Einsatz von Phenolverbindungen aus Olivenvegetationswasser in Masthühnern: Auswirkungen auf die Darmmikrobiota und auf die Haltbarkeit von Brustfilets Teil 3

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2.7.Lipidoxidation

Die Lipidoxidation wurde durch die Messung der sekundären (TBARs) und primären (D232 und D270) untersucht.OxidationVerbindungen (Tabelle 7). Zwischen den drei experimentellen Gruppen wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt, obwohl es erwähnenswert ist, dass es einen leichten Anstieg der TBARs-Werte für Hühner in der L2-Gruppe im Vergleich zu denen in den L1- und L0-Gruppen gab, während D232 zeigte den gegenteiligen Trend. Diese beiden analytischen Indikatoren waren signifikant korreliert (TBARs vs. D232 r=-0.5,p<0.001 and="" tbars="" vs.="" d270r=""><0.05). the="" cooking="" treatment="" caused="" decreases="" in="" the="" primary="" oxidation="" products=""><0.01), which="" were="" followed="" by="" increases="" in="" the="" secondary="" ones="" (p=""><0.001). no="" interactions="" between="" diet="" and="" cooking="" were="" observed.="" on="" the="" contrary,="" [31]and="" [45]="" observed="" a="" significant="" reduction="" in="" tbars="" in="" the="" breasts="" from="" chickens="" whose="" diets="" were="" supplemented="" with="" either="" olive="" cake="" or="" omww.="" similarly,="" [46]="" observed="" a="" reduction="" in="" tbars="" in="" the="" quadriceps="" femoris="" of="" chickens="" whose="" diets="" were="" enriched="" with="" omww="" permeate="" and="" the="">

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Okeet al. [16] fügten unterschiedliche Mengen an Olivenblattextrakt (5, 10 und 15 ml/Liter) dem Trinkwasser hinzu, das Broilern des Abor-Acre-Stamms zugeführt wurde, und beobachteten eine signifikante Wirkung auf die Verringerung des Blutspiegels von Malondialdehyd (MDA). Ibrahimet al. [42] beobachteten eine signifikante Verringerung der MDA-Konzentration in Hähnchenbrust, die durch die Zugabe von zunehmenden Mengen an fermentiertem oder enzymatisch fermentiertem getrocknetem Oliventrester zum Futter erhalten wurde. Im Gegensatz zu anderen Studien wurde in der vorliegenden Studie keine Schutzwirkung gegen Muskelfettoxidation im Muskelgewebe beobachtet. Es gibt viele Faktoren, die zu Variabilität und Unterschieden zwischen Studien führen. Neben der Tierrasse und der Mastdauer können auch andere Faktoren wie die Nährstoffzusammensetzung des Futters, die Futteraufnahme, die Umgebungstemperatur sowie andere Stressbedingungen zu sehr unterschiedlichen und oft nur schwer vergleichbaren Ergebnissen führen. Nicht zuletzt die Art der Matrix, mit der die Ernährung mit Phenolen angereichert wird (Olivenkuchen, Oliventrester, Olivenblattextrakt, Pflanzenwasserextrakt, um nur einige zu nennen), aufgrund der Konzentration der Wirkstoffe und des Vorhandenseins zusätzlicher Substanzen mit einer synergistischen oder schützenden Wirkung, die in derselben Matrix vorhanden sind, können die antioxidative Wirkung sowohl in vivo als auch im Fleischgewebe nach der Schlachtung signifikant beeinflussen [47]. Die potenziellen gesundheitlichen Vorteile der Integration antioxidativer Zusatzstoffe in frisches Fleisch und Fleischprodukte sind nicht immer bewiesen [48]. Im Gegenteil, viele primäre und sekundäre Lipid- und Proteinoxidationsverbindungen, wie zHydroperoxide, Epoxide,4-Hydroxynonenal, Malonaldehydwerden als potenzielle Karzinogene erkannt oder können die zelluläre Signaltransduktion beeinflussen, wie dies bei Carbonylverbindungen der Fall ist [49]. Bei frischem Fleisch ist die Möglichkeit, das antioxidative Potenzial durch die Rationierung von Tieren zu erhöhen, eine sehr interessante Perspektive, insbesondere bei der Verwendung von natürlichen statt synthetischen Stoffen. Im Gegensatz zu Produkten auf Fleischbasis, bei denen die Technologie verschiedene Eingriffsmöglichkeiten zur Erhöhung des antioxidativen Potenzials bietet, besteht bei frischem Fleisch die einzige Alternative zum Eingriff durch die Ernährung von Tieren in einer Behandlung, die auf die Oberfläche des Produkts abzielt, die jedoch sein muss im Einklang mit der geltenden Gesetzgebung. Die im Brustfleisch der vorliegenden Studie gemessene Restmenge an Phenolen hat wahrscheinlich keinen direkten gesundheitlichen Nutzen, kann es aber indirekt tun. Das Kochen von Fleisch zum Beispiel verursacht einen Nettoverlust der antioxidativen Abwehrkräfte des Gewebes, daher die Anreicherung des Fleischgewebes durch Verbindungen, die auch nach der Wärmebehandlung noch aktiv sind, wie dies der Fall istPhenole, ist im Hinblick auf eine Erhöhung der Haltbarkeit und Sicherheit des Produktes selbst von großem Anwendungsinteresse. Der Grund, warum als Folge des Fütterungsversuchs mit CPC weder In-Video- noch Ex-Video-Effekte beobachtet wurden, verdient weitere experimentelle Untersuchungen, insbesondere im Hinblick auf die Wechselwirkung zwischen ihnendiätetische Polyphenoleund die Darmmikrobiota des Huhns, auf die es einen erheblichen Teil der potenziellen biochemischen Wirkungen von Phenolen ausübt [9,10].

