Bewertung der Antioxidantien, Whitening- und Anti-Aging-Eigenschaften von Reisproteinhydrolysaten

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Hui-Ju Chen 1,2, Fan-Jhen Dai 2, Cheng-You Chen 3, Siao-Ling Fan 2, Ji-Hong Zheng 4, Yu-Chun Huang 2, Chi-Fai Chau 1, Yung-Sheng Lin 3, 4,5,* und Chin-Shuh Chen 1,*

Abstrakt:Aus Pflanzen gewonnene Proteinhydrolysate haben potenzielle Anwendungen in der Ernährung. Reisproteinhydrolysate (RPHs), eine ausgezeichnete Proteinquelle, haben für die Entwicklung von Cosmeceuticals Aufmerksamkeit erregt. Allerdings haben nur wenige Studien über die potenzielle Anwendung von RPH in der Analyse berichtet, und diese Studie untersuchte sieAntioxidansAktivitäten und die inhibitorischen Aktivitäten von Skinaging-Enzymen. Die Ergebnisse zeigten, dass die gesamten Phenol- und Flavonoidkonzentrationen 2,06 ± 0,13 mg Gallussäureäquivalent/g RPHs und 25,96 ± 0,52 µg Quercetinäquivalent/g RPHs betrugen, beziehungsweise. RPHs zeigten eine dosisabhängige Aktivität zum Abfangen freier Radikale von 1, 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl [halbmaximale Hemmkonzentration (IC50)=42,58 ± 2,1 mg/g RPHs] und 2 ,20-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (IC50=2.11 ± 0,88 mg/g RPHs), dosisabhängige Reduktionskapazität (6,95 ± 1,40 mg Vitamin C-Äquivalent/g RPHs) und Sauerstoffradikalabsorptionskapazität (473 µmol Trolox-Äquivalent/g RPHs). Die Konzentrationen der RPH-Lösung, die erforderlich sind, um eine 50-prozentige Hemmung der Hyaluronidase zu erreichen, undTyrosinaseAktivitäten wurden mit 8,91 bzw. 107,6 mg/ml bestimmt. Diese Studie hat gezeigt, dass RPHs habenAntioxidans, Antihyaluronidase- und Antityrosinase-Aktivitäten für zukünftige kosmetische Anwendungen.

Schlüsselwörter:Reisproteinhydrolysat;Antioxidans; Hyaluronidase;Tyrosinase; Kosmetik

ZistancheAufhellungWirkungauf der Haut zuAntioxidation

1. Einleitung

Die Exposition gegenüber ultravioletter Strahlung ist für die Photoalterung (oder extrinsische Alterung) verantwortlich; reaktive Sauerstoffspezies, die im Zellstoffwechsel entstehen, und die Verschlechterung biologischer Funktionen sind dagegen für die intrinsische Alterung verantwortlich [1,2]. Verarbeitete Lebensmittel enthalten oft natürlicheAntioxidantienwie Catechine, Ascorbinsäure, Tocopherole, Rosmarinsäure und phenolische Extrakte aus verschiedenen Pflanzen. Die Forschung zu natürlichen Antioxidantien berücksichtigt jetzt nicht-traditionelle Provenienzen. Natürlich bezogenAntioxidantiensind wünschenswerter als chemisch hergestelltAntioxidantienda von einigen synthetischen Antioxidantien berichtet wurde, dass sie krebserregend sind [3]. Reis (Oryza sativa) ist ein wichtiges Grundnahrungsmittel für Menschen auf der ganzen Welt, insbesondere für diejenigen, die in Asien leben. Die jährliche Reisproduktion der Welt beträgt etwa 741 Millionen Tonnen [4]. In asiatischen Ländern ist Reis Berichten zufolge die Quelle von 75 Prozent der Energieaufnahme von über 2 Milliarden Menschen [5]. Die umfangreiche Reisproduktion führt zu einer entsprechenden Menge an Nebenprodukten. Das Restprodukt aus dem Reisproduktionsprozess enthält den größten Teil des Proteins des Getreides (~60–85 Prozent), wird aber weggeworfen oder für die Tierfütterung verwendet [6–8]. Peptide, die aus verschiedenen Proteinhydrolysaten gewonnen werden, fungieren Berichten zufolge als potentiellAntioxidantien[9]. Natürliche und ungiftige Antioxidantien können daher potenziell aus Nahrungsproteinhydrolysaten extrahiert werden. Zahlreiche Wissenschaftler haben lipidreiche Modelle verwendet und berichteten, dass Proteinhydrolysate sowie Milch-, Zein- und Sojaproteinpeptide entscheidende antioxidative Eigenschaften aufweisen, darunter das Abfangen freier Radikale, die Hemmung der Nahrungs- und In-vitro-Lipidperoxidation sowie die Chelatbildung von Übergangsmetallen [10– 12].

