Verbesserung der Top-Down-Proteomik von Hirngewebe mit FAIMS Teil 1

Abstrakt

Proteomische Untersuchungen der Alzheimer- und Parkinson-Krankheit haben wertvolle Erkenntnisse über neurodegenerative Erkrankungen geliefert. Bisher beschränkten sich diese Untersuchungen weitgehend auf Bottom-up-Ansätze, was die Charakterisierung des „intakten“ Zustands eines Proteins erschwerte.

Die Alzheimer-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die irreversible Auswirkungen auf das Gedächtnis und die kognitiven Fähigkeiten einer Person hat. Obwohl Menschen die Krankheit nicht vollständig heilen können, kann durch sorgfältige Behandlung und Vorbeugung das Fortschreiten der Krankheit so weit wie möglich verlangsamt und die körperliche und geistige Gesundheit des Patienten erhalten werden.

Das Gedächtnis ist einer der offensichtlichsten Aspekte, die bei Alzheimer-Patienten beeinträchtigt sind. Sie vergessen oft wichtige Informationen, wie ihren Namen, die Namen ihrer Lieben, wichtige Daten usw. Darüber hinaus kann es auch passieren, dass einige fortgeschrittene selbstlernende Vokabeln, wie etwa abstrakte Konzepte und Synonyme, vergessen werden. Mit etwas kognitivem Training und Behandlung können Alzheimer-Patienten jedoch in einigen Aspekten ihr Gedächtnis aufrechterhalten.

Obwohl die Alzheimer-Krankheit negative Auswirkungen haben kann, sollten wir sie positiv sehen. Erstens können wir sie besser verhindern und behandeln, indem wir das Bewusstsein und das Verständnis für die Krankheit schärfen. Zweitens können Betreuer und Familienangehörige von Alzheimer-Patienten auch lernen, effektiv mit ihnen zu kommunizieren und zu interagieren, um den Patienten dabei zu helfen, ihre Selbstwürde zu bewahren und so glücklich wie möglich zu leben.

Obwohl die Alzheimer-Krankheit irreversible Auswirkungen auf das Gedächtnis und die kognitiven Fähigkeiten haben kann, sollten wir im Allgemeinen eine optimistische Haltung bewahren und versuchen, das Fortschreiten der Krankheit durch Behandlung und vorbeugende Maßnahmen zu verlangsamen. Gleichzeitig sollten wir denjenigen, die sich um Patienten mit Alzheimer-Krankheit kümmern, mehr Hilfe und Unterstützung bieten und gemeinsam eine herzlichere und interaktivere Gemeinschaft schaffen. Es ist ersichtlich, dass wir das Gedächtnis verbessern müssen. Cistanche kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da es sich um ein traditionelles chinesisches Arzneimittel mit vielen einzigartigen Wirkungen handelt, darunter auch die Verbesserung des Gedächtnisses. Die Wirkung von Cistanche beruht auf den verschiedenen darin enthaltenen Wirkstoffen, darunter Gerbsäure, Polysaccharide, Flavonoidglykoside usw. Diese Inhaltsstoffe können die Gesundheit des Gehirns auf vielfältige Weise fördern.

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Top-Down-Proteomik (TDP) überwindet diese Einschränkung; Allerdings beschränkt es sich typischerweise darauf, nur die am häufigsten vorkommenden Proteoformen relativ kleiner Größe zu beobachten.

Daher werden häufig Fraktionierungstechniken eingesetzt, um die Probenkomplexität zu reduzieren. Hier untersuchen wir die Gasphasenfraktionierung mittels Hochfeld-Ionenmobilitätsspektrometrie mit asymmetrischer Wellenform (FAIMS) innerhalb von TDP.

Anhand einer hochkomplexen Probe aus Gehirngewebe der Alzheimer-Krankheit (AD) beschreiben wir, wie die Zugabe von FAIMS zu TDP die Tiefe der Proteomabdeckung erheblich verbessern kann.