3. Materialien und Methoden 3.1. Experimentelle Einrichtungen

Der Versuch wurde im Geflügelstall der Versuchsfarm der Universität von Padua (Legnaro, Padua, Italien) nach 6 Monaten Stillstand durchgeführt. Der Geflügelstall wurde mit einem Kühlsystem, Zwangsbelüftung, Strahlungsheizung und kontrollierten Lichtsystemen ausgestattet. Insgesamt wurden 12 Drahtnetzbuchten (2,5 x 2,4 m; 6 m2) verwendet, die jeweils mit fünf Nippeltränken (Abstand: 20 cm) und einem Futterkreisel (Durchmesser: 30 cm) zur manuellen Futterverteilung ausgestattet waren. Jeder Stall hatte einen Betonboden, der mit Hobelspänen (Tiefe 5 cm, 2,5 kg/m) bedeckt war.

Das Licht wurde in den ersten 2 Tagen nach Ankunft der Hühner im Geflügelstall rund um die Uhr bereitgestellt. Dann wurde die Anzahl der Lichtstunden schrittweise reduziert, bis eine Photoperiode von 18L:6D erreicht wurde, die dann ab einem Alter von 12 Tagen beibehalten wurde.

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3.2. Tiere, Versuchsgruppen und In-vivo-Aufnahmen

Die Studie wurde von der Ethikkommission für Tierversuche (Organismo per la Protezione del Benessere Animale; OPBA) der Universität Padua (Projekt 17/2016; Nr. 154392 vom 10. Mai 2016) genehmigt. Alle Tiere wurden gemäß den Grundsätzen behandelt der Richtlinie 2010/63/EU[50] zum Schutz der für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere. Am Umgang mit Tieren beteiligte Forscher waren entweder Tierspezialisten (PhD oder Master-Abschluss in Tierwissenschaften) und/oder Tierärzte.