Hyaluronsäure (HA) trägt zur Verjüngung der Haut bei, da sie die Viskosität erhöht, Feuchtigkeit enthält und extrazelluläre Flüssigkeiten weniger durchlässig macht. Aufgrund seiner hervorragenden Wasserhaltekapazität erhöht HA die Jugendlichkeit, Feuchtigkeit und Geschmeidigkeit der Haut und reduziert das Ausmaß von Falten [13,14]. Leider nimmt der Gehalt an HA in der Haut mit zunehmendem Alter auf natürliche Weise ab. Hyaluronidase ist ein Enzym, das HA zerstört, was zu einem Verlust an Festigkeit, Flexibilität und Feuchtigkeit der Haut führt, was wiederum zu Hautalterung führt. Daher können Falten behandelt werden, indem Hyaluronidase gehemmt und der HA-Gehalt der Haut aufrechterhalten wird [15,16]. Das melaninproduzierende EnzymTyrosinaseträgt wesentlich zum geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt des Prozesses bei, durch den Melanin produziert wird. Daher werden häufig Pigmentstörungen behandelt und eine Hautaufhellung durch Hemmung oder Herunterregulierung erreichtTyrosinaseAktivität [17,18].

In mehreren Studien wurde festgestellt, dass Getreideproteinhydrolysate und die daraus erhältlichen Peptide antioxidative, blutdrucksenkende und antitumorale Wirkungen haben [19,20]. Die positiven Beiträge von aus Lebensmitteln stammenden Peptiden und Proteinen zur menschlichen Gesundheit werden allmählich erkannt [21]. Verbraucher fordern zunehmend, dass die Kosmetik- und Gesundheitsindustrie natürliche bioaktive Verbindungen verwendet. Reisproteinhydrolysate (RPHs) haben als ausgezeichnete Proteinquelle Aufmerksamkeit erregt. Allerdings haben nur wenige Studien über die Charakterisierung und Funktionsanalyse von RPHs berichtet. Daher bewertete diese Studie die antioxidative Aktivität und Hyaluronidase undTyrosinase-inhibitorische Aktivitäten von RPHs.

2. Ergebnisse und Diskussion

2.1. Gesamtphenolkonzentration (TPC) und Gesamtflavonoidgehalt (TFC)

Der Standard im TPC-Assay war Gallussäure in mehreren Konzentrationen. Eine höhere Extinktion zeigte eine höhere TPC an. Die TPC der RPH-Proben wurde durch Eingeben der optischen Extinktionswerte der RPH-Proben in die Gallussäure-Eichkurve erhalten. Durch Auftragen der RPH-Konzentration gegen die Phenolkonzentration (Abbildung 1a) wurde eine durchschnittliche TPC von 2,06 ± 0,13 mg GAE/g RPHs erhalten. Ein TFC von 25,96 ± 0,52 µg QE/gRPHs wurde nach einem ähnlichen Verfahren erhalten (Abbildung 1b). Fig. 1c betrifft ferner die TPC und TFC der RPHs-Proben. Es zeigt, dass die Beziehung zwischen TPC und TFC als y=0,0121x plus 0,0659 ausgedrückt werden kann, wobei x und y TPC bzw. TFC sind.

Die TPC von RPHs umfasste die Konzentrationen von phenolischen Aminosäuren und phenolischen Verbindungen der Peptide. Die Wechselwirkung zwischen Protein und phenolischer Verbindung umfasst im Allgemeinen kovalente und nichtkovalente Bindungen. Bei der enzymatischen Hydrolyse werden phenolische Verbindungen freigesetzt. Bestimmte Enzyme sind möglicherweise am besten in der Lage, Protein-Polyphenol-Komplexe zu zerstören; dies führt dazu, dass eine größere Anzahl von phenolischen Verbindungen und Peptiden mit phenolischen Gruppen, wie Tyrosin, freigesetzt werden [22]. Es wurde eine starke Korrelation zwischen dem Gesamtpolyphenolgehalt von Körnern und ihrer biologischen Aktivität berichtet. Polyphenole sind bekannt dafür, starke antioxidative Aktivitäten zu haben [23]. Obwohl in geringerer Menge vorhanden, könnten Terpene [24] oder Sesquiterpene [25] in Reis auch zu antioxidativen Aktivitäten beitragen.

2.2. Aktivität von Antioxidantien

2.2.1. Radikalfängeraktivität von DPPH-freien Radikalen

Fig. 2 zeigt die Radikalfängeraktivität von DPPH in der RPH-Lösung. Es wurde festgestellt, dass eine höhere Konzentration der Lösung zu einer höheren Aktivität führt. Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50), das ist die Extraktkonzentration, bei der die Hälfte aller freien DPPH-Radikale abgefangen werden kann, betrug 42,58 ± 2,1 mg/ml Reispeptide.

2.2.2. Abfangaktivität von ABTS-freien Radikalen

Die ABTS-Aktivität zum Abfangen freier Radikale von RPHs, dargestellt in 3 , war höher, wenn eine größere Extraktkonzentration verwendet wurde. Der IC50 betrug 2,11 ± 0,88 mg/ml Reispeptide. Dieses Ergebnis zeigte, dass RPHs eine starke Aktivität zum Abfangen freier Radikale von ABTS aufwiesen. Die schwefelhaltigen Aminosäuren, einschließlich Met und Cys, und hydrophobe Aminosäuren, einschließlich Ala, Val, Ile, Leu, Met, Cys, Tyr, Phe, Try und Pro, könnten wichtige Faktoren im Hinblick auf das freie ABTS-Radikal sein Aufräumtätigkeit.

