Elastin bildet das elastische Protein des epidermalen Bindegewebes mit Kollagen

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Abstrakt:Ein neues Xanthonglycosid,135, 6-Tetrahydroxyxanthon-C-4-D-glucopyranosid, wurde aus dem Methanolextrakt von Mangifera Indica-Blättern (Anacardiaceae) isoliert, die in Ägypten wachsen. Die Struktur wurde durch 1D- und 2D-NMR-spektroskopische Daten aufgeklärt. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Verbindung wie Lipophilie, Löslichkeit und Formulierungsüberlegungen wurden über die In-Silico-ADMET-Technik unter Verwendung des SwissADME-Servers vorhergesagt. Diese Technik lieferte Lipinskis Fünferregel, wie GIT-Absorption, -Verteilung, -Stoffwechsel und -Durchdringung der Haut. Die In-vitro-Inhibitoraktivitäten gegen alterungsvermittelte Enzyme wie Collagenase, Elastase, Hyaluronidase und Tyrosinase wurden bewertet. Die Verbindung zeigte bemerkenswerte Anti-Kollagenase-, Anti-Elastase-, Anti-Hyaluronidase- und Anti-Tyrosinase-Wirkungen mit IC50-Werten von 1,06, 419,10, 1,65 bzw. 0,48 ug/ml im Vergleich zur Positivkontrolle. Die Verbindung zeigte eine vielversprechende vorhergesagte Wasserlöslichkeit und eine vernünftige Hautpenetration, was die Eignung der Verbindung für eine topische Formulierung als Anti-Aging-Mittel für kosmetische Präparate nahe legt.

Schlüsselwörter:Xanthon; Mangifera indica; Altern; Ceollagenase; Elastase; Tyrosinase; Hyaluronidase; in silico ADMET

1. Einleitung

Der Alterungsprozess ist ein komplexer biochemischer Prozess, der mit oxidativem Stress verbunden ist, der durch endogene Sauerstoff- und Stickstoffradikale angetrieben wird, die während der Lebenserwartung erzeugt werden und zum Fortschreiten altersassoziierter Manifestationen beitragen können [1]. Pathologien der Hautalterung wie Falten, Hyperpigmentierung, Altersflecken, Falten, Melasma, Sommersprossen, Lentigo, Epheliden, Nävus, Bräunung und Melanom werden durch die Aktivierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) vorangetrieben [2]. Freie Radikale oder ROS könnten möglicherweise eine Veränderung der strukturellen Zusammensetzung der Hautzellen herbeiführen und die Zellmembranen schädigen, indem sie die Oxidation von Lipiden und Proteinen stimulieren, was zu DNA-Schäden und Zelltod führt [3,4]. Darüber hinaus spielen ROS eine bedeutende Rolle im Hautalterungsprozess, indem sie wichtige Hautproteine ​​wie Kollagen und Elastin durch Aktivierung von Kollagenase- und Elastaseenzymen schädigen. Darüber hinaus verursachen freie Radikale durch die Aktivierung von Hyaluronidasen einen Hyaluronsäureabbau, was zu einer unzureichenden Hydratation der Haut führt [5,6]. Die Antizipation dieser dynamischen Prozesse wird als Schlüsselthema für den Bereich der Dermokosmetik angesehen, und es wird umfangreiche Forschungsarbeit aufgewendet, um neue Schutzformulierungen zu entdecken[7]. Antioxidantien sind die natürlichen Abwehrenzyme der Haut und wirken der übermäßigen Bildung freier Radikale im Körper entgegen. Das oxidative Gleichgewicht kann jedoch durch verschiedene Faktoren gestört werden, darunter Ernährung und Luftverschmutzung, die zu oxidativem Stress führen. Bei diesem oxidativen Stress ist die Belastung durch freie Radikale im Körper deutlich höher als bei natürlichen Antioxidantien. Daher ist es äußerst wichtig, externe Antioxidantien aus Quellen wie Ernährung, Kosmetik oder Pharmazeutika zu verwenden, um freie Radikale zu neutralisieren und dem Hautalterungsprozess entgegenzuwirken [5,8]. Moderne Studien haben gezeigt, dass mehrere natürliche Sekundärmetaboliten, hauptsächlich Flavonoide und Polyphenole, erheblich zur gesamten antioxidativen Aktivität vieler Pflanzen beitragen [9]. Dies hat zu einem Interesse an der Untersuchung der antioxidativen Aktivität vieler Pflanzen geführt [10]. Es wurde berichtet, dass Früchte reich an diesen Phenolen und Flavonoiden sowie Vitaminen sind [11].