Insgesamt 144 1- Eintagsküken (Ross 308) wurden von einem gewerblichen Lastwagen gemäß der Verordnung (EG) Nr. 1/2005 des Rates [51] an die Versuchseinrichtungen der Universität geliefert. Alle Küken waren in der Brüterei gegen die Marek-Krankheit, infektiöse Bronchitis und die Newcastle-Krankheit geimpft worden. Die Küken wurden am Tag ihrer Ankunft einzeln gewogen, durch eine Beinmarkierung identifiziert und zufällig auf die 12 Buchten verteilt (12 Vögel pro Bucht und 10 Vögel/m²).）,und dann einmal pro Woche gewogen, um ihr Lebendgewicht bis zur kommerziellen Schlachtung zu messen. Während des Versuchs wurde der Futterverbrauch täglich gemessen. Während der Studie wurden drei handelsübliche Diäten in Streuform verabreicht (Martini SpA Longiano, Forli-Cesena, Italien): Diät P1 von 0 bis 23 d, Diät P2 von 24 bis 37 d und Diät P3 von 38 d bis Schlachtung nach 48 Tagen (siehe Zusatzmaterialien für analytische Daten, Tabelle S1). Das rohe Phenolkonzentrat (CPC) wurde wie in [12] beschrieben erhalten, kurz gesagt, OVWs wurden unter Verwendung von Enzymen mit Pektinase- und Hemicellulose-Aktivitäten behandelt und dann einer Mikrofiltration, Ultrafiltration und Umkehrosmose unterzogen. CPC wurde den Diäten wie folgt zugesetzt: ( i)L0 Kontrollfutter (P3), (ii)L1 Kontrollfutter plus CPC (220 mg/kg Futter als theoretische Gesamtphenole), (i) L2 Kontrollfutter plus CPC (440 mg/kg Futter als theoretisches Gesamtphenol). Gesamtphenole). Der tatsächliche Gehalt an einzelnen phenolischen Verbindungen von CPC und den Diäten wurde in Tabelle S2 angegeben. Jede Diät wurde in vier Buchten wiederholt (homogen für anfängliches Lebendgewicht und Variabilität). Das CPC wurde ab einem Alter von 24 Tagen (d) bis zur kommerziellen Schlachtung am 48. Tag geliefert (siehe ergänzendes Material für die phenolische Zusammensetzung von CPC). Alle Tiere wurden während des Versuchs ad libitum gefüttert, und die ergänzten Diäten wurden wöchentlich zubereitet.

Um die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft im Darm zu bestimmen, wurden Kloakenabstriche (4 Tiere/Stall) im Alter von 23, 34 und 44 Tagen für insgesamt 12 Tiere (4 bei jeder Diät) gesammelt, die dreimal getestet wurden (36 Abstriche insgesamt gesammelte Proben).

3.3. Kommerzielle Schlachtung und Erfassung der Schlachtkörper- und Fleischqualität

Im Alter von 48 Tagen wurden alle Hühner nach Futter- und Wasserentzug (für 7 bzw. 2 h) in einem kommerziellen Schlachthof geschlachtet. Die Hühner wurden vor dem Verpacken einzeln gewogen. Alle Hühner aus einer Bucht wurden in einen Transportkäfig (Höhe 62,5 cm × 160 cm × 25,0 cm; Bodenfläche, 1 m²）. Das Verladen und der Transport von den Versuchsanlagen zum kommerziellen Schlachthof und zur Unterbringung vor der Schlachtung dauerte etwa 3 h. Die Hühner wurden gemäß den Standardpraktiken des kommerziellen Schlachthauses geschlachtet. Die Schlachtkörper wurden nach 2 h Kühlung bei 2 Grad geborgen und einzeln gewogen, um den Prozentsatz der Schlachtbeizung zu messen [52].

Vierundzwanzig Stunden nach dem Schlachten wurden die Schlachtkörper seziert, um die von den Brüsten abgetrennten großen Brustmuskeln zu erhalten [53].

Während des Versuchs wurde ein Verlust von 17,4 Prozent (25 Hühner) aufgrund von Sterblichkeit verzeichnet. Von den 119 Schlachtkörpern wurden 72 mikrobiologischen Analysen während der Haltbarkeitsdauer zugeordnet (Abschnitt 2.4 erläutert die Bestimmung der Zusammensetzung der Brustmikrobiota durch kulturabhängige und -unabhängige Methoden), während die restlichen 47 eingefroren wurden (-40 Grad ) und anschließend zur Bewertung der ungefähren Zusammensetzungen und Lipidoxidationsraten von rohem und gekochtem Fleisch verwendet (Abschnitt 3.5).

