Verbesserung der Biosynthese von Phenylethanoidglykosiden in Zellkulturen von Cistanche Deserticola durch osmotischen Stress

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Chun-Zhao Liu. Xi-Yu Cheng

AbstraktDie Wirkung von osmotischem Stress auf das Zellwachstum und die Biosynthese von Phenylethanoidglykosiden (PeGs) wurde in Zellsuspensionskulturen von untersuchtCistanche DeserticolaYC Ma, eine Heilpflanze aus der Wüste, die in der westlichen Region Chinas angebaut wird. Verschiedene anfängliche Saccharosekonzentrationen beeinflussten signifikant das Zellwachstum und die PeGs-Biosynthese in den Suspensionskulturen, und das höchste Trockengewicht und die höchste PeGs-Akkumulation erreichten 15,9 gl–1-DW bzw. 20,7 mg g–1-DW bei der anfänglichen Osmose Belastung von 300 mOsm kg–1, wobei die Saccharosekonzentration 175,3 mM betrug. Stöchiometrische Analysen mit verschiedenen Kombinationen von Saccharose und nicht-metabolischem Zucker (Mannit) oder osmotischen Nicht-Zucker-Mitteln (PEG und NaCl) zeigten, dass osmotischer Stress selbst ein wichtiger Faktor für die Steigerung der PeGs-Biosynthese in Zellsuspensionskulturen von warCistanche Deserticola. Die maximalen PeG-Gehalte von 26,9 und 23,8 mg g–1-DW wurden nach 21 Tagen bei den Kombinationen von 87,6 mM Saccharose mit 164,7 mM Mannit (303 mOsm kg–1) bzw. 20 mM PEG erreicht, was höher war als die von C. deserticola-Zellkulturen, die unter einer anfänglichen Saccharosekonzentration von 175,3 mM nach 30 Tagen gezüchtet wurden. Die stimulierte PeGs-Akkumulation in den Zellsuspensionskulturen wurde mit der durch osmotischen Stress induzierten Zunahme der Phenylalanin-Ammonium-Lyase (PAL)-Aktivität korreliert.

Schlüsselwörter Cistanche Deserticola, Wüstenheilpflanze, Phenylethanoidglykoside, Osmotischer Stress, Phenylalanin-Ammoniak-Lyase

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Einführung

Cistanche DeserticolaYC Ma, ein wertvolles chinesisches Kraut, parasitiert die Wurzeln von Haloxylon ammodendrun und wächst in den Wüstengebieten Westchinas. Phenylethanoidglykoside (PeGs), die wichtigsten bioaktiven Komponenten, die aus C. deserticola isoliert wurden, haben ausgeprägte Aktivitäten beim Abfangen freier Radikale, der Stärkung der Immunität, der Verbesserung der sexuellen Funktion usw. (Zong et al. 1996; Lu 1998; Wang et al. 2001). Durch unkontrollierte Ausbeutung und Nutzung vonCistanche Deserticola, die natürliche Ressource vonCistanche Deserticola war am Rande der Erschöpfung. Angesichts dieser Probleme wurde die PeGs-Produktion durch Zellsuspensionskulturen von C. deserticola als vielversprechende Alternative zur Lösung des Mangels angesehenCistanche DeserticolaPflanzenmaterialien (Lu und Mei 2003; Ouyang et al. 2003; Cheng et al. 2005a).

Osmotischer Stress ist ein wichtiger Faktor, der das Pflanzenwachstum, die Entwicklung, die Morphogenese und die Bildung von Sekundärmetaboliten beeinflusst. Bei einigen Arzneipflanzenarten wurde über eine verstärkte Produktion von Sekundärmetaboliten aus in vitro-Gewebekulturen unter optimalem osmotischem Stress berichtet (Kim et al. 2001; Wang et al. 1999; Wu et al. 2005). Saccharose ist ein in diesen Fällen übliches osmotisches Stressmittel und dient auch als lebenswichtige Kohlenstoff- und Energiequelle. Daher ist es sehr schwierig, die Wirkung von osmotischem Stress und die ernährungsphysiologische Rolle von Zuckern als Kohlenstoffquellen zu trennen. Eine Erhöhung des anfänglichen osmotischen Stresses mit nicht-metabolischem Mannit, Sorbit und PEG verbesserte auch die Akkumulation von Paclitaxel in Zellkulturen von Taxus Chinensis, die Akkumulation von Saponin und Polysacchariden in Zellkulturen von Panax Notoginseng und die Akkumulation von Eleutherosiden in embryogenen Kulturen von Eleutherococcus sessiliflorus (Zhang et al. 1995; Kim et al. 2001; Shohael et al. 2006). Ihre Ergebnisse zeigten, dass die Auswirkungen der Kohlenhydratkonzentration und des osmotischen Stresses je nach Pflanzenart und Sekundärmetaboliten unterschiedlich waren.