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Elastin bildet zusammen mit Kollagen das elastische Protein des epidermalen Bindegewebes und spielt eine wesentliche Rolle bei der Vorbeugung von Hautfalten und Hautfestigkeit[12]. Während der Zellalterung werden Matrix-Metalloproteinasen wie Kollagenase, Elastase und Hyaluronidase hochreguliert [13]. Die Unterdrückung dieser Enzyme ist eine der wirksamsten therapeutischen Strategien, um die Verschlechterung von Hauterkrankungen während des Alterns zu bewältigen [14]. Aus Pflanzen stammende phenolische Verbindungen wurden aufgrund ihrer tyrosinasehemmenden Eigenschaften als potente Aufhellungsmediatoren beschrieben [15], und einige von ihnen könnten über eine elastasehemmende Wirkung eine Rolle beim Matrixumbau spielen [16].

Mangifera indica L. ist eine der wichtigsten essbaren Pflanzen, die zur Familie der Anacardiaceae gehört und in vielen Ländern, insbesondere in tropischen Regionen, verbreitet ist [17]. Mangofrüchte spielen seit über 4000 Jahren eine zwingende Rolle in den Bereichen Landwirtschaft, Lebensmittel, Pharmazie und Nutrazeutika [18]. Darüber hinaus steht die Mangofrucht nach Balana an zweiter Stelle unter den Industriekulturen in Bezug auf Produktion und Reichweite [19]. Verschiedene Teile von Mangifera indica stellen eine reichhaltige Quelle verschiedener Phytobestandteile dar, darunter Flavonoide, Xanthonoide, Phenolsäuren und Triterpenoide mit potenziellem Wert als funktionelle Moleküle [18]. Darüber hinaus versorgen Früchte den menschlichen Körper mit lebenswichtigen Bestandteilen wie Kohlenhydraten, Proteinen, Fetten, Mineralstoffen, Vitaminen, essentiellen Aminosäuren, Carotinoiden, Ballaststoffen und Phenolen [20]. Traditionell berichteten verschiedene Kulturen, dass Blattinfusionen für verschiedene Krankheiten wie Durchfall, blutige Ruhr, Anämie, Asthma, Bronchitis, Bluthochdruck, Schlaflosigkeit, Rheuma, Verdauungsstörungen, Hepatitis, Tetanus, Fehlgeburten und Blutungen verwendet wurden [21]. Außerdem wurden die Dämpfe der brennenden Blätter wegen Schluckauf und Halsschmerzen eingeatmet [18]. Die Rinde wurde als Diuretikum und in antirheumatischen Verbänden verwendet. Die Samen sind bekannt für die Behandlung von Erkältungen, Asthma, Durchfall und Hämorrhoiden. Es wurde über antioxidative Aktivität, hohe Gesamtphenol- (TPC), Gesamtflavonoidgehalte (TFC),2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)-Abfangaktivität und Linolsäure-Hemmungskapazität von Mangifera-indica-Pflanzenteilen berichtet [ 22].

Cistanche kann Anti-Aging

Diese Studie wurde entwickelt, um die in vitro hemmenden Eigenschaften einer neuen Xanthonverbindung, die aus dem 70-prozentigen methanolischen Extrakt von Mangifera indica L.-Blättern gewonnen wird, gegen Kollagenase, Elastase, Tyrosinase und Hyaluronidase zu untersuchen. Darüber hinaus wurden pharmakokinetische Eigenschaften wie Absorption, Verteilung, Metabolismus und Toxizität (in silico ADMET-Vorhersage) unter Verwendung der Fünferregel von SwissADME und Lipinski durchgeführt, um die Arzneimittellöslichkeit, Permeabilität und Formulierungsnotwendigkeiten zu bewerten.