Beispielsweise könnte die Implementierung von FAIMS mit externer Kompensationsspannung (CV) in Schritten von –50, –40 und –30 CV die mittlere Anzahl nicht-redundanter Proteoformen, Gene und Proteomsequenzabdeckung im Vergleich zu ohne FAIMS mehr als verdoppeln.

Wir haben auch herausgefunden, dass FAIMS die Übertragung von Proteoformen und ihren Ladungshüllen basierend auf ihrer Größe beeinflussen kann. Wichtig ist, dass FAIMS die Identifizierung intakter Amyloidbeta (A)-Proteoformen ermöglichte, einschließlich der zur Aggregation neigenden A 1–42-Variante, die stark mit AD verknüpft ist.

Rohdaten und zugehörige Dateien wurden über das MassIVE-Datenrepository mit der Datensatzkennung PXD023607 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt.

EINFÜHRUNG

In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich die Inzidenz neurodegenerativer Erkrankungen weltweit mehr als verdoppelt, wobei die Alzheimer-Krankheit (AD) die häufigste Form ist.1 Zwei Proteinarten, Amyloid-Beta(A)-Peptide und phosphoryliertes Mikrotubuli-assoziiertes Protein Tau(Tau), 2–5 sind stark mit AD verbunden.

Daher war eine detaillierte Proteomecharakterisierung von AD von besonderer Bedeutung.6,7 Die Massenspektrometrie spielte bei diesen Untersuchungen eine zentrale Rolle,8 vorwiegend durch Bottom-up-Ansätze.9–16

Der für Bottom-up-Analysen erforderliche Proteaseverdau behindert jedoch die Erfassung des vollständigen Zustands eines Proteins, der aufgrund genetischer Allele, alternativem Spleißen, proteolytischer Verarbeitung und posttranslationaler Modifikationen (als „Proteoformen“ bezeichnet) variieren kann.17– 20

Da Top-Down-Proteomik-Ansätze (TDP) Proteine ​​in einem intakten Zustand analysieren, ist die Wahrscheinlichkeit, mit bestimmten Pathologien assoziierte Proteoformen zu erfassen, größer und ermöglicht eine stärkere, direktere Verbindung zwischen Genotyp und Phänotyp.20–22

Beispielsweise eignet sich TDP besonders gut zum Einfangen endogener proteolytischer Fragmente, die von Proteinen wie Tau stammen, die mit der Alzheimer-Pathologie in Verbindung gebracht werden.23–26 Mehrere frühere TDP-Anwendungen haben sich als vielversprechend bei der Aufdeckung regionaler Heterogenität des Gehirnproteoms und neuronaler Veränderungen als Reaktion auf verschiedene Reize erwiesen .27–30

Allerdings erfordert die TDP komplexer Proben typischerweise Offline-Fraktionierungstechniken, um die Probenkomplexität zu reduzieren, da das menschliche Proteom mehrere Größenordnungen in Größe und Häufigkeit umfasst und Proteine ​​im Allgemeinen mit der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (LC) nicht gut aufgelöst werden.31

Diese Offline-Fraktionierung kann unter anderem durch Gel-eluierte Flüssigfraktionseinschlusselektrophorese, Größenausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder Affinitätsreinigung erreicht werden.22,32–35

Leider verringert die Offline-Fraktionierung in der Regel die Ausbeute und den Durchsatz, da sie eine längere Probenhandhabung erfordert.36 Die Ionenmobilitätstrennung in der Gasphase ist eine attraktive Fraktionierungsalternative, die zwischen der LC- und der MS-Dimension eingeführt werden kann, ohne dass zusätzliche Probenhandhabungsschritte erforderlich sind.

