt die Prävalenz vonAlzheimer-Krankheit(AD) hat allmählich zugenommen, was eine schwere Belastung für die Familien und die Gesellschaft der Patienten darstellt
[1]. Die wichtigsten klinischen Manifestationen von AD sind kognitive Beeinträchtigungen und Gedächtnisstörungen, und die wichtigsten Fallmerkmale sind senile Plaques, die durch extrazelluläre Amyloidablagerungen und intrazelluläre neurofibrilläre Verwicklungen gebildet werden[2]. Die Pathogenese der AD ist noch nicht eindeutig. Die pathologischen Veränderungen der Synapsen gelten als neurobiologische Grundlage des AD-Gedächtnisses und der kognitiven Dysfunktion. Abnormale Veränderungen in Synapsen können das Kernglied in der Pathogenese von AD sein. Senescence Accelerated Mouse (SAM) ist eine durch Inzucht gezüchtete alternde Modellmaus. Seine P8-Sublinie hat einheitliche und stabile alterungspathologische Eigenschaften, die sich durch einen fortschreitenden Rückgang des Lernens und des Gedächtnisses und der Erkennung mit zunehmender Anzahl von Monaten manifestieren. Bekannte Funktionsstörungen und pathologische Manifestationen ähneln AD-Patienten, daher sind SAMP8-Mäuse ein ideales Tiermodell, um den Mechanismus von altersbedingtem Lernen und Gedächtnisstörungen zu untersuchen.
Dieser Artikel beabsichtigt, die Zellüberlebensrate zu analysieren, die dendritische Wirbelsäulendichte zu messen und postsynaptische Kompakta zu erkennen, um den möglichen Mechanismus von GCs zu untersuchen(Glykoside vonZistanche)Beeinflussung der synaptischen morphologischen Plastizität von Hippocampus-Neuronen in schnell alternden Mäusen im Hinblick auf die Behandlung von AD-bedingten ErkrankungenZistancheGlykoside(GCs) Die räumliche Lern- und Gedächtnisstörung bietet theoretische und experimentelle Grundlagen.
1 Material und Methoden
1.1 Versuchstiere und Gruppierung 4 0 männliche 10- Monate alte SAMP8-Mäuse (erworben von der Tianjin University of Traditional Chinese Medicine), aufgezogen in einer sauberen Umgebung, Umgebungstemperatur (24,0 ± 1,0) Grad , Feuchtigkeit (50,0 ± 5,0) Prozent , kostenloses Futter und Wasser. Die Tiere wurden zu Beginn des Experiments auf ein Alter von 11 Monaten aufgezogen. Die Tiere wurden zufällig in 5 Gruppen (8 Tiere/Gruppe) eingeteilt: Blindkontrollgruppe (Kontrolle), Lösungsmittelkontrollgruppe (Vehikel),Cistanche Gesamtglykoside(GCs) Niedrigdosisgruppe [2,5 mg/(kg ·d)], Mitteldosisgruppe [5. 0 mg / (kg · d)], Hochdosisgruppe [10.0 mg / (kg · d)]. Tiere in der Kontrollgruppe erhielten keine Intervention. Die Tiere der Niedrigdosisgruppe erhielten GCs 2,5 mg / (kg ·d), die Tiere der Mitteldosisgruppe GCs 5,0 mg / (kg ·d) und die Tiere in die Hochdosisgruppe erhielt GCs. 0 mg/(kg ·d), erhielten die Tiere in der Vehikelgruppe die gleiche Menge an normaler Kochsalzlösung. Kontinuierliche intraperitoneale Injektion von Arzneimitteln oder physiologischer Kochsalzlösung für 30 Tage, 0,5 ml/Tag.
1.2 Probenvorbereitung und -verarbeitung Die Tiere wurden 24 Stunden nach der letzten Verabreichung getötet, betäubt und der Hals wurde getötet. Schneiden Sie die Brusthöhle, um das Herz freizulegen, schneiden Sie das rechte Herzohr, um das Blut herauszulassen, und führen Sie die Perfusionsnadel in den linken Ventrikel ein. Nachdem 100 ml normale Kochsalzlösung infundiert worden waren, wurde 4 Prozent Paraformaldehyd weiter infundiert, bis die Gliedmaßen der Mäuse steif waren. Nehmen Sie das Gehirn und legen Sie es für mehr als 24 Stunden in 4-prozentiges Paraformaldehyd.
1.3 Medikamente und Reagenzien GCs(Glykoside vonZistanche) wurden von der China Academy of Traditional Chinese Medicine gekauft, postsynaptische Dichte －95, PSD －95 wurden von Epitomic gekauft, Coomassie Brilliant Blue CBBG 250 Kit wurde von Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd. Engineering Institute gekauft, DAB Immunhistochemie-Kit wurde von gekauft Peking Zhongshan Jinqiao Biotechnologieunternehmen.
