Wirksamkeit und Mechanismus von Cistanchen Herba-Extrakt bei der Behandlung von Reproduktionsfunktionen bei Ratten mit Nieren-Yang-Mangel basierend auf der Metabolomik
Feb 06, 2025
AbstraktDiese Studie untersucht diereproduktive SchutzwirkungUndPotenzieller Mechanismus von Cistanchen Herba -Extrakt(Che) auf einem Rattenmodell vonNieren-Yang-Mangeldurch Adenin induziert. Die Ratten wurden zufällig in fünf Gruppen unterteilt: Normal, Modell, niedrig dosis che (0. 6 g · kg -1 · d -1), hochdosis che (1,2 g · kg -1} · d {-1) und l-carnitine (100 {100 mg · kg -1 · d -1). Den Ratten wurde Adenin (200 mg · kg -1 · d -1) in den ersten 14 Tagen durch Gavage verabreicht, um einen Nieren -Yang -Mangel zu induzieren und gleichzeitig eine medikamentöse Behandlung zu erhalten. Nach 14 Tagen wurde die Modellierung abgebrochen, aber die medikamentöse Behandlung dauerte 49 Tage. Der Gehalt an Komponenten in CHE wurde durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) analysiert. Das adenininduzierte nieren-yang-Mangelmodell wurde durch Symptomcharakterisierung und Messung von Testosteron (T) -Enspiegeln unter Verwendung eines enzymgebundenen Immunosorbent-Assay-Kits (ELISA) bewertet. Die pathologische Schädigung des Hodens und des Epididymis wurde anhand des Nassgewichts und der Durchführung von Hämatoxylin-Eosin (HE) -Färbung bewertet. Die Spermiendichte und -motilität wurden unter Verwendung der computergestützten Spermienanalyse (CASA) gemessen, und die Lebensfähigkeit der Spermien wurde unter Verwendung von Live/Dead-Spermienfärbungskits bewertet, und die Spermienmorphologie wurde unter Verwendung der Eosinfärbung bewertet, wodurch die Ratten-Spermienqualität bestimmt wurde. Metabolomi Cs wurde verwendetNieren-Yang-Mangel-Syndrom. Im Vergleich zur normalen Gruppe zeigte die Modellgruppe signifikantSymptome von Nieren-Yang-Mangel, reduzierte T -Spiegel, verringerte Feuchtgewichte des Hoden- und epididymalen Feuchtes und signifikante pathologische Schäden an den Hoden und Epididymis. Die Spermiendichte, die Motilität und die Lebensfähigkeit mit erhöhter Spermienabnormalitäten. Im Gegensatz dazu zeigten Ratten, die mit CH behandelt wurden, eine deutliche Verbesserung der Symptome des Nieren-Yang-Mangels, stellten die T-Spiegel wieder her, linderten die pathologischen Schäden an Hoden und Epididymis und verbesserten verschiedene Spermienparameter. Die Ergebnisse der Metabolomik zeigten 286 Differentialmetaboliten zwischen den normalen und Modellgruppen (191 hochreguliert und 95 herunterreguliert). Zwischen dem Modell und niedrig dosierten CH-Gruppen wurden 75 Differentialmetaboliten identifiziert (21 hochreguliert und 54 herunterreguliert). In den drei Gruppen wurden insgesamt 24 gemeinsame Differentialmetaboliten identifiziert, wobei 22 dieser Metaboliten entgegengesetzte Regulierungstrends zwischen den beiden Vergleichsgruppen zeigten. Diese Metaboliten waren hauptsächlich am Linolsäurestoffwechsel, dem Ether -Lipid -Metabolismus sowie Pantothensäure und Coenzym -A -Biosynthese beteiligt, sowie Metaboliten, einschließlich 13- -Hydroperoxylinolsäure (13-} Hpode), Lysophosphatidylinolsäure und Pantethine. Che kann die Symptome von Nieren-Yang-Mangel bei Ratten verbessern, den Schaden zur Fortpflanzungsorganisation lindern und die Spermienqualität verbessern. Die Regulierung des Lipidstoffwechsels kann ein potenzieller Mechanismus sein, durch den CH die Fortpflanzungsfunktion bei Ratten mit verbessertNieren-Yang-Mangel. Zu den potenziellen bioaktiven Verbindungen von CHE gehörenEchinacosid, verbascosid, Salidrosid, Betain und Cistanosid A.