2.Ergebnisse und Diskussion

2.1. Strukturaufklärung der isolierten Verbindung

Die Verbindung wurde als gelbe Kristalle (18,29 mg) erhalten. Die chromatographische Analyse zeigte einen blass-orange-gelben Fleck auf TLC unter langem UV-Licht (365 nm) in DCM:MeOH (7:3) und BAW-Lösungsmittelsystemen. Wenn der Fleck mit 1-prozentiger methanolischer Eisenchloridlösung behandelt wurde, wurde er dunkelgrün und verfärbte sich gelb, wenn Ammoniaklösung aufgesprüht wurde. Die lH-NMR-, APT- und HMBC-Spektraldaten der Verbindung sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Die lH-NMR-Spektralanalyse (DMSO-dg, Raumtemperatur) (Abbildungen Sl und S2) zeigte das Vorhandensein von zwei aromatischen Dublett-Signalen im Tieffeld bei oH 7,57 und 6,79 mit einer Kopplungskonstante von 8,24 Hz, was das Vorhandensein von zwei ortho-gekoppelten Protonen anzeigt. Darüber hinaus zeigte der aromatische Bereich des H-NMR-Spektrums das Vorhandensein eines Singulett-Signals bei Su 5,96, was auf das Vorhandensein eines einzelnen Protons im aromatischen Ring hinweist. Das anomere Proton der C-Glucosyleinheit wurde bei Su 4,60 ppm nachgewiesen, wobei ein Kopplungskonstantenwert von 7 Hz für -Anomer zugeordnet wurde. Dieses Muster aromatischer Protonen im H-NMR-Spektrum der isolierten Verbindung ähnelt der Xanthonstruktur. Darüber hinaus zeigte das Vorhandensein eines -anomeren Protons bei etwa 4,60 mit charakteristischen chemischen Verschiebungen von Glucose bei 3,21 bis 4,60 im 1H-NMR (Zuckerregion), dass es eine C-glykosidische Bindung zwischen dem Zucker und Xanthon gibt. Wie in Abbildung S3 gezeigt, zeigte das APT-Spektrum der Verbindung das Vorhandensein von neunzehn Kohlenstoffsignalen, die die Xanthon- und die C-Glucosidstruktur darstellen.cistanche tubulosa bewertungenDas APT-Experiment identifizierte drei CH-Gruppen (C-8, 131,95; C-7, 115,10; C-2, 95,35 ppm) in der Xanthoneinheit und dem anomeren C-1' der C-Glucose bei SH75,13 ppm. Wir führten zweidimensionale NMR-Experimente (HMBC; Abbildung S4) durch, um die glykosidische Bindung der C-Glucose am C-4 des Xanthons zu bestätigen. Zahlreiche 2,3JCH-Korrelationssignale im logarithmischen Bereich bestätigten das Xanthonrückgrat mit beobachteten Kreuzpeaks von H-1'(6) 4,60) bis C-4(6c 104,13 ppm) und C-3 (6c 158,95).Zitrus-BioflavonoideFür die Xanthoneinheit wurde auch eine 2,3JCH-Langstreckenkorrelation von H-2(8) zu C-4(6c 104,13 ppm), C-3 (8c 158,95), und C-4b(6c 107,45). Darüber hinaus wurde eine 2-37-Langstreckenkorrelation von H-8(8)7,57) zur Carbonylgruppe C-9( 6c 195,14), C-8a(6c 131,22) und C-6 （6c161,87）. Für denselben Ring aJcH-Signale von H-7（6μ 6,79） zu C{ {39}}a（6c 131.22） wurden beobachtet. Diese Korrelationen sind in der Struktur der Verbindung in Abbildung 1 dargestellt. HSQC der Verbindung zeigte 1JcH-Korrelationen zwischen jedem Proton und seinem lokalisierten Kohlenstoff, wie in Abbildung S5 gezeigt. Das H,H-COSY-Experiment (Abbildung S6) zeigte eine starke Kreuzpeakkorrelation zwischen H-7 （δu 6.79） und H-8（8H7.57）. Darüber hinaus zeigte die Verbindung einen pseudomolekularen Ionenpeak [MH]- bei m/z 421, was auf eine Summenformel von CgHngOrin im negativen Modus der ESI-MS-Analyse hinweist (Abbildung S7). Die Daten von 1H-NMR, APT, IH, H COSY, HMBC und HSQC veranlassten uns zu der Annahme, dass die Verbindung 1,3,5,6-Tetrahydroxyxanthon-C-4- -D-Glucopyranosid sein könnte. Dies wurde durch Vergleich mit NMR-Daten von Isomangiferin in der Literatur bestätigt [23,24].