In dieser Studie war der IC50-Wert der ABTS-Aktivität zum Abfangen freier Radikale niedriger als die der DPPH-Aktivität zum Abfangen freier Radikale, was mit den Ergebnissen von Jatropha curcas L. Samenschale und -kern [28] und Jujubefruchtsamen und Fruchtfleisch [29] übereinstimmt. Dieser Befund entspricht auch dem Bericht über Reiskleie-Proteinhydrolysate mit 43,98–66,25 µmol Trolox-Äquivalent/g Probe und 403,28–430,12 µmol Trolox-Äquivalent/g Probe für die DPPH-Radikalfängeraktivität bzw. die ABTS-Radikalfängeraktivität [27].

Ein möglicher Grund ist der Unterschied in der Löslichkeit zwischen dem freien Radikal DPPH (öllöslich) und dem freien Radikal ABTS (öllöslich/wasserlöslich) [30,31]. Das antioxidative Potenzial von Reiskleieproteinhydrolysaten wurde durch sein Molekulargewichtsprofil, seine Aminosäurezusammensetzung und seine Hydrophobie beeinflusst [32].

2.2.3. Reduktionskapazität

Die Ergebnisse des Reduktionskapazitätstests für RPHs sind in Abbildung 4 dargestellt. Die Reduktionskapazität nahm mit der RPHs-Konzentration zu. Die Reduktionskapazität betrug 6,95 ± 1,40 mg VCE/g RPHs, was anzeigt, dass RPHs ein wirksames Antioxidans sind.

2.2.4. Absorptionskapazität für Sauerstoffradikale (ORAC)

Der ORAC-Assay hat Vorteile gegenüber anderen Ansätzen zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität, einschließlich der verwendeten Reaktanten, die Peroxyradikale mit einem ähnlichen Reaktionsmechanismus und Redoxpotential wie physiologische Oxidantien sind; die Gesamtladung und der Protonierungszustand, mit denen dieAntioxidantienreagieren ähneln denen im menschlichen Körper [33]. Die ORAC-Methode hat auch biologische Relevanz für die Wirksamkeit von Antioxidantien im menschlichen Körper. Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse der ORAC-Analyse von RPHs und dem Trolox-Standard in verschiedenen Konzentrationen. Der ORAC wurde aus der Regressionsgleichung der Kalibrierungskurve abgeleitet, die die Netto-AUC mit der Trolox-Konzentration in Beziehung setzt. Die Ergebnisse zeigten, dass RPH einen ORAC von 473 &mgr;mol TE/g RPHs hatte.

Antioxidative Peptide oder Aminosäuren können durch enzymatische Proteinhydrolyse erhalten werden, was zu einer hohen Aktivität gegen Oxidationsmittel führt [34]. Die Metallionen-Chelatbildung, die Hemmung der Lipidperoxidation und das Abfangen freier Radikale biologisch aktiver Peptide sind für ihre antioxidative Aktivität verantwortlich. Freie Radikale können gelöscht und die Expression von oxidativen Stress reduzierenden Proteinen und Enzymen durch antioxidative Peptide hochreguliert werden. Die antioxidative Wirksamkeit von Proteinhydrolysaten und Peptiden hängt Berichten zufolge von der Sequenz der Aminosäuren und der Größe des Peptids ab, die von den Hydrolysebedingungen, der Proteinquelle und der Art der Protease beeinflusst werden [35]. Nach Adebiyi et al. [36] kann das größte verdauliche Reiskleieprotein durch Subtilisin in kleinere Stücke gebrochen werden, was zu einer höheren Proteinausbeute und einem höheren Proteingehalt führt. Die TPC- und antioxidative Aktivität eines Hydrolysats kann durch die Spezifität von Enzymen beeinflusst werden. Daher könnte die antioxidative Aktivität eines Peptids durch die Eigenschaften der Proteinquelle, die Spezifität des Enzyms und den Hydrolysegrad beeinflusst werden [37].

Es gibt viele Berichte über die Verwendung von Proteasen (wie Alcalase, ein Handelsname von Assubtilisin A aus Bacillus-Spezies), um aus Pflanzen stammende Proteine ​​zu hydrolysieren, um Antioxidanspeptide zu erhalten. In dieser Hinsicht ist Sojaprotein eines der am häufigsten berichteten Proteine ​​[38]. Darüber hinaus wird auch eine Alcalase-Hydrolyse von Reiskleieprotein gefunden. Unter optimalen Bedingungen erzeugte die Alcalasehydrolyse von klebriger Reiskleie Proteinhydrolysate mit einem IC50-Wert von 0,87 ± 0,02 mg/ml beim Abfangen freier Radikale durch DPPH [39]. In unserer Studie betrug der IC50-Wert von RPHs 42,58 ± 2,1 mg/ml. Obwohl der IC50-Wert beim DPPH-Radikalfänger in dieser Studie nicht so effektiv war wie der von Reiskleieprotein, war der ABTS-Radikalfänger (IC50=2,11 mg/ml) wirksamer als Sojaproteinhydrolysate, die durch Alcalasehydrolyse erhalten wurden ( IC50=2,93 mg/ml) [40].