Schlüsselwörter Cistanches Herba -Extrakt; Nieren-Yang-Mangel; Oligasthenospermie; Adenin; Metabolom; Lipidstoffwechsel
Kunden Reiseüber Cistanche zur Verbesserung der Fortpflanzungsfunktion
Nieren -Yang -Mangel -Syndromist eine Art von Mangelkalt-Syndrom, die durch einen Nieren-Yang-Mangel, das Versagen der Erwärmungsfunktion und das Versagen der QI-Transformation verursacht wird. Die moderne Medizin ist der Ansicht, dass es sich um eine Stoffwechselerkrankung handelt, die durch neuroendokrine Störungen, einschließlich der HPG-Achse (Hypothalamic-Hubyary-Gonadal), verursacht wird. Klinische männliche Patienten weisen normalerweise Symptome wie verringerte Libido, niedriges Spermavolumen, Motilität mit geringer Spermien und Schmerzen im unteren Rücken. Schwere Symptome können zu Unfruchtbarkeit und Geburtsfehlern führen [1]. Das Aufwärmen der Niere Yang ist die Kernbehandlungsmethode der traditionellen chinesischen Medizin für männliche Unfruchtbarkeit durch Nieren -Yang -Mangel [2]. Cistanche Deserticola ist der getrocknete fleischige Stamm mit schuppigen Blättern der Pflanze Cistanche Deserticola YCMA der Familie Orobanchaceae. Es hat die Wirkung, Nieren -Yang zu tonifizieren und Essenz und Blut zu profitieren. Es wird oft zur Behandlung von Nieren -Yang -Mangel, -Spotenz und Unfruchtbarkeit eingesetzt [3]. Laut Statistiken ist Cistanche Deserticola auch das am häufigsten verwendete Medikament in nierentonifizierenden und yang-steuerungspflichtigen Vorschriften im Laufe der Zeitalter [4]. Moderne pharmakologische Studien haben bestätigt, dass Extrakte wie Gesamtglykoside und Oligosaccharide von Cistanche Deserticola die Homöostase der HPG-Achse und der Hypothalamus-Pituudeary-Nebennieren-Achse bei Ratten mit Nieren-Yang-Mangel regulieren können [5]. Cistanche Deserticola -Extrakt kann auch die Spermatogenese und sexuelle Funktionsstörungen bei Ratten mit Nieren -Yang -Mangel verbessern [{6-7]. Die potenziellen Mechanismen dieser therapeutischen Wirkungen wurden jedoch nicht eingehend untersucht. Die Metabolomik kombiniert dynamisch Metabolitenveränderungen mit biologischen Prozessen insgesamt und zeigt die Stoffwechsel Natur von physiologischen und Krankheitsprozessen und die pharmakodynamischen Mechanismen von Arzneimitteln. Diese ganzheitliche und dynamische Eigenschaft stimmt mit dem Konzept der traditionellen chinesischen Medizin überein [8]. Daher verwendete diese Studie die Metabolomics -Technologie, um die Wirksamkeit und den Mechanismus des Cistanche -Deserticola -Extrakts bei Reproduktionsfunktionsschäden bei Ratten mit durch Adenin verursachten Nieren -Yang -Mangel zu untersuchen und die moderne wissenschaftliche Konnotation von Cistanche Deserticola bei der Toniifizierung von Nieren Yang zu erklären.
1 Materialien
1.1 Tiere
50 SPF-Note 9- Wochen alte männliche SD-Ratten, die 330-340 G wiegen, wurden von Peking Huafukang Biotechnology Co., Ltd., Lizenznummer SCXK (Beijing) 2019-0008 gekauft. Die Tiere wurden im SPF Animal Room des experimentellen Tierzentrums des Instituts für chinesische Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, mit natürlicher zirkadianer Beleuchtung, ständiger Luftfeuchtigkeit und Temperatur sowie freier Ernährung und Aktivität aufbewahrt. Das Tierversuch hat die ethische Überprüfung des experimentellen Tierschutzes des Instituts für chinesische Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences (ethische Zulassungsnummer 2021b166), bestanden.