2.2.In-Silico-Pharmakokinetik-Vorhersage der isolierten Verbindung

Der Online-Server SwissADME wurde verwendet, um die Wirkstofffähigkeit der isolierten Verbindung durch Schätzung der Fünferregel von Lipinski (RO5) für die Wirkstoffähnlichkeit[25] zu bewerten. Lipinski berichtete, dass 90 Prozent der oral aktiven Arzneimittel, die den klinischen Phase-II-Status erreicht haben, eine MWT von weniger als oder gleich 500, logp von weniger als oder gleich 5, H-Brücken-Donatoren von weniger als oder gleich 5 und H-Brücken-Akzeptoren von weniger als haben oder gleich 10 [26].SwissADME sagt weitere sechs physikalisch-chemische Parameter voraus, die mit der Arzneimittelähnlichkeit assoziiert sind, wie Lipophilie [27], Größe, Polarität [28], Löslichkeit [29,30], Flexibilität und Sättigung [31,32]. wie in Abbildung 2 und Tabelle 2 dargestellt.cistanche UKDas SWISSADME-Diagramm der Arzneimittelähnlichkeit der isolierten Verbindung zeigte, dass die meisten physikalisch-chemischen Eigenschaften der Verbindung innerhalb des wünschenswerten Bereichs liegen [33], mit Ausnahme der Anzahl der H-Brücken-Akzeptoren, H-Brücken-Donoren und der Polarität der Verbindung seitdem der PSA-Wert beträgt 201,28 Å2 (erwünschter Bereich (zwischen 20 und 130 Å2)[28]. Diese hohe Polarität kann auf das Vorhandensein einer Zuckereinheit zurückgeführt werden. Die isolierte Verbindung zeigte eine vielversprechende vorhergesagte topologische Wasserlöslichkeit log S(Ali)[29 ] und Log S (ESOL)[30].Dies wird die zukünftige Formulierung dieser Verbindung erleichtern.Die vorhergesagte Pharmakokinetik zeigte, dass die Verbindung eine niedrige vorhergesagteGIT-Absorption ohne Permeation zu BBB gemäß dem Dania-Modell mit gekochtenEiern [34] hat, das von übernommen wurde der Online-Server SwissADME[33].cistanche wirkungDarüber hinaus zeigte die Verbindung keine Hemmwirkung auf fünf Isoformen von Cytochrom P450 (1A2, 2C19, 2C9, 2D6 und 3A4) [35], was auf eine geringe Wahrscheinlichkeit von Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln hinweist. Die vorhergesagte Hautpermeation wird durch ein multiples lineares Regressionsmodell berechnet, das die Molekülgröße und Lipophilie mit der Hautpermeabilität korreliert [36]. Je negativer der log Kp (mit Kp in cm/s), desto weniger hautgängig ist das Molekül [33,36].cistanche tubulosa-ExtraktDas vorhergesagte Log Kp der Hautpermeation in cm/s beträgt -9,14 cm/s.