1.4 Nissl-Färbung und Zellzählung 4-prozentige Paraformaldehyd-Fixierung von Hirngewebe für mehr als 24 Stunden, Trimmen und Dehydrieren mit Gradientenalkohol, transparentes Xylol, Wachsimmersion, herkömmliche Paraffineinbettung, 5 μm dicker Serienschnitt. Scheiben schneiden und mit Wasser entwachsen, mit 1 Prozent Toluidinblau bei 37 Grad für 60 min färben, 5 min × 3 Mal waschen, mit 95-prozentigem Alkohol differenzieren, 100-prozentigem Alkohol dehydrieren, transparentes Xylol, mit neutralem Gummi aufziehen, unter dem beobachten Mikroskop. Der CA1-Bereich des gleichen Hippocampus-Schnitts jeder Gruppe wurde zufällig aus 3 Beobachtungsfeldern (× 100) ausgewählt, die Anzahl normaler Pyramidenzellen innerhalb von 1 mm wurde gezählt, und der Durchschnitt wurde zur Analyse genommen.
1.5 Modifizierte Golgi-Färbung Legen Sie das reparierte Hirngewebe in Golgi-Cox-Färbelösung, schützen Sie es 14 Tage lang vor Licht und wechseln Sie die Lösung alle 2 Tage; Legen Sie das Gehirngewebe in 30-prozentige Saccharose und stellen Sie es bei 4 Grad in einen Kühlschrank. Das Gewebe kann nach dem Absinken auf den Boden geschnitten werden; Vibrationsmikrotom zum Schneiden und Färben; Fixierlösung für die Entwicklung; Trocknen der Montageplatte, Beobachten und Auszählen unter dem Mikroskop. Beobachten Sie die Veränderungen in der dendritischen Wirbelsäule der neuronalen Spitze des Hippocampus CA1 und CA3 jeder Gruppe von Mäusen und berechnen Sie die Dichte der dendritischen Wirbelsäule.
1.6 Die immunhistochemischen Schnitte wurden mit Wasser entparaffiniert, mit 3 % H2O2 für 10 Minuten inkubiert, um die endogene Peroxidaseaktivität zu eliminieren, mit destilliertem Wasser für 5 Minuten × 3-mal gewaschen, mit einer Hochdruckmikrowelle repariert, mit PBS für gewaschen 5 Minuten × 3 mal, Ziegenserum wurde für 30 min bei Raumtemperatur blockiert, primärer Kaninchen-anti-Maus-PSD-95-Antikörper wurde tropfenweise über Nacht bei 4 Grad zugegeben, mit PBS für 5 min × gewaschen 3-mal, Biotin-markierter sekundärer Antikörper wurde tropfenweise zugegeben, bei 37 Grad für 2 h inkubiert, mit PBS für 5 min × 3-mal gewaschen, das Meerrettichperoxidase-markierte Streptavidin zugetropft, mit PBS für 5 min × 3-mal gewaschen, mit gewaschen DAB für 2 min, mit Hämatoxylin gegenfärben, mit Gradientenalkohol dehydrieren, mit Xylol transparent machen und eindecken. 1.7 Bildverarbeitung und statistische Analyse. Die gleichen Hippocampus-Querschnitte jeder Gruppe wurden zur Beobachtung ausgewählt. Drei Sichtfelder (× 100) wurden zufällig im CA1-Bereich ausgewählt, um die Anzahl normaler Pyramidenzellen innerhalb von 1 mm zu zählen, und der Durchschnitt wurde analysiert. Die Ergebnisse der Immunhistochemie wurden mit der Bildanalysesoftware IPP 7.0 gemessen. Die experimentellen Daten wurden mit der Software SPSS 17.0 analysiert, und eine Einweg-ANOVA wurde für den paarweisen Mittelwertvergleich mehrerer Stichproben verwendet. P<0.05 was="" considered="" statistically="">
Anti-Alzheimer-Krankheit
2 Ergebnisse
2.1 Die Wirkung der Gesamtglykoside vonZistancheüber die Zählung normaler Pyramidenzellen im Hippocampus von SAMP8-Mäusen Nissl-Färbung Die Ergebnisse der Nissl-Färbung zeigten, dass die Anzahl der Neuronen im CA1-Bereich der Kontrollgruppe abnahm, die Anordnung ungeordnet war und die meisten Zellen eine abnormale Morphologie aufwiesen und Lyse und Nekrose. Die Morphologie der Zellen in den GCs(Glykoside vonZistanche)Gruppe war relativ klar und vollständig, mit einer großen Anzahl sichtbarer Vorsprünge, der Nissl-Körper war violett, die Nukleolen waren tief gefärbt, klar und zentriert, und die Kerne waren nicht gefärbt. Die Zellmorphologie der Vehikelgruppe ist ähnlich der der Kontrollgruppe. Die Zellzählung zeigte, dass die Anzahl normaler Pyramidenneuronen im CA1-Bereich der Verabreichungsgruppe zunahm (P<0.05); the="" difference="" between="" the="" medium="" and="" high="" dose="" groups="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05), the number of normal pyramidal neurons To a certain extent, it shows an upward trend with increasing dose. There was no significant difference in the number of normal pyramidal cells between the vehicle group and the control group (P>0.05). Siehe Tabelle 1.