1.2 Drogen
Cistanche Deserticola Slices wurden von Peking Tongrentang (Chongwenmen Store), Batch Nummer 1806016, gekauft und von Zhu Jingjing identifiziert, einem Forscher am Institut für chinesische Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, wie das Drockenblätter der Skala -Blätter der Skala -Blätter von Cistanchien, eine Pflanze, die sich mit der Kiste der Kisten der Kiste befindet. Wiegen Sie 500 g Cistanche Deserticola und fügen Sie hinzu
Das 10 -fache der Höhe von 70% Ethanol zu Refluxextrakt für 2,5 h, Filter, das 8 -fache der Höhe von 70% Ethanol zum Rückstand und dem Refluxextrakt für 2,5 h, filtern, die beiden Filtrate kombinieren und den Druck zum Trocknen des kombinierten Extrakts auf Pulver verringern. Die Trockenpulverausbeute beträgt 47%und speichert sie in einem trockenen Zustand.
1.3 Reagenzien
Echinacosid, Verbascosid, Salidrosid, Betaine, Cistancheside A, Tubulosid A und Caffeinsäure wurden von Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd., mit Batchnummern gekauft. JOT -10165, JOT -11356, JOT11627 und JOT -10196; Acetonitril, Methanol und Phosphorsäure des chromatographischen Grades und analytischer Grad wurden von Chengdu Zhongjinlong Technology Development Co., Ltd., mit Batchnummern Sigma-WxBF1922V, Sigma-WxBF2452V und 20240220, Ltd., gekauft. Adenine wurde von Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., mit Chargennummer S18009 gekauft; L-Carnitin (LC) wurde von Shenyang Nr. 1 Pharmaceutical Co., Ltd., mit Chargennummer 210372 gekauft;
Calcein/PI -Zellaktivität und Zytotoxizitätserkennungskits wurden von Peking Biolab Technology Co., Ltd., Batchnummer HR0444, gekauft; Testosteron (T) Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Kit wurde von Wuhan Elaruite Biotechnology Co., Ltd., Batchnummer E-El -0155 C; Ammoniakwasser wurde von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Chargen Nummer 10002108 gekauft; Die Hämatoxylin-Eosin (HE) -Färbungslösung wurde von Peking Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd., Batchnummer BSBA -4025, gekauft.
2.2 Analyse chemischer Komponenten des Cistanche Deserticola -Extrakts
2.2.1 Vorbereitung der Referenzstocklösung
Genau 10,41 mg Salidrosid wiegen, 11,19 mg Echinacosid, 10. erhalten.
2.2.2 Vorbereitung der gemischten Referenzlösung
Präzise Pipette 1 ml Referenzlösung Salidrosid, 5 ml Echinacosid, 2 ml Cistanchesid A, 100 & mgr; l Tubulossid A, 350 & mgr; l Verbascosid und 100 & mgr; l, 100 & mgr; l Kaffeesäure in die gleiche 25 -ml -Volumendrask, um Wasser zu verdünnen. Genau 12,24 mg Betain in einen 10 -ml -Volumenkolben wiegen, 50% Methanol zum Auflösen hinzufügen und bis zur Marke verdünnen, gut schütteln und die Betain -Referenzlösung erhalten.
2.2.3 Vorbereitung der Testlösung
Genau 310,14 mg der Testprobe in einen 25 -ml -Volumenkolben wiegen.
2.2.4 Chromatographische Erkrankungen
Betain -Detektionsmethode: Xamidsäule (4,6 mm × 250 mm, 5 μm); Mobile Phase Acetonitril-Wasser (80:20); Säulentemperatur 30 Grad; Durchflussrate 1 ml · min -1; Injektionsvolumen 10 μl.
Andere Komponentenerkennungsbedingungen: Kromasil 100-5- C18 -Spalte (4,6 mm × 250 mm, 5 μm); Mobile Phase Acetonitril (a)
und {{0}}. 1% Phosphorsäurelösung (b); Säulentemperatur 30 Grad; Durchflussrate 1 ml · min -1; Injektionsvolumen 10 & mgr; l, Gradientenelution (0 ~ 10 min, 10%A; 10 ~ 20 min, 10%~ 15%A; 20 ~ 25 min, 15%A; 25 ~ 40 min, 15%~ 22%A).