2.3. Bewertung der Anti-Hautalterungseigenschaften

2.3.1.Bestimmung von Anti-Kollagenase- und Anti-Elastase-Aktivitäten

Kollagen und Elastin sind lebenswichtige Strukturproteine ​​der Epidermis, die zusammen mit Hyaluronsäure die Elastizität, den Kapillarton und die Festigkeit der Haut aufrechterhalten [39]. Während des Alterungsprozesses führen oxidativer Stress und übermäßige Einwirkung von UV-Licht zur Aktivierung hydrolysierender Enzyme wie Elastase, Kollagenase und Hyaluronidase, wodurch die Hautfestigkeit und -flexibilität verloren geht und Falten entstehen[40] . Die Hemmung der Kollagenase- und Elastaseaktivitäten ist eine der wirksamen Strategien, um die Haut vor Hautalterungserscheinungen zu schützen [41]. Wie in Abbildung 3A verdeutlicht, zeigte die Verbindung moderate Anti-Kollagenase-Eigenschaften mit einem ICso-Wert von 419,10 ug/ml im Vergleich zu Phenanthrolin (IC50=182,80 ug/ml) als Standard. Bezüglich der Elastase-Hemmwirkung (Abbildung 3B) zeigte es eine bemerkenswerte Wirkung mit einem ICso-Wert von 1,06 ug/ml, während die positive Kontrolle, N-Methoxysuccinyl-Ala-Pro-Val-Chlormethylketon, einen ICso-Wert von 0,63 ug ausübte /mL. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen berichtete eine frühere Studie, dass der Methanolblattextrakt der Mango ein 10--mal stärkerer Elastase-Inhibitor war als das Standard-Tocopherol, was auf die nicht-kompetitive Hemmungseigenschaft von Mangiferin zurückgeführt wird[42]. Darüber hinaus bewiesen frühere Berichte die Anti-Elastase-Aktivität von Polyphenolverbindungen aufgrund des Vorhandenseins hydrophiler Gruppen wie Hydroxyl oder Carboxyl, die die kompetitive Hemmung von Enzymen positiv beeinflussen könnten [43].

2.3.2.Bestimmung von Anti-Hyaluronidase- und Antityrosinase-Aktivitäten

Hyaluronsäure ist das vorherrschende Glykosaminoglykan der Haut, das ihren Feuchtigkeitsgehalt bewahrt[44]. Es wird enzymatisch durch Hyaluronidase hydrolysiert, was zu einem Zusammenbruch der Integrität der Hautstruktur und einer Störung der Gewebepermeabilität führt [45]. Die Unterdrückung von Hyaluronidase erhält die Hautintegrität, verzögert das Fortschreiten der Hautalterung und erhält die Hautfeuchtigkeit [13]. Frühere Studien zeigten, dass natürliche Hyaluronidase-Inhibitoren gut als Anti-Aging-Wirkstoffe für die Entwicklung von Hautgesundheitsprodukten dienen könnten[46]. Wie in Abbildung 4A dargestellt, konnte die isolierte Verbindung die Hyaluronidase-Aktivität mit einem ICso-Wert von 1,65 ug/ml im Vergleich zu 6-O-Palmitoyl-L-ascorbinsäure als Positivkontrolle (2,55 ug/ml) deutlich abschwächen.

Unter den klinischen Manifestationen der Hautalterung kann die Hyperpigmentierung der Haut durch das Tyrosinase-Enzym in Gegenwart von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) beschleunigt werden[46]. Tyrosinase, ein kupferhaltiges Glykoprotein, spielt eine entscheidende Funktion bei der Melaninsynthese durch die Hydroxylierung von L-Tyrosin zu 3,4--Dihydroxyphenylalanin (DOPA), gefolgt von der Oxidation von DOPA zu DOPAchinon [47]. Daher verringert die Unterdrückung der Tyrosinase-Aktivität möglicherweise die Hyperpigmentierung der Haut [48]. Aus dieser Sicht hemmte die Verbindung potenziell Tyrosinase mit einem ICso-Wert von 0,48 ug/ml, verglichen mit Kojisäure als Positivkontrolle (0,82 ug/ml), wie in gezeigt Abbildung 4B. Eine frühere Studie mit Mangifera-indica-Samenextrakt zeigte hervorragende Anti-Tyrosinase- und Anti-Hyaluronidase-Ergebnisse, die mit dem Polyphenolgehalt korrelierten [47]. Auf molekularer Ebene enthalten sowohl Tyrosin als auch DOPA Hydroxylgruppen, die sich als essentielle Protonendonatoren für die Tyrosinase-Aktivierung ausdrücken [49]. Ebenso enthält die Verbindung vier Hydroxyleinheiten in ihrem Skelett, die sich als kompetitive Inhibitoren verhalten können, indem sie als Substrate mit Tyrosinase reagieren.