2.3. Hyaluronidase-Inhibitoraktivität

Ein proteolytisches Enzym, Hyaluronidase, wird in der Dermis gefunden und katalysiert den Abbau von HA in der extrazellulären Matrix [41]. Diese Studie verwendete Gerbsäure als positive Kontrolle zu Vergleichszwecken. Fig. 6 zeigt, dass Gerbsäure eine höhere Hemmung der Hyaluronidase-Aktivität aufwies; der IC50 betrug 0,14 mg/ml, ähnlich dem von Nishida et al. (0,121 mg/ml; 71,1 mM) [42]. Dagegen wurde für die RPH-Lösung eine IC50 von 8,91 mg/mL berechnet. Dieses Ergebnis der RPH-Lösung entsprach unserem bisherigen IC50-Wert von 7,61 mg/mL [43]. Proteine, Polysaccharide sowie pflanzliche und synthetische Verbindungen gehören zum Bereich der Verbindungen, in denen Hyaluronidase-Inhibitoren vorhanden sind. Diese Inhibitoren helfen, das HA-Synthese-Abbau-Gleichgewicht aufrechtzuerhalten [44]. Eine niedrige HA-Konzentration in der Haut führt zu Trockenheit und Falten. Daher ist die Hemmung der Hyaluronidase-Aktivität ein Weg, durch den die Morphologie der Haut verbessert und ihre Alterung verzögert werden kann.

2.4. Tyrosinase-inhibitorische Aktivität

Proteinhydrolysate aus natürlichen Quellen haben ein HemmpotentialTyrosinase-Aktivität. Der In-vitro-Tyrosinase-Hemmtest wird normalerweise verwendet, um zu bewerten, wie Hautaufheller die Tyrosinase-Aktivität direkt beeinflussen [45]. Durch Teilnahme an dem geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Melaninsynthese katalysiert Tyrosinase die Hydroxylierung von L-Tyrosin zu L-DOPA und dann die Oxidation des letzteren zu o-Dopachinon. Wenn es wünschenswert ist, die Biosynthese von Melanin zu verhindern, kann die Hemmung der L-Tyrosinase-Aktivität entscheidend sein. Hier,Tyrosinasewurde verwendet, um die RPH-Antityrosinase-Aktivität zu messen. Wie in Abbildung 7 dargestellt, erreichte die Konzentration107,6 mg/ml eine 50-prozentige Hemmung der Tyrosinase-Aktivität. Ascorbinsäure zeigte eine hohe Tyrosinase-hemmende Aktivität (IC50=0,098 mg/ml), die ähnlich war wie die 0,102 mg/ml, die Seo et al. berichtet [46].

Reiskleie-Proteinhydrolysate wiesen einen signifikant hohen Wert aufTyrosinase-inhibitorische Aktivität [47,48]. Die tyrosinasehemmende Aktivität der RPH-Lösung kann aus den Aminosäureprofilen von Peptiden resultieren. Schurinket al. beschrieben, dass effektivTyrosinase-inhibitorische Peptide bestehen aus Argininresten und Phenylalanin [49]. Die Tyrosinase-hemmende Aktivität kann durch hydrophobe Aminosäurereste (z. B. Alanin) verbessert und die Produktion von Melanin durch Alanin gestört werden [50]. Außerdem haben Zhang et al. berichteten auch, dass Reisproteinhydrolysat den Melaningehalt und die Tyrosinaseaktivität im UVB-induzierten Zellmodell reduzieren könnte [51].

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2.5. Aminosäureprofile und MWs von RPHs

Der Proteingehalt des Reises nach der Stärkeentfernung betrug in der vorliegenden Studie 23,56 Gew.-%, und der Hydrolysegrad der durch Protease hydrolysierten Probe betrug 9,36 %. Tabelle 1 zeigt die Zusammensetzung der Aminosäuren in den RPHs. In der Probe enthielten jeweils 100 g 5,18 g Aminosäuren. Hinsichtlich der Aminosäurekomponenten waren RPHs reich an Alanin, Leucin, Arginin, Glutaminsäure und Asparaginsäure. Jeweils 100 g der Probe enthielten insgesamt 1,73 g hydrophobe Aminosäuren (Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin und Cystein). Dieses Ergebnis war völlig verschieden von unserem vorherigen Bericht [43] in der Amylaselösung und ihrer Behandlungstemperatur zur Entfernung von Stärke. Der Gehalt an hydrophoben Aminosäuren war 1,90-mal höher als in unserem vorherigen Bericht. Die niedrigere Behandlungstemperatur (60 °C) in dieser Studie kann die Denaturierung von Proteinen in großen Mengen verhindern, so dass die Aktivität von Aminosäuren besser erhalten bleibt. Darüber hinaus wird eine ähnliche Schlussfolgerung auch aus anderen Pilz-Amylase und Glucoamylase zur Verzuckerung von Stärke in weißer Reiskleie gezogen [52].