Das Ziel der aktuellen Studie konzentriert sich auf die osmotischen Wirkungen von Saccharose, Mannit, PEG und NaCl auf das Zellwachstum und die Biosynthese von PeGsCistanche DeserticolaZellsuspensionskulturen. Die PAL-Aktivität in den Suspensionskulturen wurde unter verschiedenen Kombinationen anfänglicher osmotischer Mittel untersucht, und der mögliche Mechanismus einer verbesserten PeGs-Akkumulation durch zunehmenden osmotischen Stress wird diskutiert.

Materialen und Methoden

Pflanzenmaterialien und Callus-Induktion

Samen vonCistanche DeserticolaYC Ma wurden aus Wüstengebieten in der Provinz Xinjiang in China gesammelt und vor der Verwendung in 4C gelagert. Die botanische Identität wurde durch Vergleich mit Referenzstandards am Institut für Botanik der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, VR China, bestätigt. Die Samen wurden oberflächensterilisiert, indem sie 30 Sekunden lang in 70-prozentiges Ethanol eingetaucht und dann 20 Minuten lang in eine 20-prozentige wässrige Lösung von 5,4 Prozent Natriumhypochlorit in Wasser eingetaucht wurden, gefolgt von drei Spülungen mit sterilem destilliertem Wasser. Calli wurden aus den oberflächensterilisierten Samen von induziertCistanche Deserticolaauf MS (Murashige und Skoog 1962) Medium ergänzt mit 1,0 mg l–1 Naphthalinessigsäure (NAA), 2,0 mg l–1 6-Benzyladenin ({{7} }BA), 0,25 mg l–1 2, 4-Dichlorphenoxyessigsäure (2, 4-D), 6 gl–1 Agar (PhytoTechnology LaboratoriesTM, Produkt-ID: A181) und 30 gl–1 Saccharose für 60 Tage in einem Wachstumsschrank im Dunkeln bei 25°C. Die aus den Samenexplantaten induzierten Kalluskulturen wurden anschließend im Abstand von 30 Tagen auf obiges Festmedium subkultiviert (Cheng et al. 2005a).

Etablierung und Pflege von Zellsuspensionskulturen

Die Suspensionskalluskulturen (3,0 g Frischgewicht), die durch ein 1,000 lm-Sieb filtriert und auf einem 200 lm-Sieb zurückgehalten wurden, wurden in einen 500- ml Erlenmeyer subkultiviert Kolben, der 100 ml des obigen flüssigen Mediums enthielt, auf einem Rotationsschüttler bei 110 U/min bei 25°C im Dunkeln in einem Subkulturintervall von 18 Tagen gezüchtet. Der pH-Wert des Mediums wurde vor dem Autoklavieren mit 1 M NaOH oder 1 M HCl auf 5,8 eingestellt. Die nach zehnmal subkultivierten Suspensionskalluskulturen wurden als Inokulum für die folgende experimentelle Kolbenkultur verwendet. Alle Kolbenexperimente wurden in 250-ml-Erlenmeyerkolben durchgeführt, die 50 ml flüssiges Medium mit 30 gl–1 Saccharose enthielten und mit 1,5 g Frischgewicht von 18- eintägigen Zellsuspensionskulturen beimpft wurden. Diese Erlenmeyerkolben wurden auf einem Rotationsschüttler (110 U/min) bei 25°C im Dunkeln inkubiert.

Osmotisches Stressexperiment

Um die Wirkung der anfänglichen Saccharosekonzentration auf zu untersuchenZellwachstum und Anhäufung von PeGs,Cistanche DeserticolaSuspensionskulturen wurden in MS-Medium mit 87,6 kultiviert,175,3 und 262,9 mM Saccharose. Bei osmotischen StresszuständenCistanche DeserticolaSuspensionskulturen wurden in MS inkubiertMedium mit 87,6 mM Saccharose kombiniert mit164,7 mM Mannitol. Andere osmotische Mittel (PEG 4, 000 undNaCl) wurden im Äquivalent der Osmolarität zugesetzt87,6 mM Saccharose. Die osmotisch äquivalenten Konzentrationenvon osmotischen Mitteln wurden experimentell als PEG bestimmt4, 000 von 20 mM bzw. NaCl von 50 mM. Dreifachkolben wurden in allen Experimenten und allen Werten verwendetwaren die Mittelwerte von Dreifachkolben ± SD.