3.Material und Methoden

3.1.Pflanzenmaterial

Die frischen Blätter von Mangifera indica L.leaves wurden am 20. Juli 2021 in der Fruchtphase aus einem privaten Garten im Gebiet Abo-Zabal (N 30 Grad 1743.5336" E 3128.254), Regierung Qualiobya, Ägypten, bezogen. Sie wurden freundlicherweise beglaubigt von Mrs. Treize Labib, die Taxonomie-Spezialistin am El-Orman Botanical Garden, Gizeh, Ägypten Gutscheinexemplare mit dem Code PHG-P-MI-362 wurden in der Galerie der Abteilung für Pharmakognosie der Fakultät für Pharmazie der Ain-Shams-Universität hinterlegt.

3.2. Extraktion und chromatographische Isolierung

Die luftgetrockneten Blätter von Mangifera indica L. (1,56 kg) wurden 5 Tage lang in 70-prozentigem Methanol (27 l) perkoliert und dann filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum bei 47 Grad bis zur Trockne vollständig eingedampft, um einen getrockneten Rückstand zu ergeben (90,36 g; 5,79 Prozent Gew./Gew.); Die Extraktionsausbeute wurde mit der folgenden Gleichung berechnet: [Gesamtgewicht des getrockneten Extrakts/Gesamtgewicht der frischen Pflanze] × 1{00. Dann wurde der erhaltene Extrakt einer Diaion HP-20-Fraktionierung unterzogen. Es wurde die Gradientenelution (Wasser/Methanol) verwendet. Es wurden fünf Hauptfraktionen erhalten: 100 % Wasser, 25 % Methanol, 50 % Methanol, 75 % Methanol und 100 % Methanol. Die zu 50 Prozent in Methanol lösliche Fraktion (26,38 g) wurde Polyamid ausgesetzt und anfänglich mit 100 Prozent Wasser eluiert, dann mit Wasser/Methanol (von 100 : 0 bis 0 : 100, w/o) mit einem Gradienten eluiert, um sechs Unterfraktionen : 100 zu erhalten Prozent Wasser, 20 Prozent, 40 Prozent, 60 Prozent, 80 Prozent und 100 Prozent Methanol. Die zu 40 Prozent in Methanol lösliche Unterfraktion (2,36 g) wurde unter Verwendung von MeOH (isokratische Elution) auf Sephadex LH-20 aufgetragen. Ähnliche Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft, um vier Hauptunterfraktionen (A1-A4) zu erhalten. Die Unterfraktion A3 (0,86 g) wurde auf präparative Dünnschichtchromatographie(DC)-Platten unter Verwendung von Butanolessigsäure:Wasser (BAW;4:1:5) als Entwickler für die mobile Phase aufgetragen, um die Verbindung als leicht gelbes amorphes Pulver.

3.3.Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spektrometer

Ein Spektrometer Bruker Ascend 400/R (Burker Avance 3, Fallanden, Schweiz) wurde am Zentrum für Arzneimittelentdeckung, -forschung und -entwicklung, Fakultät für Pharmazie, Ain-Shams-Universität, verwendet. 3.4.Massenspektrometrie

Für die massenspektrometrische Analyse wurde ein Massenspektrometer Finnigan LCQ-DECA (San Jose, CA, USA) verwendet, das mit einem PDA-Detektor verbunden war. Proben wurden in HzO:MeOH als Mischung gelöst und direkt in das HPLC/ESI-MS-System injiziert. Sowohl der negative als auch der positive ESI-Ionisationsionenmodus wurden unter den folgenden Bedingungen angewendet: Trocknungs- und Zerstäubungsgas, N2; Kapillartemperatur, 250 Grad; Sprühspannung 4,48 kV; Kapillarspannung 39,6 V; Tubuslinsenspannung, 10,00 V; und Full-Scan-Modus im Massenbereich m/z 100-2000. Die ESI-MS-Analyse für die isolierte Verbindung wurde auf einem Waters Xevo TQD-Massenspektrometer mit UPLC Acquity-Modus (Milford, CT, USA) am Center for Drug Discovery, Research and Development, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, durchgeführt.