3.4.Bewertung der Haltbarkeit

3.4.1.Zubereitung von verpackter Hähnchenbrust

P-Major-Muskeln wurden einzeln in Schalen aus Polyethylen niedriger Dichte verpackt, die in eine 12 &mgr;m dicke PVC-Folie eingewickelt waren（Weigel,KOEX412,Gruppe Fabbri,Vignola,Modena,Italien) und bei 4±1 Grad in einem Kühlschrank gelagert (Majolo" Plus 100 Seasoning Controller, Majolo, Cadoneghe, Padua, Italien). Die Lichteinwirkung wurde von 8:00 festgelegt. bis 20:00 Uhr mit einer 36-W-Leuchtstofflampe [54] Die Lagereinstellungen wurden mit der Absicht entworfen, die Kühlbedingungen während des Verkaufs nachzuahmen Schlachtdatum

3.4.2. Sensorische Analyse

Eine sensorische Bewertung frischer Brüste wurde gemäß [37]unter Verwendung eines Fehler-3-Punktbewertungssystems (1=nicht akzeptabel,2=akzeptabel, 3=gute Qualität) durchgeführt. Der synthetische sensorische Index (SI) wurde berechnet als [(2 × Geruchsbewertung plus 2 × Farbbewertung plus 1 × Texturbewertung)/5], wobei eine Bewertung von 1,8 als Schwellenwert diente, um verdorbene Proben zu definieren. Die sensorische Analyse wurde von acht geschulten Testpersonen durchgeführt.

3.4.3.Mikrobiologische Analyse von Brustfleisch während der Haltbarkeitsdauer

Mikrobiologische Analysen wurden nach den von [38] beschriebenen Verfahren durchgeführt. M. pectoralis major (etwa 2 cm lang × 1 cm tief × 2 cm breit) wurden aseptisch entlang jeder Brust ausgeschnitten, um eine repräsentative Probe von 25 pro Brust zu erhalten. Die Proben wurden in einem Stomacherbeutel mit 225 ml gepuffertem Peptonwasser gemischt und nach den entsprechenden Verdünnungen analysiert. Für die DNA-Extraktion wurde 1 ml jedes Homogenats in 2-ml-Eppendorf-Röhrchen gesammelt und 1 min bei 13.500 × g zentrifugiert (Eppendorf-Zentrifuge 5425, Hamburg, Deutschland). Dann wurde der Überstand verworfen und das Pellet bei -80 Grad eingefroren. Mehrere mikrobielle Ziele wurden untersucht, um die Dynamik der mikrobiellen Population während der Haltbarkeitsdauer wie folgt zu beschreiben: Die Gesamtzahl lebensfähiger Keime (TVC) und die Gesamtzahl psychrotropher Keime (TPC) wurden auf Plate Count Agar (Biokar Diagnostics, Beauvais, Frankreich) bewertet. , und die Platten wurden bei 30 Grad für 72 Stunden oder bei 4 Grad für 10 Tage inkubiert. Enterobacteriaceae wurden mit Violet Red Galle Glucose Agar (Biokar Diagnostics, Beauvais, Frankreich) bei 37 Grad für 24 h ausgezählt. Milchsäurebakterien (LAB) wurden auf De Man, Rogosa und Sharpe Agar (Biokar Diagnostics, Beauvais, Frankreich) unter anaeroben Bedingungen bei 30 Grad für 48 h analysiert. Die Pseudomonas spp. die Zählung wurde auf Pseudomonas-Agarbasis, ergänzt mit Cetrimid, Fucidin und Cephaloridin, bei 25 Grad für 48 h (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, UK) ausgewertet. Die Zählung der H2S-produzierenden Bakterien (mutmaßliche Shewanella spp.) wurde auf Eisenagar (Lyngby, Laboratorios Conda, Torrejon de Ardoz, Spanien) bei 25 Grad für 48 h durchgeführt. Die Ergebnisse werden als log10 CFU/g Fleisch angegeben.