2.3 Indexerkennung
2.3.1 Dynamische spermische spermische Spermien -Spermien -Parameter
Die Rattenbauchhöhle wurde zerlegt, um ihre linke Epididymis freizulegen. Der linke epididymale Schwanz wurde schnell abgeschnitten und in 2 ml phenolrotfreies DMEM-Kulturmedium in einem 37-Grad-Wasserbad vorgewärmt. Es wurde in Stücke mit ophthalmischer Schere geschnitten, leicht geschüttelt und in einem 37 -Grad -Wasserbad für die Inkubation für 10 Minuten gestellt, damit alle Spermien aus dem Epididymis schwimmen und die Spermienaufhängung vorbereiten konnten. 10 & mgr; l Spermiensuspension wurden auf einen Spermienzählungsrutschen fallen, und die CASA -Technik wurde verwendet, um die Spermiendichte, die durchschnittliche Pfadgeschwindigkeit (VAP), die krummlinige Geschwindigkeit (VCL), die Linearität (Lin), das Wobble (WOB), die Geradness (STR) und die Beat -Kreuzfrequenz (BCF) zu beobachten und aufzunehmen.
2.3.2 Spermienmotilität und Deformitätsrate
Pipette 20 & mgr; l frisch hergestellter Spermiensuspension in ein vorbereitete Propidium-Iodid (PI) (verdünnt 3 000 -Fzeiten) und Calcein-AM (200-mal verdünnt) gemischte Färbungslösung, inkubieren Sie 30 Minuten lang 37 Grad Wasserbad und beobachteten unter einem Fluoreszenzmikroskop. Zählen Sie die Gesamtzahl der überlebenden Spermien und Übergangsspermien in allen 200 Spermien in verschiedenen Sichtfeldern. Live -Spermien: Der Spermienkopf, der Körper und der Schwanz sind alle grün fluoreszierend, und die Spermienaktivität ist unter dem Mikroskop zu sehen. Übergangssperma: Der Spermienkopf ist rot fluoreszierend und der Körper ist offensichtlich grün fluoreszierend. Zu diesem Zeitpunkt befindet sich das Sperma in der Übergangszeit des Todes. Totes Sperma: Nur der Spermienkopf ist rot fluoreszierend und der gesamte Körper hat keine grüne Fluoreszenz.
Nehmen Sie 100 & mgr; l Spermiensuspension und legen Sie sie 10 Minuten lang in ein 60 -Grad -Wasserbad, zeichnen Sie es 5 & mgr; l und lassen Sie sie auf den Objektträger aus, verteilen Sie es gleichmäßig und trocknen Sie es, reparieren Sie es mit Methanol, färben Sie es mit Eosin -Farbstoff, spülen Sie es mit fließendem Wasser, lassen Sie es mit Xyle transparent und dichten Sie es mit neutralem Riss mit neutralem Rock. Zählen Sie die Anzahl der abnormalen Spermien in jeweils 200 Spermien in verschiedenen Feldern unter einem Mikroskop und berechnen Sie das Verhältnis.
2.3.3 pathologische Färbung von Epididymis und Hoden
Nach 48 -stündiger Fixierung in 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur wurden Epididymis und Hodengewebe in Einbettungskästen gegeben, dehydriert mit abgestufter Ethanol, in Paraffin eingebettet und in Scheiben geschnitten. Nach Entwachung und Hydratation wurde die Färbung durchgeführt, und pathologische Veränderungen von Hoden- und Epididymis -Geweben wurden unter einem optischen Mikroskop beobachtet, um den Grad der Läsionen in der Struktur von Hodenseminiferen, Läsionen in der Epididyal -Lumen und Spermedichte zu bestimmen.
2.3.4 Serum -T -Inhalt
Nach der Erfassung von Orbitalblut wurde es 2,5 h bei Raumtemperatur gelassen, zentrifugiert bei 3 000 r · min -1 für 20 min, und der Überstand wurde zur Erkennung von Serum -T -Pegel gemäß den Anweisungen des T -Kits eingesetzt.