Analyse

Cistanche Deserticolakultivierte Zellen unter verschiedenen osmotischen Belastungen wurden mit einem Nikon-AFX-DX-Lichtmikroskop (Nikon, Japan) bei 400-facher Vergrößerung beobachtet. Die Osmolarität des Kulturmediums wurde mit einem Dampfdruckosmometer (Fiske One-Ten Osmometer, MA, USA) gemessen. Für die Frischgewichtsbestimmung (FW) wird dieCistanche DeserticolaDie Zellen wurden vorsichtig auf Filterpapier gepresst, um überschüssiges Wasser zu entfernen, und gewogen. Anschließend wurden die Zellen 24 h bei 60°C in einem Ofen getrocknet und das Trockengewicht (TG) aufgezeichnet. Die Restzuckerkonzentration wurde mit Phenol und konzentrierter Schwefelsäure bestimmt, wobei Glucose als Standard verwendet wurde (Dubois et al. 1956).

PeGs wurden aus den getrockneten Zellen mit Methanol für 15 min bei 60°C in einem Ultraschallwasserbad (KQ2200, Shanghai Cany Precision Instrument Co., Ltd, China) mit einer Frequenz von 40 kHz und einer Leistung von 100 W extrahiert. Das Filtrat wurde konzentriert und der Rückstand wurde in destilliertem Wasser gelöst und dann durch eine makroretikuläre Harzsäule (AB-8, chemisches Produkt der Nankai-Universität, Tianjin, China) geleitet. Das Methanol-Eluat wurde gesammelt und der Gesamt-PeGs-Gehalt bei 333 nm unter Verwendung von Echinacosid als Standard bestimmt (Du und Liu 1993a; Du et al. 1993b).

Die Zelllebensfähigkeit wurde durch Reduktion von 2, 3, 5- Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) abgeschätzt (Steponkus und Lanphear 1967). Der Lebensfähigkeitsindex ist definiert als die Extinktion, gemessen pro Gramm frischem Gewebe. Die Bestimmung der PAL-Aktivität basierte auf der Methode von Koukol und Conn (1961). Eine Einheit der PAL-Aktivität (U) ist definiert als das Ausmaß der Extinktionsvariation von 0,01.

Resultate und Diskussion

Wirkung der anfänglichen Saccharosekonzentration auf das Zellwachstum und die PeGs-Biosynthese in Zellsuspensionskulturen vonCistanche Deserticola.Die Antwort vonCistanche DeserticolaZellsuspensionskulturen auf eine anfängliche Saccharosekonzentration zwischen 87,6 und 262,9 mM getestet. Wie in Fig. 1 gezeigt, wuchsen die Zellen schnell und akkumulierten PeGs bei einer niedrigen anfänglichen Saccharosekonzentration von 87,6 mm, und das Zellwachstum und die PeGs-Akkumulation wurden offensichtlich bei einer hohen anfänglichen Saccharosekonzentration von 262,9 mM unterdrückt. Das Verhältnis von Frischgewicht zu Trockengewicht nahm ab, wenn die anfängliche Saccharosekonzentration von 87,6 auf 262,9 mM stieg (Daten nicht gezeigt). Das maximale Trockengewicht von 15,9 gl–1 und der PeGs-Gehalt von 20,7 mg g–1-DW wurden am 30. Tag bei einer anfänglichen Saccharosekonzentration von 175,3 mM erreicht, deren Osmolarität etwa 300 mOsm kg–1 betrug. Unter mikroskopischer Beobachtung wurden Zellwände von ihrem Zytoplasma bei der höchsten osmotischen Belastung von 388 mOsm kg–1 getrennt, wobei eine anfängliche Saccharosekonzentration 262,9 mM betrug (Abb. 2), und die höchste osmotische Belastung könnte den Metabolismus von Zellen stören und dazu führen starke Wachstumsunterdrückung und Abnahme der PeGs-Biosynthese. Ein ähnliches Phänomen wurde auch in Suspensionskulturen von T. Chinensis-Suspensionszellkulturen beobachtet, und die optimale Saccharosekonzentration für die Paclitaxel-Produktion betrug 175,3 mM (Kim et al. 2001). Eine anfängliche Saccharosekonzentration von 204,5 mM war jedoch vorteilhaft für das Wachstum von E. sessiliflorus-Zellkulturen. Eine höhere Saccharosekonzentration von 262,9 mM verstärkte die Biosynthese von Eleutherosiden, Phenol und Flavonoiden in den Eleutherococcus-Kulturen (Shohael et al. 2006). Es ist klar, dass die anfängliche Saccharosekonzentration für das Wachstum und die Akkumulation von sekundären Metaboliten von Pflanzenzellkulturen wichtig ist und ihre Wirkung mit einer spezifischen Zelllinie zusammenhängt.