Die Forschung hat festgestellt, dass hydrophobe Aminosäuren ähnelnAntioxidantienB. durch Erhöhung der lipidbasierten Löslichkeit in Proteinhydrolysaten und Peptiden aus verschiedenen Proteinquellen, wodurch die Wechselwirkung mit freien Radikalen gefördert wird [38,53]. Einige Aminosäuren wurden von Chen et al. [54] allgemein seinAntioxidantien; die erwähnten Säuren umfassten Tryptophan, Cystein, Methionin, Tyrosin und Histidin. In der vorliegenden Studie umfassten aromatische Aminosäuren (Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan) 0,53 g/100 g RPHs. Daher waren diese von Peptiden stammenden Aminosäuren wahrscheinlich für die antioxidative Aktivität von RPHs verantwortlich.

Außerdem haben Proteine, die zu kürzeren Peptiden hydrolysiert werden, eine andere MW-Verteilung, und einige hydrophobe Gruppen, die in das Innere der vollständigen natürlichen Proteinmoleküle gefaltet sind, sind normalerweise der wässrigen Phase ausgesetzt. Dies hängt mit der strukturellen Umordnung der Proteinmoleküle und damit mit den funktionellen Eigenschaften des Proteins zusammen [55,56]. Die Tricine-SDS-PAGE-Daten zeigten, dass das MW von RPHs im Bereich von 5–35 kDa lag (Abbildung 8a).

Abbildung 8b zeigt den relativen Gehalt verschiedener MWs in RPHs. Insgesamt befanden sich 45,24 Prozent des gesamten Proteins in der Hauptbande (MW ≈ 2,4 kDa). Ähnliche Ergebnisse wurden bezüglich des Peptids der Reiskleieproteinhydrolysate erhalten. Die höchste von Thamnarathip et al. [37] war das für Peptide mit MW=6–50 kDa. Darüber hinaus bestehen Beziehungen zwischen der Funktion von Proteinhydrolysaten und der MW-Verteilung und der Zusammensetzung von Aminosäuren [57]. Dies erklärt die in der vorliegenden Studie beobachtete antioxidative Aktivität von RPHs.

2.6. Zelltoxizitätstest

Für zukünftige Anwendungen ist eine geringe Zelltoxizität erforderlich. Um die Zytotoxizität und Biokompatibilität von RPHs zu bewerten, wurde die Zelllebensfähigkeit von rohen 264.7-Zellen in RPH-Lösung mittels MTT-Verfahren gemessen. Wie in Abbildung 9 gezeigt, lag die Zelllebensfähigkeit bei Behandlung mit 25–2000 µg/ml RPH für 24 h und 48 h über 100 %. Die Ergebnisse weisen auf die bemerkenswert niedrige Zytotoxizität von RPHs hin. Daher können RPHs potenziell als kosmetische Anwendungen mit sehr geringer Zytotoxizität verwendet werden.

3. Materialien und Methoden

3.1. Reagenzien

Eisen(III)chlorid, 2,20-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS), Trolox(6-hydroxy-2,5 ,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure), l-3,4-dihydroxyphenylalanin(L-DOPA), 1,1-diphenyl-2- Picrylhydrazyl (DPPH) und Trichloressigsäure wurden von Alfa Aesar (Tewksbury, MA, USA) bezogen. 2,20-Azobis(2-methylpropionamidin)dihydrochlorid (AAPH), Folin-Ciocalteus Phenolreagenz, Gallussäure, Ascorbinsäure, PilzTyrosinaseund Fluorescein-Natrium wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Natriumcarbonat wurde von Riedel-de Haën (Seelze, Deutschland) bezogen. Schließlich wurden Kaliumferricyanid, Natriumhydrogenphosphat und Natriumdihydrogenphosphat von Showa Chemical (Tokio, Japan) bezogen.

3.2. Vorbereitung von RPHs

RPHs wurden wie zuvor beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass Pilzamylase verwendet wurde, um die Stärke in Reismehl zu verzuckern, wodurch eine Beschädigung von Aminosäuren durch Bakterienlamylase-Hydrolyse bei hohen Temperaturen vermieden wurde [43,58]. 100 g Reismehl wurden in 1000 ml destilliertem Wasser eingeweicht, das 0,5 % Pilzamylase (Genencor, NY, USA) enthielt; die Mischung wurde anschließend 24 h auf 60 ◦C erhitzt ( pH 4,2), wonach man auf Raumtemperatur abkühlen ließ. Zentrifugation wurde für 10 min bei 1968 × g durchgeführt, um den verbleibenden Überstand zu entfernen. Nachdem dem unlöslichen Anteil 20--faches Wasser und 2 ml 0,1-prozentige hydrolytische Protease (Healthmate, Changhua, Taiwan) zugesetzt worden waren, wurde die Lösung geschüttelt und 4 h bei 55 °C inkubiert. Das pH-Stat-Verfahren wurde eingesetzt, um den pH-Wert der Lösung auf dem optimalen Niveau zu halten, und dann wurde 10 Minuten lang auf 85 °C erhitzt, um das Enzym zu inaktivieren. Die verbleibende unlösliche Fraktion wurde durch 15-minütige Zentrifugation bei 3075 × g entfernt. Der Überstand wurde lyophilisiert und vor der Verwendung bei –20 °C gelagert.