3.4.4.pH und Tropfverlust

Ein pH-Meter (Portamess 910, Knick, Berlin, Deutschland), ausgestattet mit einer spezifischen Elektrode (Mettler Toledo, Mailand, Italien), wurde verwendet, um die pH-Werte zu messen, indem es dreifach auf der ventralen Seite in die M. pectoralis major eingeführt wurde. Der Tropfverlust wurde gemäß dem von [55] vorgestellten Verfahren unter Verwendung der Beutelmethode bewertet. Ungefähr 2,5 cm große Scheiben, die von der Oberfläche der dorsalen Brüste geschnitten wurden, wurden in Polyethylenbeutel eingeführt und über Nacht bei 2 ± 1 Grad C aufgehängt. Der Tropfverlust (Prozent) wurde durch die folgende Gleichung berechnet: [(Anfangsgewicht – Endgewicht)/Anfangsgewicht ].

3.4.5. Phenolkonzentration in der Nahrung und im Brustmuskel

Die Extraktion von Phenolen wurde mit 5 g einer zerkleinerten Diätprobe durchgeführt, die mit 5 0 ml Methanol/Wasser (80/20 (o/o)-Lösung, enthaltend 20 mg/l butyliertes Hydroxytoluol (BHT), die Mischung, gemischt wurde wurde unter Verwendung eines Stabdispergierers (IKA, T50 Ultra-Turrax, Werke, Staufen, Deutschland) für 1 min bei 7000 U/min homogenisiert, bei 9327 × g für 10 min zentrifugiert und der Überstand gewonnen Das Verfahren wurde zweimal wiederholt und der Extrakt gesammelt wurde dann durch einen Rotationsverdampfer (Büchi Rotavapor, R-210, Schweiz) konzentriert, bis ein Endvolumen von 20 ml erreicht wurde. Eine SPE Bond Elut Jr-C18,1 g Kartusche (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). ), zuvor mit 10 ml Methanol und 10 ml Wasser aktiviert, wurde mit 1 ml wässrigem Extrakt beladen, die Elution wurde mit 50 ml Methanol durchgeführt, Nach Entfernung des Lösungsmittels unter Vakuum wurde der phenolische Extrakt in 1 ml einer Lösung solubilisiert zusammengesetzt aus Methanol/Wasser (50:50 v/v) und durch einen Spritzenfilter aus Polyvinylidenfluorid (PVDF) (0,2 mm) filtriert Die qualitative und quantitative Analyse der phenolischen Verbindungen des Extraktes erfolgte nach [31] durch

HPLC (Mod. 1100 Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), ausgestattet mit einer C18-Säule (Spherisorb ODS-1 (250 mm × 4,6 mm) 5 um Partikelgröße, geliefert von Waters SpA (Mailand, Italien) Die phenolischen Verbindungen wurden unter Verwendung des DAD-Sets bei 280 nm nachgewiesen. Die Quantifizierung von Polyphenolen wurde durch Verwendung einzelner Kalibrierungskurven für jede Verbindung bestimmt und die Ergebnisse werden als mg kg-1 ausgedrückt. Das Hydroxytyrosol (3,{{ 10}}DHPEA) wurde von Cabru SpA (Mailand, Italien) bezogen, Tyrosol p-HPEA wurde von Merck Life Science Srl (Mailand, Italien) bezogen und Verbascosid wurde von Extrasynthese (Genay, Frankreich) bezogen De-Carboxymethyl-Oleuropein-Aglycon (3,4-DHPEA-EDA) wurde gemäß dem in [56] berichteten Verfahren aus nativem Olivenöl extrahiert.

Insgesamt 10 g Fleisch wurden mit 50 ml Methanol und Wasser gemischt（80/20,o/ø）enthält Ameisensäure {{0}},2 Prozent und 20 mg/l BHT. Die Lösung wurde unter Verwendung eines Stabdispergierers (IKA, T50 Ultra-Turrax, Werke, Staufen, Deutschland) für 1 min bei 7000 U/min homogenisiert, bei 4146 × g für 10 min zentrifugiert und der Überstand gewonnen. Der Vorgang wurde zweimal wiederholt, und die beiden Aliquots des Extrakts wurden gesammelt und das Methanol durch einen Rotationsverdampfer (Büchi Rotavapor, R-210, Schweiz) entfernt. 20 ml des wässrigen Extrakts wurden in SPE Bond Elut HF Mega BE-C18,5 g-Kartuschen (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) geladen, die zuvor mit 20 ml Methanol und 20 ml Wasser aktiviert worden waren; die Elution wurde mit 50 ml Methanol durchgeführt. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum wurde der phenolische Extrakt mit 0,5 ml einer Lösung aus Methanol/Wasser wiedergewonnen（50∶50 o/ø）und durch ein Polyvinylidenfluorid filtriert（PVDF）Spritzenfilter (0,2 mm). Die HPLC-Analysen der phenolischen Extrakte wurden gemäß [56] mit der gleichen Ausrüstung wie oben berichtet durchgeführt. Das Hydroxytyrosol wurde unter Verwendung des Fluoreszenzdetektors (FLD) nachgewiesen, der bei einer Anregungswellenlänge von 280 nm und einer Emission von 313 nm betrieben wurde. Die Quantifizierung von Hydroxytyrosol wurde unter Verwendung der Kalibrierungskurve durchgeführt und die Ergebnisse werden als ug/kg ausgedrückt.