Die Hochfeld-Ionenmobilitätsspektrometrie mit asymmetrischer Wellenform (FAIMS) ist für diese Aufgabe besonders gut geeignet, da kürzlich das FAIMS Pro-Gerät eingeführt wurde, dessen modularer Aufbau die einfache Integration der Ionenmobilität in mehrere aktuelle Orbitrap-Instrumente ermöglicht.37

FAIMS, auch als Differentialmobilitätsspektrometrie bezeichnet, trennt Ionen in einem Trägergas basierend auf Kombinationen von Faktoren wie Größe, Ladung oder Form durch die Einführung einer asymmetrischen Wellenform mit hohen und niedrigen elektrischen Feldern.38 Um eine Kollision der Ionen mit dem zu verhindern Elektrode wird durch das Anlegen einer Gleichstromkompensationsspannung (CV) eine Abweichung im Pfad des Ions eingeführt,39 die eine selektive Übertragung dieses Ions ermöglicht.38

Die Anwendung von FAIMS auf die Analyse intakter Proteine ​​war weitgehend auf die Trennung von Konformeren einzelner Proteine ​​oder kleiner Kombinationen von Proteinen beschränkt;40–45

Allerdings wurde FAIMS kürzlich auf Analysen intakter und nativer Proteine ​​mittels Flüssigkeitsextraktionsoberflächenanalyse angewendet.46–50Hier wenden wir die FAIMS-TDP-Analyse auf eine Gesamtgewebeprobe aus dem medialen Frontalkortex (MFC) eines Alzheimer-Patienten an.

Das Scannen über einen CV-Bereich von –50 bis –20 CV mit externen Schritten ermöglichte es uns zu bestimmen, wie sich die Modulation des FAIMS CV auf die Eigenschaften der durch die zylindrische FAIMS-Einheit übertragenen Ionen auswirkt und wie dieser Zusammenhang genutzt werden kann, um Proteoformen basierend auf der Größe anzusprechen.

FAIMS-TDP hat die Identifizierung von Proteoformen bei einem einzigen CV im Vergleich zu ohne FAIMS mehr als verdoppelt und eine tiefere Untersuchung von Proteoformen ermöglicht, die für neurodegenerative Erkrankungen relevant sind, einschließlich -, - und -Synucleine, PARK7, Tau-Spleiß-Isoformen und mehrere intakte A-Proteoformen.

Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit, wie durch Gasphasenfraktionierung mit FAIMS in TDP reproduzierbar eine bessere Identifizierung von Proteoformen und Proteomabdeckung erreicht werden kann.

METHODEN

Probenvorbereitung

Die MFC-Probe wurde vom Alzheimer's Disease Center der Rush University erhalten. Bei den Teilnehmern handelte es sich um in Kliniken stationierte ältere Personen, die zwischen 1992 und 2005 mit Gedächtnisstörungen und/oder Demenz eingeschrieben waren.

Sie wurden in der Rush Memory Clinic auf mögliche Demenz untersucht und stimmten einer Gehirnspende als Teil des klinischen Kerns des Rush Alzheimer'sDisease Core Center zu. Die Studie wurde vom Institutional Review Board des Rush University Medical Center genehmigt.

Nach dem Tod stimmten die nächsten Angehörigen einer Autopsie zu. Die gesamte kognitive Diagnosekategorie des Patienten war Alzheimer-Demenz ohne andere Ursachen einer kognitiven Beeinträchtigung,51 während das Obduktionsintervall 230 Minuten betrug.

Alle Schritte zur Probenhandhabung wurden mit BSL{{0}}-Vorsichtsmaßnahmen durchgeführt. 33 mg MFC-Gewebe, gelagert bei –80 Grad, wurden in 1,5-ml-LoBind-Eppendorf-Röhrchen (Eppendorf, Kat.-Nr. 022431081) unter Zugabe von 0,5 ml Homogenisierungspuffer bestehend aus 8 M Harnstoff, 10 mM Ammoniumbicarbonat (ABC) und 10 mM überführt Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) bei pH7,5.