Tabelle 1 Wirkung von Cistanche-Glycosiden auf Hippocampus-Nis-Färbung von SAMP8-Mäusen, normale Pyramidenzellenzahl und Anzahl dendritischer Stacheln (Stk.)
a wird mit der Kontrollgruppe t=0.193, P=0.582 verglichen; b wird verglichen mit der Kontrollgruppe t=13.621, P=0.008; c wird mit der Kontrollgruppe t=21.798 , P=0.005 verglichen; d wird verglichen mit Kontrollgruppe t=18.326, P=0.006; e wird verglichen mit Kontrollgruppe t=0.244, P=0.463; f wird mit der Kontrollgruppe verglichen. Verglichen mit t=10.903, P=0.010; g wird verglichen mit der Kontrollgruppe t=21.817, P=0.005; h wird mit der Kontrollgruppe t=15.572, P=0 verglichen. 007.
2.2 DieWirkung der Gesamtglykoside vonZistanche auf die Dichte dendritischer Stacheln in SAMP8-Mäusen Golgi-Färbung zeigte, dass die Anzahl dendritischer Stacheln in der Kontrollgruppe abnahm und die Dichte abnahm. Nach der Gabe von GCs an die Tiere nahm die Anzahl und Dichte dendritischer Stacheln zu und es wurde eine große Anzahl von Vorsprüngen gesehen (P=0.048). Es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen der Gruppe mit mittlerer Dosis und der Gruppe mit hoher Dosis (P=0.853). Die Anzahl und Dichte der dendritischen Spine Der Grad zeigt mit zunehmender Dosis einen Aufwärtstrend. Fahrzeuggruppe und Steuerung
Die Anzahl und Dichte dendritischer Stacheln in der Gruppe haben keine statistische Signifikanz (P=0.764). Siehe Tabelle 1.
2.3 Die Wirkung vonCistancheGlykoside auf die Expression von PSD-95 in SAMP8-Mäusen Der immunhistochemische qualitative Nachweis von PSD-95 zeigte, dass die Kontrollgruppe eine geringere Expression von PSD-95 aufwies, die Zellkörperfärbung heller war und die positive Expressionsrate war niedriger. Nach Supplementierung von GCs in vitro färbte sich der Zellkörper tiefer und die Expression und positive Rate von PSD-95 stieg (t=5.751, P<0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" middle-dose="" group="" and="" the="" high-dose="" group="" (t="1.077," p="">0.05). Die Expression von PSD-95 zeigte bis zu einem gewissen Grad mit zunehmender Dosis einen Aufwärtstrend. Fahrzeug
There was no statistically significant difference in PSD-95 expression between the control group and the control group (t = 0.585, P>0.05).
3 Diskussion
PSD-95 ist die Hauptkomponente der postsynaptischen und steht in Zusammenhang mit einer Vielzahl von synaptischen Funktionen, einschließlich Ionenkanälen, synaptischer Aktivität, intrazellulären Signaltransduktionswegen usw. [3]. PSD-95 bündelt verwandte Proteine im NMDA-Rezeptor-Signalweg, um einen Komplex aus Rezeptor-Signalmolekül, Regulationsmolekül und Zielmolekül zu bilden [4], der eine Schlüsselrolle im Signaltransduktionsweg spielt. NMDA-Rezeptoren sind an der Induktion der Langzeitpotenzierung (LTP) in der CA1-Region des Hippocampus und am Lern- und Gedächtnisprozess beteiligt [5]. PSD-95 spielt eine entscheidende regulatorische Rolle in diesem Prozess, und sein Proteingehalt kann als weiterer molekularer Marker zur Messung der synaptischen Plastizität verwendet werden. In unseren bisherigen Studien haben wir bewiesen, dass GCs(Glykoside vonZistanche)kann das Lernen und die kognitive Beeinträchtigung bei SAMP8-Mäusen verbessern, aber wir haben seinen möglichen zellmorphologischen Mechanismus nicht aufgeklärt. Dieses Experiment zielt darauf ab, seinen möglichen zellmorphologischen Mechanismus zu untersuchen.