3.5. Ungefähre Zusammensetzung, Kochverlust und Fettsäureanalyse

Die ungefähre Zusammensetzung, das Fettsäureprofil und die oxidative Stabilität wurden sowohl an rohen (rechte Seite P. major) als auch an gekochten (linke Seite P. maijor) Proben bewertet. Nach dem Auftauen wurde der Kochverlust gemäß [53] mit folgenden Modifikationen bewertet: Die linke Hälfte jeder Brust wurde gewogen, vakuumverpackt und in einem Wasserbad bei 80 Grad für 45 min gekocht. Danach wurden die Brüste auf 4 Grad schockgekühlt und für 72 h im Kühlschrank (4 Grad) aufbewahrt, bevor sie ausgepackt und erneut gewogen wurden, um den Kochverlust als [(Rohfleischgewicht – gekochtes Fleischgewicht)/Rohfleischgewicht zu berechnen ]×100). Der Muskel, sowohl roh als auch gekocht, wurde fein gemahlen (zweimal 2500 U/min × 10 s, Retsch, Düsseldorf, Deutschland) und einer Feuchtigkeits-, Rohprotein- und Ascheanalyse [57] unterzogen, während der Rohfettgehalt unter Verwendung des vorgestellten Verfahrens bestimmt wurde von [58]. Kurz gesagt, 200 ml Dichlormethan/Methanol 1:1-Mischung wurden zu 5 g der Probe gegeben, bei 11 000/min für 1 min homogenisiert (Ultraturrax T25 Basic, Ika Werke, Staufen, Deutschland) und bei inkubiert 60 C in einem Ofen (PID-System, M120-VF, MPN Instruments, Bernaggio, MB, Italien) für 20 min. Anschließend wurden weitere 100 ml Dichlormethan zugegeben und nach Homogenisierung (11,000/min für 1 min) wurde die Probe filtriert (Schnellfilterpapier) und 100 ml KCl 1 M wurden zum Permeat gegeben. Nach Zentrifugation (AvantiJ-E, Beckman Coulter, Brea, CA, USA) bei 1000 × g für 30 Minuten bei 4 Grad wurde der Überstand abgelassen und der organische Extrakt durch wasserfreies Natriumsulfat filtriert. Ein Aliquot (ca. 10 g) wurde zur gravimetrischen Bestimmung des Fettanteils verwendet, der Rest destilliert (Rotavapor® R-210, Büchi, Essen, Deutschland) und das wasserfreie Fett zur weiteren Analyse verwendet. Fettsäure Methylester (FAMEs) wurden durch Einwiegen von 0,015 g wasserfreiem Fett in ein Glasröhrchen mit Schraubverschluss hergestellt [39], das mit 1 ml 3 M methanolischer HCl (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) solubilisiert wurde. und für 2 h bei 60 Grad inkubiert.Dann wurde 1 ml deionisiertes Wasser zugegeben und,nach dem Mischen,die FAMEs wurden in 1 ml n-Hexan gewonnen. RUHM（1 μL）wurden mit einem Gaschromatographen (Shimadzu Italia Srl, Modell 2014, Mailand, Italien) analysiert, der mit einem Flammenionisationsdetektor (eingestellt auf 250 Grad) und einem Split-Splitlos-Injektor (eingestellt auf 280 Grad). Die Wärmekammer, die die Kapillarsäule (Supelco SP-2560; 100 m × 0,25 mm × 0,2 μm) enthielt, wurde 8 min lang auf 60 Grad gehalten. Die Temperatur wurde dann 1 Minute lang mit einer Geschwindigkeit von 10 Grad/min auf 120 Grad und dann mit einer Geschwindigkeit von 2,5 Grad C/min von 120 auf 240 Grad erhöht. Die letzte Isotherme wurde 20 Minuten lang bei 240 Grad gehalten. Fettsäuren wurden unter Verwendung einer externen Standardmischung (37 Component FAME Mix, Supelco, Deutschland) identifiziert. Die Analysen wurden doppelt durchgeführt.