Die Homogenisierung wurde durch physikalischen Aufschluss erreicht, indem ein handbetriebener motorbetriebener Pelletstößel 30 s lang eingesetzt wurde (BioVortexer mit SpiralPestle; Biospec 1083 und 1017), bevor 0,5 ml Homogenisierungspuffer bei Raumtemperatur hinzugefügt wurden.

Anschließend wurde die Probe 60 Minuten lang bei 37 Grad und 1200 U/min mit einem ThermoMixer inkubiert, um die Extraktion und Denaturierung zellulärer Proteine ​​zu ermöglichen. Die Pelletierung des in Harnstoff unlöslichen Materials erfolgte durch 20-minütige Zentrifugation bei 18 g und 22 °C. Der resultierende Überstand wurde dann zu 3 ml Waschpuffer (WB; 8 M Harnstoff, 10 mM ABC, pH 7) gegeben .5) innerhalb eines 4 ml 100 kDa Molekulargewichts-Cutoff-Filters (MWCO), um große MW-Spezies zu entfernen.

Nach 1 Stunde Zentrifugation bei 22 Grad und 5000 g betrug das Retentatvolumen 200 μl und das Filtratvolumen 3,8 ml. 3,8 ml des Filtrats wurden in einen 3-kDa-MWCO-Filter überführt, um kleinmolekulare Verunreinigungen und Peptide mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen.

Der 3 kDa MWCOfilter wurde 1 Stunde lang bei 22 Grad und 7300 g zentrifugiert, was ein Retentatvolumen von 200 μl ergab. 200 μl Retentat aus dem 100-kDa-MWCO-Filter wurden noch einmal gewaschen, indem es mit WB auf 4 ml verdünnt und erneut durch denselben Filter filtriert wurde.

Dieser Durchfluss wurde dem gleichen 3-kDa-MWCO-Filter wie oben erwähnt zugesetzt und noch einmal konzentriert.

Die letzten 200 μL Retentat aus der 3-kDa-MWCO-Filterwäsche wurden in ein 1,5-ml-LoBindEppendorf-Röhrchen überführt. Um die Probe anzusäuern, wurden 10 μl 10 %ige Ameisensäure (FA) zugegeben, was zu einer FA-Konzentration von 0,5 % in der Endprobe führte.

Die Probe wurde 15 Minuten lang bei 18,000g zentrifugiert, um das ausgefällte Material zu entfernen, bevor die Proteinkonzentration mithilfe des Bicinchoninsäure-Assays (BCA) gemessen wurde.

Rinderserumalbumin-Standards wurden in 8 M Harnstoff, 1 0 mM ABC und 0,5 % FA hergestellt, um mögliche Pufferbeiträge zum BCA-Assay zu berücksichtigen. Die Proteinkonzentration durch den BCA-Assay wurde mit 1,1 mg/ml bestimmt, was einer Endausbeute von 0,22 mg des insgesamt gewonnenen Proteins in der ∼200 μl Probe entspricht. Die Probe war mit WB mit 0,5 % FA auf 0,5 mg/ml verdünnt und bis zur LC-MS-Analyse bei –80 Grad gelagert.

Wir sollten beachten, dass erste Experimente (Daten unveröffentlicht) mit einem traditionellen Protease/Phosphatase-Inhibitor-Cocktail in unserem Homogenisierungspuffer zu irreführenden BCA-Assay- und LC-MS-Ergebnissen führten, da mehrere Cocktailkomponenten durch den 3KMWCO-Filter zurückgehalten wurden.

Darüber hinaus sind viele der üblicherweise verwendeten Phosphatase- und Proteaseinhibitoren chemisch inkompatibel mit Reduktionsmitteln wie TCEP. In Anbetracht dieser Inkompatibilitäten und der Tatsache, dass die stark denaturierenden Bedingungen von 8 M Harnstoff mit 10 mM TCEP voraussichtlich die meisten Proteasen inaktivieren würden, gingen wir davon aus, dass der proteolytische Abbau unter diesen Bedingungen immer noch minimiert werden würde.