3.5.In-silico-Pharmakokinetik-Vorhersage

Lipinskis Fünferregel, physikalisch-chemische Parameter wie Lipophilie, Löslichkeit und pharmakokinetische Eigenschaften wie GIT-Absorption, -Verteilung, -Metabolisierung und -Hautpermeation der isolierten Verbindung wurden unter Verwendung des SwissADME-Online-Servers durchgeführt [36]. 3.6. Bewertung der Anti-Hautalterungseigenschaften

3.6.1. Bestimmung der Anti-Kollagenase-Aktivität

Die Hemmfähigkeit der isolierten Verbindung gegen Kollagenase-Aktivität wurde unter Verwendung eines fluorometrischen Kollagenase-Inhibitor-Screening-Kits (BioVision, Katalog-Nr. # K833-100) gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren [50] bewertet. Die Referenzkontrolle war (1,10)-Phenanthrolin. Die getestete Verbindung und die Referenzkontrolle wurden in Konzentrationen von 1, 10, 100 und 1000 ug/ml für die Analyse hergestellt. Die getestete Verbindung wurde in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden hergestellt. Zuerst wurde das Kollagenase-Substrat in Kollagenase-Assay-Puffer (CAB) gelöst. Die Probe für die Analyse wurde durch Mischen der Verbindung sowohl mit Collagenase als auch mit CAB hergestellt. Die Herstellung von Inhibitor-Kontrollproben erfolgte durch Mischen des Inhibitors ((1,10)-Phenanthrolin (80 mM)) mit dem verdünnten Collagenase-Enzym und CAB-Puffer. Die Enzymkontrolle wurde durch Mischen der verdünnten Collagenase mit CAB hergestellt. Der CAB-Puffer wurde als Hintergrundkontrolle verwendet. Alle Proben wurden 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Während dieser Zeit wurde das Reaktionsgemisch durch Mischen der Collagenase mit CAB hergestellt. Im folgenden Schritt wurde das Reaktionsgemisch gründlich mit den vorbereiteten Proben vermischt. Die Fluoreszenz wurde sofort bei 490 nm Anregungswellenlänge und 520 nm Emissionswellenlänge unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (FilterMax F5, Thermo Fisher) gemessen. Die Messung wurde im kinetischen Modus bei 37 Grad für 60 min durchgeführt. Proben wurden doppelt hergestellt und die Kollagenase-Hemmwirkung der getesteten Verbindung wurde unter Anwendung der folgenden Gleichung berechnet:

3.6.2. Bestimmung der Anti-Elastase-Aktivität

Die Anti-Elastase-Aktivität der Verbindung wurde unter Verwendung des EnzChek§Elastase-Assay-Kits (E-12056) gemäß der zuvor beschriebenen Methode [51] untersucht. Die getestete Verbindung und die Referenzkontrolle wurden in Konzentrationen von 0.1, 10 und 100 ug/ml für die Analyse hergestellt. Die Verbindung wurde in 96--Well-Platten mit klaren Böden für den fluorometrischen Assay hergestellt. Kurz gesagt wurden Elastase-Enzymlösungen, Elastase-Substrat und Inhibitorkontrolle wie empfohlen hergestellt. Verdünnte Elastase-Lösung wurde dann zu den Vertiefungen gegeben. Die getestete Verbindung, die Inhibitorkontrolle und die Enzymkontrolle wurden zu den nachfolgenden Vertiefungen gegeben. Die Proben wurden auf einem Schüttler gemischt und dann für 5 min bei 37 Grad inkubiert. Assay-Puffer wurde mit dem Substrat gemischt, um die fluorometrische Reaktionsmischung herzustellen, die dann zugegeben und gründlich mit jeder Probe gemischt wurde. Die Fluoreszenz wurde sofort bei 400 nm Anregungswellenlänge und 505 nm Emissionswellenlänge unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (FilterMax F5, Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) gemessen. Die Messung wurde im kinetischen Modus bei 37 Grad für 30 Minuten vor Licht geschützt durchgeführt. Alle getesteten Proben wurden in zweifacher Ausfertigung hergestellt und getestet, und die Elastase-Hemmwirkung der getesteten Verbindung wurde unter Anwendung der folgenden Gleichung berechnet:

wo:

△RFU=Änderung der relativen Fluoreszenzeinheiten EC=Enzymkontrolle

3.6.3. Bestimmung der Anti-Tyrosinase-Aktivität

Die inhibitorischen Aktivitäten von Ölen wurden gegen Collagenase unter Verwendung des Abcam@Tyrosinase Inhibitor Screening Colorimetric Assay Kit (Katalog-Nr. ab204715) getestet. Der Assay wurde gemäß dem bereitgestellten Handbuch durchgeführt. Der Standard-Tyrosinase-Inhibitor war Kojisäure. Die getestete Verbindung wurde für die Analyse in Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 10 ug/ml hergestellt. Etwa 2 ul der bereitgestellten Tyrosinase wurden mit 48 ul Tyrosinase-Assay-Puffer gemischt. Die Proben ätherischer Öle oder Stand (20 ul) wurden mit der Enzymmischung (50 ul) gemischt und bei 25 Grad für 10 min inkubiert. Dann wurden 30 μl Tyrosinase-Substratlösung in die Vertiefungen mit ätherischen Ölen und Standard gegeben. Danach wurde die Platte spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 510 nm für 30-60 min bei 25 Grad vermessen.

3.6.4. Bestimmung der Anti-Hyaluronidase-Aktivität

Die Hyaluronidase-Aktivität wurde spektrophotometrisch bewertet, indem die Menge an N-Acetylglucosamin gemessen wurde, die aus Natriumhyaluronat gebildet wurde [52]. Die getestete Verbindung und die Referenzkontrolle wurden für die Analyse in Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 10 ug/ml hergestellt. Fünfzig Mikroliter Rinderhyaluronidase (7900 Einheiten ml -1, (Sigma, St. Louis, MO, USA) gelöst in 0,1 M Acetatpuffer （pH=3,5） wurden mit 100 μl einer bezeichneten Konzentration der Verbindung gelöst in 5 Prozent DMSO und dann in einem Wasserbad bei 37 Grad für 20 Minuten inkubiert Die Kontrollgruppe wurde mit 100 μl 5 Prozent DMSO anstelle der Probe behandelt Die optische Dichte der Reaktionsmischung wurde bei 585 nm gemessen durch Spektrophotometrie.

3.7.Statistische Analyse

Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die Daten für den ICso der enzyminhibierenden Aktivität wurden unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) statistisch untersucht. Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism 5 durchgeführt.0. 4. Schlussfolgerungen und Zukunftsperspektiven

Aus Pflanzen gewonnene Naturprodukte sind auf dem globalen Markt für die Entwicklung neuer Wirkstoffe für Cosmeceutical-Designs sehr gefragt[4]. In dieser Studie wurde eine neue Xanthonverbindung, 1.3.5, 6--Tetrahydroxyxanthon-C-4- --D-glucopyranosid, aus dem Blattextrakt von M. indica isoliert. Basierend auf enzyminhibierenden Assays könnte diese Verbindung möglicherweise gute Anti-Kollagenase-, Anti-Elastase-, Anti-Hyaluronidase- und Anti-Tyrosinase-Eigenschaften zeigen, wodurch eine umfassende abschwächende Wirkung gegen Hautalterungs-bezogene Enzyme verliehen wird. Darüber hinaus unterstützen ein physikalisch-chemischer In-silico-Parameter und eine ADME-Studie seine Einarbeitung in topische Dosierungsformen, da es eine vielversprechende Wasserlöslichkeit und eine vernünftig vorhergesagte Hautpenetration aufweist. Daher könnte diese Verbindung als vielversprechender multifunktionaler bioaktiver Wirkstoff für nutrazeutische und kosmezeutische Formulierungen eingesetzt werden. Dennoch sind toxikologische und klinische Bewertungen potenziell vielversprechend.

Dieser Artikel ist ein Auszug aus Molecules 2022, 27, 2609. https://doi.org/10.3390/molecules27092609 https://www.mdpi.com/journal/molecules