2.4 Metabolomikanalyse
2.4.1 Vorbereitung der Serumprobe
Am Tag der Probenahme wurden die Ratten anästhesiert und Vollblut durch die Bauchaorta gesammelt. Das Blut wurde für 2,5 h bei Raumtemperatur gehalten und für 2 0 min bei {{2} r · min -1 zentrifugiert. Der Überstand wurde in 2 ml Zentrifugenröhrchen mit entsprechenden Zahlen unterteilt und bei -80 -Angrad gespeichert. Thaw at 4 degree before testing, vortex mix the samples, accurately transfer 50 μL of serum samples to 0.5 mL EP tubes, add 300 μL of 20% acetonitrile-methanol internal standard extract, vortex mix, then centrifuge at 4 degree , 12 000 r·min-1 for 10 min, take 200 μL of Überstand und in einen weiteren sauberen 0,5 -ml -EP -Röhrchen geben, lassen Sie es bei -20 Grad 30 min und dann bei 4 Grad zentrifugen, 12 000 r · min -1 für 3 min, nehmen Sie 180 μl Supernatant zur Injektion.
2.4.2 Chromatographische Erkrankungen
Waters Acquity UPLC HSS T3 C18 -Spalte (2,1 mm × 1 0 0 mm, 1,8 μm). The mobile phases were 0.1% formic acid in water (A) and 0.1% formic acid-acetonitrile solution (B), with gradient elution (0-11 min, 5%-90% B; 11-12 min, 90% B; 12-12.1 min, 90%-5% B; 12. 1-14 min, 5% b). Die Säulentemperatur betrug 40 Grad und die Durchflussrate betrug 0,40 ml · min -1.
2.4.3 Bedingungen der Massenspektrometrie
Die Elektrospray -Ionenquelle wurde in positiven und negativen Ionenmodi gescannt. Das Sprühgas betrug 50 psi (6,895 kPa), das Heizheizgas betrug 60 psi, das Vorhanggas betrug 35 psi und die Ionenquellentemperatur betrug 550 Grad. Im positiven Ionmodus war die Ionisationsspannung {5 500 V, der hohe Empfindlichkeitsmodus wurde übernommen, die Deklusterspannung war 60 V und die Kollisionsenergie war 30 V. Im negativen Ionmodus war die Ionisationsspannung {}} v. Der Sensitivitätscanning-Modus der semi-quantitativen Daten wurde übernommen.
2.4.4 Datenverarbeitung und -analyse
Die Rohdaten der LC-MS-Erkennung wurden durch Proteowizard-Software in das MZML-Format umgewandelt, und das XCMS-Softwarepaket wurde für die Korrektur von Spitzenextraktion, Ausrichtung und Retentionszeit verwendet. Die Unterstützungsvektor -Regressionsanalyse (SVR) wurde verwendet, um die Spitzenfläche zu korrigieren, und die Peaks mit einer fehlenden Rate von mehr als 5 0% wurden gefiltert. Die Peaks nach dem Screening wurden in die öffentliche Bibliothek, die von Wuhan Metwell Biotechnology Co., Ltd. erstellte Datenbank und den metDNA -Algorithmus integriert, um die strukturellen Informationen von Metaboliten zu identifizieren. Anschließend wurde das R-Paket verwendet, um eine univariate statistische Analyse und eine multivariate statistische Analyse unter Verwendung der T-Test-Methode des Schülers und der orthogonalen teilweise Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (OPLS-DA) durchzuführen. Die Differential-Metaboliten-Screening-Bedingungen wurden auf eine variable Bedeutung in der Projektion (VIP)> 1, zweiseitiger Test P <0. Die erhaltene CPD _ ID wurde in die Website des Metabo Analyst 6.0 eingegeben
(https://www.metaboanalyyst.ca/) für die Analyse der Anreicherung. Der P des hypergeometrischen Tests wurde verwendet, um die Schlüsselwege mit einer signifikanten Anreicherung zu identifizieren.
2.5 Statistische Analyse
𝑥̅ ± S wurde als Mittelwert ± Standardabweichung (𝑥̅ ± S) ausgedrückt, und eine Einweg-Varianzanalyse wurde verwendet, um Daten zwischen mehreren Gruppen zu vergleichen. P<0.05 was considered statistically significant.