3.6.Lipidoxidation

Primäre Oxidationsverbindungen wurden als konjugierte Diene durch spektrophotometrische Analyse im ultravioletten Feld unter Verwendung einer modifizierten Version der Methode bestimmt, die im Anhang der Ratsverordnung EU/2015/1833 [59] angegeben ist. Kurz gesagt,0.01±0,001 g wasserfreies Fett wurde in einen 10-ml-Messkolben eingewogen und mit spektrophotometrischem Cyclohexan bis zur Marke gelöst. Ein UV/Vis-Spektrophotometer (Mod. 7800 Jasco UV/VIS, Oklahoma City, OK, USA) wurde verwendet, um die spezifischen Extinktionswerte bei 232 (konjugierte Diene) und 270 nm (konjugierte Triene) unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels wie das zu bestimmen Hinweis. Sekundärprodukte der Lipidoxidation wurden nach der von [60] vorgestellten Methode mit Modifikationen wie folgt bestimmt: In einem Zentrifugenröhrchen wurden 8 ml einer wässrigen Lösung von 5-prozentiger (m/v) Trichloressigsäure und 5 ml n-Hexan vorgelegt wurden zu ungefähr 2 g der homogenisierten Probe hinzugefügt. Nach Homogenisierung mit Ultraturrax für die 30s bei hoher Geschwindigkeit. die Probe wurde für 3 min bei 3000 xg bei 4°C zentrifugiert (Eppendorf 5810R; Eppendorf, Hamburg, Deutschland) und der Überstand wurde entfernt. Die Probe wurde durch einen schnellen Papierfilter filtriert und 2,5 ml des Filtrats wurden zu 2,5 ml einer wässrigen Lösung von 0,02 M Thiobarbitursäure gegeben und für 35 min bei 95 °C in einem thermostatisierten Bad inkubiert (Labor ED{{31} }; Seelbach, Baden-Württemberg, Deutschland). Nach dem Abkühlen wurde die Extinktion unter Verwendung eines auf eine Wellenlänge von 532 nm eingestellten Spektrophotometers gemessen. Die Daten werden in Milligramm Malondialdehyd pro Kilogramm Fleisch ausgedrückt. Die Messungen wurden doppelt an gekochter und roher Hähnchenbrust durchgeführt.

3.7.DNA-Extraktion und Vorbereitung der NGS-Bibliothek

DNA wurde unter Verwendung eines DNeasy PowerSoil DNA Isolation Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) extrahiert. Die Homogenat-Pellets aus Brustfleisch wurden mit 600 ul Lysepuffer aus dem Kit aufgetaut. Kloakenabstriche wurden mit einer sterilen Schere geschnitten und in ein Mikroröhrchen gegeben, das 600 &mgr;l Lysepuffer und 6 &mgr;l 2-Mercaptoethanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) enthielt. Die Röhrchen wurden durch 5-minütiges Vortexen gut gemischt und die Tupfer wurden entfernt. Sowohl für Kloakenproben als auch für Brustfleischpellets wurden insgesamt 100 mg sterile 0,1-mm-Kügelchen (BioSpec, Bartlesville, OK, USA) hinzugefügt, und eine Kugelmühle (TissueLyser, Qiagen, Hilden, Deutschland) wurde verwendet, um den Aufschluss durchzuführen schnelle Schüttelschritte (2×30 s bei 30 Hz). Insgesamt wurden 40 &mgr;l Proteinase K (Qiagen, Hilden, Deutschland) zugegeben und 90 Minuten bei 56 Grad inkubiert. Nach diesem Schritt wurden die Anweisungen des Herstellers des DNeasy PowerSoil9DNA-Isolationskits befolgt. Die Konzentration und Reinheit der DNA wurden unter Verwendung eines Spektrophotometers (NanoDrop ND-1000, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) analysiert.