3.3. Antioxidative Aktivitäten von RPHs

3.3.1. Gesamtphenolkonzentration (TPC)

Die Folin-Ciocalteu-Methode zur Entdeckung der TPC von RPHs wurde angewendet [59]. Zuerst wurden 200 µl Folin-Ciocalteus Phenolreagenz (0,3 M) gleichmäßig durch 5--minütiges Schütteln mit 200 gemischt &mgr;l RPH-Lösung, und zu dieser Mischung wurden 400 &mgr;l entionisiertes (DI) Wasser und 200 &mgr;l 10-prozentige (w/v) Natriumcarbonatlösung gegeben. Die gemischte Lösung wurde 60 min lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde 15 min bei 3000 U/min zentrifugiert. Die Messung verwendete 100 &mgr;l Überstand. Um die TPC (Einheit: mg) des Gallussäureäquivalents (GAE) pro Gramm trockener RPH-Probe (Einheit: mg GAE/g RPHs) zu bestimmen, wurden die optischen Extinktionsdaten in eine Standardkurve eingegeben, die Gallussäure darstellt. Die Extinktion wurde bei 700 nm unter Verwendung eines EpochMicroplate Spectrophotometer (BioTek, VT, USA) erhalten.

3.3.2. Gesamtflavonoidgehalt (TFC)

TFC wurde nach dem Ansatz von Wathoni et al. mit geringfügigen Modifikationen [60]. Zuerst wurden jeweils 500 &mgr;l der Probe und 2-prozentige (w/v) Aluminiumchloridlösung gemischt. Die Reaktionslösung wurde gründlich gemischt und 10 min stehengelassen, und die Extinktion bei 415 nm wurde bewertet. Das Ergebnis wird in Mikrogramm Quercetin-Äquivalent (QE) pro Gramm der trockenen RPH-Probe (µg QE/g RPHs) angegeben.

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3.3.3. DPPH-Aktivität zum Abfangen freier Radikale

Zunächst wurden 198 µM DPPH-Ethanollösung (50 µL) und die RPH-Lösung oder DI-Wasser (0,5 µL; Probe bzw. Kontrolle) gemischt und dann 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wurde die Extinktion der Lösung bei 517 nm erhalten. Die relative Abfangaktivität wurde durch Bestimmung der Extinktionsdifferenz zwischen der Probe und der Kontrolle berechnet. Eine hohe DPPH-Aktivität zum Abfangen freier Radikale spiegelte sich in einer niedrigen optischen Extinktion wider. Bei der Bewertung der DPPH-Radikalfängeraktivität der RPH-Lösung war der verwendete Standard Vitamin C [61–63].

3.3.4. Abfangaktivität von ABTS-freien Radikalen

Der von Wu et al. wurde verwendet, um die antioxidative Aktivität der RPH-Lösung zu bewerten [64]. Zunächst wurde 7 mM ABTS-Stammlösung (25 0 µl) mit 2,45 mM Kaliumpersulfat (25 0 µl) umgesetzt, um das freie ABTS-Radikalkation (ABTS• plus ) zu ergeben, wobei die Mischung aufbewahrt wurde für 16 h bei 4 ◦C im Dunkeln bevor es eingesetzt wurde. Nach Äquilibrierung im Dunkeln bei Raumtemperatur wurde 0,1 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; pH 7,4) verwendet, um die Lösung auf eine Extinktion von 0,70 ± 0,02 bei 734 nm zu verdünnen. Dann wurden zu 180 &mgr;l verdünnter ABTS-Lösung 20 &mgr;l Trolox (positive Kontrolle) oder die RPH-Lösung (Probe) hinzugefügt. Das Gemisch wurde dann einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur unterzogen. Diese Studie bestimmte die optische Extinktion bei 734 nm; eine niedrigere Extinktion entsprach einer höheren ABTS-Aktivität zum Abfangen freier Radikale. Der für die Bewertung der ABTS-Radikalfängeraktivität von RPHsolution verwendete Standard war das Antioxidans Trolox.

3.3.5. Reduktionskapazität

Zur Bestimmung der antioxidativen Gesamtaktivität der RPH-Lösung wurde der Eisen(III)-reduzierende Antioxidans-Power-Assay eingesetzt. Wie von Lin et al. [29] wurde die RPH-Lösung (200 µL) gleichmäßig mit 1 Prozent (w/v) K3Fe(CN)6 und 0,2 M PBS-Puffer (pH 6,6; jeweils 100 µL) gemischt .Für 20 min wurde ein 50 ◦C Wasserbad verwendet, um die Mischung zu erhitzen; nach dem Entfernen der Mischung aus dem Bad wurde sie schnell für 3 min gekühlt. Anschließend erfolgte eine Zugabe von 10-prozentiger (w/v) Trichloressigsäure (100 µL) und eine 10--minütige Zentrifugation bei 3000 U/min. Anschließend wurde der Überstand (400 µL) extrahiert und gleichmäßig mit O vermischt. 1 Prozent (w/v) FeCl3 (100 µL) und DI-Wasser (400 µL). Fe4[Fe(CN)6]3 wurde durch 10--minütige Reaktion dieser Mischung im Dunkeln erhalten. Anschließend zeigte eine höhere optische Extinktion (gemessen bei 700 nm) eine höhere Reduktionskapazität an. Das Standard-Vitamin C wurde verwendet, um den Gehalt an Vitamin C-Äquivalent (VCE) pro Gramm RPHs zu bestimmen.