Wirkung verschiedener osmotischer Mittel auf das Zellwachstum und die PeGs-Biosynthese in Zellsuspensionskulturen von C. deserticola

Verständnis der osmotischen Rolle von metabolischer Saccharose und anderen nicht-metabolischen chemischen Substraten bei der PeGs-Biosynthese in Zellsuspensionskulturen vonCistanche Deserticolawurde eine Reihe von Experimenten unter Verwendung von Saccharose in Kombination mit den nicht-metabolischen osmotischen Mitteln (Mannit, PEG und NaCl) durchgeführt. In diesen Experimenten wurden 164,7 mM Mannitol, 20 mM PEG und 50 mM NaCl zu dem Medium hinzugefügt, das 87,6 mM Saccharose enthielt, und bewirkten eine anfängliche Osmolarität von etwa 300 mOsm kg–1, was einem äquivalenten osmotischen Zustand entspricht, vergleichbar mit dem Medium mit 175,3 mM Saccharose.

Wie in Abb. 3a, b gezeigt, hemmte die Zugabe von Mannitol (nicht metabolischer osmotischer Zucker) und PEG (nicht durchlässiger osmotischer Wirkstoff) die Zellwachstumsrate leicht, verbesserte jedoch die PeGs-Biosynthese signifikantCistanche DeserticolaZellsuspensionskulturen. Die maximalen PeGs-Gehalte von 26,9 bzw. 23,8 mg g–1-DW wurden am 21. Tag erreicht, als die Zellen in Kombinationen von 87,6 mM Saccharose mit entweder 164,7 mM Mannitol (303 mOsm kg–1) oder 20 mM PEG (299 mOsm kg–1). Die PeGs-Beträge waren höher als die vonCistanche DeserticolaZellkulturen, die in flüssigem MS-Medium mit einer anfänglichen Saccharosekonzentration von 175,3 mM am Tag 30 gezüchtet wurden. Zucker wurde im Laufe der Zeit allmählich verbrauchtCistanche DeserticolaZellkultur, und dann sank der zuckerinduzierte osmotische Stress entsprechend ab (Abb. 3c, d). Der osmotische Stress des flüssigen Mediums mit einer anfänglichen Saccharosekonzentration von 175,3 mM fiel von 280 auf 110 mOsm kg–1, als sich die PeGs in den Zellkulturen am 9. Tag zu akkumulieren begannen und am 30. Tag ihr Maximum erreichten (Daten nicht gezeigt). Nicht-metabolische osmotische Mittel (Mannitol und PEG) wurden im Verlauf der Zellkultur nicht verbraucht, wodurch der osmotische Stress des flüssigen Mediums zwischen 200 und 280 mOsm kg–1 gehalten werden konnte, ein osmotischer Druck, der für die Biosynthese von PeGs günstig ist. Diese Ergebnisse zeigten, dass osmotischer Stress selbst eine wichtige Rolle bei der Verstärkung der PeGs-Biosynthese in derCistanche DeserticolaZellkulturen.

Es wurde berichtet, dass die Zugabe von NaCl die Biosynthese von Indolalkaloiden bzw. Saponin in Zellkulturen von Catharanthus roseus und Panax Ginseng verbessert (Smith et al. 1987; Wu et al. 2005), aber die Behandlung mit NaCl unterdrückte das Zellwachstum von T. Chinensis während sie keinen Unterschied in der Palitaxel-Biosynthese zeigen (Kim et al. 2001). Daher ist für jeden Fall eine genaue Untersuchung notwendig. Die Zugabe eines osmotischen Äquivalents von 50 mM NaCl unterdrückte das Zellwachstum und die Biosynthese von PeGs. Dieses Ergebnis könnte auf die durchlässige Natur von NaCl zurückzuführen sein, die für die Zellkulturen dieser Wüstenpflanzenart, die Trockenstress sehr gut tolerieren kann, nicht vorteilhaft ist.