Ein zweistufiger Amplifikationsansatz wurde verwendet, um die 16S-DNA-Bibliothek zu konstruieren. Die Proben wurden in 20- μl-Reaktionen amplifiziert,jeweils bestehend aus 5 μl verdünnter DNA,{{0}},4 uM jedes Primers (Tabelle 1), 0,25 mM Desoxynukleotid (dNTP), 1 × Phusion HF-Puffer und 1 U Phusion High-Fidelity-DNA-Polymerase (New England BioLabs, Inc., Ipswich , MA, USA). Die PCR wurde in einem 2720 Thermocycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) mit 25 Zyklen von 95 Grad für 30 Sekunden, 60 Grad oder 49 Grad C für 30 Sekunden, 72 Grad C für 45 Sekunden und einer abschließenden Verlängerung von durchgeführt 7 Minuten bei 72 Grad. Pro Probe wurden drei PCR-Replikate durchgeführt.

Die Produkte wurden unter Verwendung des SPRIselect-Reinigungskits (Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN, USA) gereinigt, und nach der Kügelchenreinigung wurde die Zielbande unter Verwendung von 1,8-prozentigem Agarosegel bestätigt. Barcodes wurden durch eine zweite PCR-Analyse mit plattformspezifischen Barcode-tragenden Primern eingeführt. Jede 50- ul PCR-Reaktion enthielt das PCR-Produkt, 0,2 μM jedes Primers（Tabelle 1）,0.3 mMdNTP,1×Phusion HF-Puffer,und 1UPhusion High-Fidelity-DNA-Polymerase. Zehn Zyklen des oben beschriebenen PCR-Profils wurden durchgeführt.

PCR-Produkte wurden unter Verwendung des SPRIselect-Reinigungskits (Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN, USA) gereinigt. Nach der Endreinigung wurde jede Probe mit einem Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Life Technologies, Monza, Italien) quantifiziert. Die Qualität der Amplikonbibliothek wurde unter Verwendung eines Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) getestet. Bibliotheken wurden unter Verwendung der Illumina MiSeq-Plattform mit einem Paired-End-300--Zykluslauf (Macrogen Inc., Seoul, Korea) sequenziert.

4. Schlussfolgerung

Die Anreicherung des Hühnerfutters mit Phenolen, die durch Filtrieren und Konzentrieren von Pflanzenwasser aus Ölmühlen für 24 Tage gewonnen wurden, war nicht mit Unterschieden im Tierwachstum, der Futterverwertung oder der Schlachtkörperausbeute verbunden. Die Untersuchung der Darmmikrobiota zeigte einen signifikanten Einfluss der Fütterungszeit, aber nicht der Ernährung per se auf den Wechsel der mikrobiellen Gruppen. Andererseits zeigte die Mikrobiota-Zusammensetzung des Fleisches während der Haltbarkeitsdauer ein stärkeres Wachstum von Pseudomonas in den Proben von Hühnern, die mit Phenolen angereichertes Futter verzehrten. Schließlich wurden keine Unterschiede zwischen den Diäten in Bezug auf die analytischen Marker (TBARs und konjugierte Diene) des Lipidoxidationsprozesses beobachtet. Stattdessen wurde Hydroxytyrosol im Muskelgewebe der Proben von Hühnern identifiziert, die Futter mit zugesetzten Phenolen verzehrten, was eine dosisabhängige intestinale Resorption zeigte. Da der oxidative Prozess hauptsächlich in der Membranstruktur der Muskelzellen stattfindet, sind weitere Studien notwendig, um die Verteilung von HT in den zellulären und extrazellulären Kompartimenten besser zu verstehen.

Dieser Artikel ist ein Auszug aus Molecules 2021, 26, 4307. https://doi.org/10.3390/molecules26144307 https://www.mdpi.com/journal/molecules