3.3.6. Absorptionskapazität für Sauerstoffradikale (ORAC)

Diese Studie erhielt den ORAC durch Modifikation einer zuvor beschriebenen Methode [65]. Nach dem Auflösen der RPH-Probe in destilliertem Wasser wurde die RPH-Lösung (50 &mgr;l) mit Fluorescein (10 &mgr;M) in einer Mikrotiterplatte mit 96- Vertiefungen gemischt. Die Lösung wurde einer 15--minütigen Inkubation bei 37 °C unterzogen, gefolgt von der Zugabe von 50 &mgr;l AAPH (500 mM). Alle 5 min und über insgesamt 120 min wurde die Fluoreszenz aufgezeichnet (λex und λem=485 bzw. 528 nm). Die antioxidative Kapazität von RPHs wurde aus der Kinetik des Fluoreszenzabfalls durch Berechnung der Fläche unter der Kurve (AUC) ermittelt ). Bei der Berechnung des RPH ORAC war der Standard 15–250 µM Trolox. Der ORAC wird als Mikromol Trolox-Äquivalent (TE) pro Gramm trockener RPH-Probe (µmol TE/g RPHs) angegeben.

3.4. Hyaluronidase-Inhibitoraktivität

Der Hyaluronidase-Hemmungstest wurde unter Verwendung einer {{0}}-Well-Mikroplatte und einer zuvor beschriebenen Methode mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt [40]. N-Acetylglucosamin wurde durch Reaktion von Hyaluronidase mit dem HA-Substrat freigesetzt. In Anwesenheit irgendeines Inhibitors war die N-Acetylglucosamin-Freisetzung verringert, wobei diese Freisetzung durch Erhalten der 600--nm-Absorption nachgewiesen wurde. HA wurde mit saurer Albuminlösung ausgefällt, die aus 0,1 M Acetatpuffer (pH 3,9) und Rinderserumalbumin (1 mg/ml) bestand. Die Probenlösung und 5 mg/ml Hyaluronidase wurden einer 20--minütigen Inkubation bei 37 ◦C unterzogen. Anschließend wurde dem Inkubationsansatz HA (1{{20}}0 µL; 5,0 mg/mL in 0,1 M Acetatpuffer) zugesetzt. Eine weitere Inkubation bei 37 °C für 40 min wurde durchgeführt. 0,1 ml 0,4 M alkalische Boratlösung wurden zugegeben, um die enzymatische Reaktion zu stoppen.

3.5. Tyrosinase-inhibitorische Aktivität

Die vorliegende Studie bewertete die Antityrosinase-Aktivität von RPHs unter Verwendung eines zuvor berichteten Protokolls mit Modifikationen [66]. Eine Enzymlösung (135 U/ml) wurde durch Auflösen von Tyrosinase in 20 mM Phosphatpuffer (pH 6,8) hergestellt. Zusätzlich wurde DI-Wasser zur Herstellung einer 1,25 mM L-DOPA-Lösung verwendet. Dann wurden 40 &mgr;l verschiedener Konzentrationen von RPH-Probenlösungen mit 40 &mgr;l Tyrosinaselösung und 120 &mgr;l L-DOPA-Lösung gemischt. Für 30 min wurde diese Mischung bei 37 ◦C im Test der Hemmung von RPHs gehaltenTyrosinaseAktivität. Ein Spektrophotometer (FLUOstar Omega MicroplateReader, BMG Labtech GmbH, Deutschland) wurde verwendet, um die 475--nm-Absorption zu erhalten. Alle Messungen wurden dreimal durchgeführt. Die Absorption der entsprechenden Gruppe, wennTyrosinasenicht vorhanden war, wurde abgezogen. Die Enzymhemmungsrate wurde bestimmt als

3.6. Charakterisierung von RPHs

3.6.1. Aminosäureprofile

Diese Studie entdeckte die Aminosäurezusammensetzung von RPHs. Zuerst wurde für 24 h und bei 115 °C 4 M Methansulfonsäure verwendet, um die Proben in evakuierten verschlossenen Röhrchen zu hydrolysieren. Zwei Waters 510 Solvent Delivery Systems und ein Aminosäureanalysator (L 8900; Hitachi, Tokio, Japan) wurden zur Trennung derivatisierter Aminosäuren auf einer 25 m langen Spherisorb ODS2-Säule eingesetzt × 64,6 mm. Diese Studie verwendete die folgenden Lösungsmittel: (a) Natriumacetat (0,14 M) und Triethylamin (850 &mgr;l/l; pH 5,6) und (b) 60 % Acetonitril, für das der Gradient 2 min lang 0 % betrug; 0–42 Prozent für 15,5 Minuten (konvexe Kurve) und 100 Prozent für 4 Minuten. Für die Messung von Aminosäureprofilen bei 254 nm wurden Doppelproben entnommen [67,68].