Abb. 3 Wirkung der Kombinationen von Saccharose und anderen nicht-metabolischen osmotischen Mitteln auf Zellwachstum (a), PeGs-Akkumulation (b), Zuckerverbrauch (c) und osmotische Stressänderung (d) im Verlauf von C. deserticola-Zellen Kultur. Die Werte sind Mittelwerte von Dreifachkolben ± Standardabweichung

Wirkung verschiedener osmotischer Mittel auf die Zelllebensfähigkeit und PAL-Aktivität in Zellsuspensionskulturen von Cistanche deserticola

In unseren früheren Studien (Cheng et al. 2005b, 2006) stimulierte die Elicitor-Zugabe die PeGs-Biosynthese dramatischCistanche DeserticolaZellkulturen, und die Stimulation korrelierte mit einer erhöhten Aktivität von PAL, dem ersten Schlüsselenzym in der PeGs-Biosynthese (Hahlbrock und Grisebach 1979). Wie in Fig. 4 gezeigt, verringerte die Zugabe von nicht-metabolischem 164,7 mM Mannitol oder 20 mM PEG in flüssiges MS-Medium, das 87,6 mM Saccharose enthielt, die Zelllebensfähigkeit leicht, erhöhte jedoch signifikant die PAL-Aktivität, die höher war als die, die durch eine anfängliche Saccharosekonzentration von induziert wurde 175,3 mM. Die erhöhte PeGs-Akkumulation inCistanche DeserticolaZellsuspensionskulturen wurde mit der Zunahme der PAL-Aktivität in Verbindung gebracht, die durch osmotischen Stress selbst stimuliert wurde. Eine anfängliche Saccharosekonzentration von 175,3 mM in flüssigem MS-Medium verursachte eine Abnahme der Zelllebensfähigkeit in 15 Tagen und hemmte die PAL-Aktivität in 21 Tagen. Nach einer Zeit des Zuckerverbrauchs durch den AnbauCistanche DeserticolaZellkulturen nahmen sowohl die Zelllebensfähigkeit als auch die PAL-Aktivität der kultivierten Zellen zu und erreichten ihre Maxima an Tag 24 bzw. Tag 30. Es wurde auch beobachtet, dass eine erhöhte PAL-Aktivität durch osmotischen Stress die Saponin-Biosynthese in P.-ginseng-Zellkulturen und die Alkaloidakkumulation in kultivierten C.-roseus-Zellen verbessert (Godoy-Hernandez et al. 2000; Wu et al. 2005). Jedoch verringerte die Zugabe von durchlässigem NaCl in flüssiges MS-Medium, das 87,6 mM Saccharose enthielt, die Lebensfähigkeit der Zellen und hemmte die PAL-Aktivität während der gesamten Kulturdauer. Dadurch wurden offensichtlich sowohl das Zellwachstum als auch die PeGs-Biosynthese unterdrückt.

Abb. 4 Variation der Zellviabilität (a) und PAL-Aktivität (b) in C. deserticola-Zellkulturen unter unterschiedlichem osmotischem Stress im Verlauf vonCistanche DeserticolaZellkultur. Die Werte sind Mittelwerte von Dreifachkolben ± Standardabweichung

Cistanche Deserticolaist eine Wüstenart, und die Untersuchung einer Wüstenart in vitro-Zellkulturen stellte neue Herausforderungen und Möglichkeiten für das Verständnis der Pflanzenphysiologie und ökologischen Anpassungen dar. In dieser Studie entwickelten wir ein System mit dem Potenzial, einen durch osmotischen Stress vermittelten Signaltransduktions-Biosyntheseweg zu untersuchen, und das System lieferte die Grundlage für die großtechnische Produktion von PeGs unter Verwendung vonCistanche DeserticolaZellkulturen durch eine neue, durch osmotischen Stress regulierte Strategie.

Danksagungen

Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung durch das Innovation Research Program der Chinesischen Akademie der Wissenschaften.

Aus: 'Enhancement of phenylethanoid glycosides biosthesis in cell cultures of Cistanche deserticola by osmotic stress' von Chun-Zhao Liu. Xi-Yu Cheng

---Plant Cell Rep (2008) 27:357–362 DOI 10.1007/s00299-007-0443-3

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