In diesem Experiment wurde die Überlebensrate von Pyramidenzellen und die synaptische Plastizität in den GCs verbessert(Glykoside vonZistanche)Gruppe war besser als die der Vehikelgruppe und der Kontrollgruppe. Es ist ersichtlich, dass GCs die Morphologie von Pyramidenzellen signifikanter verbesserten. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass höhere Dosen von GCs eine bessere Wirkung entfalten können. Aus dem Vergleich zwischen der mittleren Dosisgruppe und der hohen Dosisgruppe ist ersichtlich, dass sich die Wirkung ab einer bestimmten Dosiskonzentration nicht signifikant ändert. Daher sollte zur Vermeidung von Verschwendung und Nebenwirkungen von GCs bei der Verwendung von GCs die am besten geeignete Konzentration gewählt werden [6].
Frühere Studien haben gezeigt, dass GCs(Glykoside vonZistanche)kann die Lern- und kognitive Beeinträchtigung von SAMP8-Mäusen verbessern, indem es die Überlebensrate von Pyramidenzellen verbessert [7]. Es gibt auch Daten, die darauf hindeuten, dass GCs neurodegenerative Erkrankungen verbessern können, indem sie die Proliferation und Differenzierung neuraler Stammzellen fördern [8-10]. Der Autor glaubt, dass der Mechanismus für GCs zur Verbesserung von AD erreicht werden kann, indem die Plastizität der synaptischen Morphologie verbessert und die Anzahl der Pyramidenzellen beibehalten wird, was die Grundlage für die endgültige Verwendung von GCs bei der Prävention und Behandlung von klinischer AD bildet.
Verweise
[1] Chen Juluo, Chen Xingui, Hu Panpan usw. Alzheimer-Patienten verwenden Funktionen Vorläufige Forschung [J]. Chinese Journal of Behavioral Medicine and Brain Science, 2013, 22 (10): 889-891.
[2] Jin Chunhui, Liu Xiaowei, Yuan Jianmin, et al. Sorting Receptor 1 Gene Single Nucleosid Korrelation zwischen saurem Polymorphismus und sporadischer Alzheimer-Krankheit［J］. Chinese Journal of Behavioral Medicine and Brain Science, 2014, 23 (5): 427-429.
[3] Schliebs R, Arendt T. Die Bedeutung des cholinergen Systems im Gehirn während des Alterns und bei der Alzheimer-Krankheit［J］. Neural Transm, 2006, 113 (11): 1625-1644.
[4] SorianoFX. Spezifisches Targeting von Pro-Death-NMDA-Rezeptorsignalen mit unterschiedlicher Abhängigkeit vom NR2B-PDZ-Liganden［J］． J Neurosci, 2008, 28 (42): 10696-10710.
[5] Selkoe DJ. Lösliche Oligomere des Amyloid-beta-Proteins beeinträchtigen synaptische Plastizität und Verhalten ［J］． Behav Brain Res, 2008, 192 (1): 106 -113.
[6] Huang Zonghui, Chen Guanmin, Zhao Kangtao, et al. Studie zur Toxizität von Cistanche ［J］. China Journal of Hygiene Inspection, 2014, 24 (8): 1098 -1100.
[7] Jia Jianxin, Song Wei, Yan Xusheng, et al. Die Gesamtglykoside von Cistanche haben eine Wirkung auf SAMP8-Mäuse. Der Einfluss und Mechanismus von Inter-Lernen und Gedächtnis［J］. Journal of Baotou Medical College, 2014, 30 (6): 6-8.
[8] Q. Xiao, P. Yan, X. Ma et al. Die Verbesserung der Astrozyten-Lysosomen-Biogenese erleichtert die A-Clearance und dämpft die Amyloid-Plaque-Pathogenese［J］． J Neurosci, 2014, 34 (29): 9607-9620.
[9] Li QJ, Tang YM, Liu J, et al. Behandlung der Parkinson-Krankheit mit neuralen C172-Stammzellen, die NURR1 überexprimieren, mit einem rekombinierten Republik-Defizit-Adenovirus, das das NURR1-Gen enthält［J］. Synapse, 2007, 61 (12): 971-977.
[10] Qin Wei, Wei Wei, Xu Qian, et al. Cistanche auf die Proliferation von C172 neuralen Stammzellen Die Auswirkungen von [J]. Strait Pharmacy, 2015, 27 (12): 263-265.