3.6.2. Molekulargewicht (MW) von Protein

In Übereinstimmung mit der Methode von Schägger [69] und unter reduzierenden Bedingungen erhielt diese Studie die MW-Verteilung durch Tricin-Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) mit leichten Modifikationen. Ein Probenpuffer (30 g/l SDS, 0,375 MTris-HCl, 0,125 g/l Coomassie Brilliant Blue G-250 und 75 g/ L-Glycerin; pH 7) wurde verwendet, um die gefriergetrocknete Probe zu dispergieren, wobei dann vor dem Beladen zentrifugiert wurde. Insgesamt 20 µl 2-Mercaptoethanol wurden zu 1 ml der Tricin-SDS-PAGE-Probe gegeben. Die Probe wurde für 90 s auf 100 ◦C erhitzt. Eine Probenvertiefung wurde mit jeder Probe und ungefärbtem Protein Standard Broad Range (Bio-Rad Laboratories, Deutschland) unter Verwendung einer Mikrospritze geladen. Anschließend wurde eine Elektrophorese durchgeführt – zunächst bei konstanten 30 mV, bis die gesamte Probe im Sammelgel enthalten war, und danach bis zum Abschluss bei konstanten 100 mV. Anschließend wurde eine 0,02-prozentige Coomassie Brilliant Blue R-250-Lösung zur Gelfärbung aufgetragen. Eine absolute Hintergrundentfärbung der Gele wurde durchgeführt, indem die Gele über Nacht in 10 %iger Essigsäure geschüttelt wurden. Schließlich wurde das Gelbild analysiert, um die Proteinbanden in den Bahnen zu identifizieren; diese Analyse wurde in ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) durchgeführt. Standardmarker wurden verwendet, um eine Eichkurve zu erhalten, aus der das MW abgeschätzt wurde. Kurz gesagt bestand der erste Schritt darin, die Wanderungslänge (Rf) jeder Bande von der Oberseite des Trenngels zu bestimmen. Der zweite Schritt war die Berechnung der Eichkurve durch Verwendung von Rf und log (MW) für einen Standardmarker mit einem gegebenen MW. Die MW-Bestimmung wurde unter Verwendung des Rf von Proteinbanden in RPHs durchgeführt.

3.7. Zytotoxizitäts-Assay

Rohe 264,7-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt kultiviert, das 1 0 Prozent fötales Rinderserum (FBS), 4,5 g/l Glukose, 1 Prozent Antibiotikalösung (100 Einheiten/ ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin), 4 mM L-Glutamin und 1,5 g/L Natriumbicarbonat bei 37 °C und 5 Prozent CO2. Die Zelltoxizität von rohen 264.7-Zellen für RPHs wurde mit einem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Proliferationstestverfahren gemessen . Etwa 1 × 104 Zellen pro Vertiefung wurden in 96--Well-Platten ausplattiert. Nach 24 h wurden verschiedene RPH-Konzentrationen (0–2000 µg/ml) in die Zellen gegeben. Nach 24 und 48 h Inkubation wurden 100 &mgr;l MTT-Lösung (0,5 mg/ml) zugegeben. Bei der Untersuchung unter einem Mikroskop wurden blaue Formazankristalle beobachtet. DMEM wurde entfernt und 100 &mgr;l Dimethylsulfoxid (DMSO) wurden pro Vertiefung zugegeben. Die Extinktion wurde unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Lesegeräts gemessen. Die Zelllebensfähigkeit (Prozent) wurde dann berechnet als [A570 (behandelte Zellen) – A570 (Hintergrund)] / [A570 (unbehandelte Zellen) – A570 (Hintergrund)] × 100 Prozent [70].

3.8. Statistische Analyse

Der Bericht für jede Hydrolysatprobe war der Durchschnittswert aus drei unabhängigen wiederholten Experimenten und Bestimmungen. Die als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückten Ergebnisse wurden durch einfache ANOVA und Duncans Post-Hoc-Test unter Verwendung des StatisticalAnalysis System (Version 20.0; SPSS, Armonk, NY, USA) analysiert. Werte von p < 0,05="" wurden="" als="" statistisch="" signifikant="">

4. Schlussfolgerung

Diese Studie untersuchte die Funktionen von RPHs. Experimentelle Ergebnisse zeigten, dass RPHs phenolische Verbindungen und Flavonoide enthielten und eine Reihe antioxidativer Aktivitäten aufwiesen, wie z. B. DPPH- und ABTS-Abfangaktivitäten, Reduktionskapazität und ORAC. Außerdem werden RPHs wirksam gehemmtTyrosinaseund Hyaluronidase-Aktivitäten. Die Protease war ein kritischer Faktor, der die MW-Muster von RPHs beeinflusste. Die Analyse von RPHs weist auf ihr Potenzial für die Verwendung als Inhaltsstoff in Kosmetika hin.

Cistanche-Bodybuilding

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