LC-MS/MS-Analysen und FAIMS-Einstellungen

Die Proben wurden mit einem Waters NanoACQUITY UPLC-System mit mobilen Phasen analysiert, die aus {{0}},2 % FA in H2O (mobile Phase A) und 0,2 % FA in ACN (mobile Phase B) bestanden.

Sowohl die Einfang-Vorsäule (100 μm Innendurchmesser, 5 cm Länge) als auch die Analysesäule (75 μm Innendurchmesser, 50 cm Länge) waren Aufschlämmungen, die mit dem C2-Packungsmaterial (5 bzw. 3 μm für Falle/Analyse, 300 Å, Separation Methods Technology) gepackt waren. . Die Proben wurden in eine 5-μL-Schleife geladen, was 2,5 μg der geladenen Materialmenge entspricht, und mit einem isokratischen Fluss von 5 % b bei 3 μL/min über 20 Minuten in die Auffangsäule injiziert.

Die Trennung wurde mit einem 5–50 % b-Gradienten über 180 min bei 300 nL/min durchgeführt. Für die MS/MS-Analyse von Proteinen wurde das NanoACQUITY-System an ein Thermo Scientific Orbitrap Fusion LumosTribrid-Massenspektrometer gekoppelt, das mit der FAIMS Pro-Schnittstelle ausgestattet ist.

Zu den Quellenparametern gehörten eine Elektrospray-Spannung von 2,2 kV, eine Transferkapillartemperatur von 275 Grad und eine Ionentrichter-Hochfrequenzamplitude von 60 %. FAIMS wurde auf Standardauflösung ohne zusätzlichen benutzergesteuerten Trägergasfluss und eine Dispersionsspannung von –5 kV (entspricht einem Dispersionsfeld von –33,3 kV/cm)50 eingestellt, während der CV je nach Experiment variierte (als „externes Stepping“ bezeichnet). ").

Der Fusion Lumos wurde auf den Anwendungsmodus „intactprotein“ eingestellt, der den N2-Druck der Zelle mit höherer Energie-C-Trap-Dissoziation (HCD) auf 2 mTorr senkt, und die Daten wurden als vollständiges Profil erfasst. MS1- und MS2-Daten wurden mit einer Auflösung von 120k und 60k, Mikroscans von 3 und 2, über einen Bereich von 500–2,000 m/z und 400–2,000 m/z und mit erfasst AGC-Ziele von 5 × 106 bzw. 5 × 105.

MS1 und MS2 wurden ebenfalls mit einer maximalen Injektionszeit von 400 ms erfasst. Zu den datenabhängigen Einstellungen gehörten eine Auswahl der sechs intensivsten Ionen, der Ausschluss von Ionen, die niedriger als der Ladungszustand 5+ sind, die Einbeziehung unbestimmter Ladungszustände und der dynamische Ausschluss nach einer Beobachtung für 30 s.

Für MS2 ausgewählte Ionen wurden über ein Fenster von ±1,5 m/z isoliert und durch kollisionsinduzierte Dissoziation (CID) mit einer Kollisionsenergie von 35 % fragmentiert. Aufgrund der geringeren Abhängigkeit der normalisierten Kollisionsenergie zur Erzielung interpretierbarer Proteinfragmentierungsspektren haben wir CID anstelle von HCD verwendet und dabei der Breite unserer Proteoformbeobachtungen Vorrang vor der Sequenzabdeckung eingeräumt.52

Datensätze für jeden FAIMS-Lebenslauf wurden in dreifacher Ausfertigung erfasst. Alle Rohdateien wurden im MassIVE-Datenrepository abgelegt und können über den Zugang MSV000086696 oder mit PXD023607 auf ProteomeXchange abgerufen werden.

For more information:1950477648nn@gmail.com