Design, Synthese und antimelanogene Wirkungen von (2-substituierten Phenyl-1,3-dithiolan-4-yl)methanol-Derivaten

Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com

Do Hyun Kim1Su Jeong Kim1Sultan Ullah1Hwi Young Yun1Pusoon Chun2Hyung Ryong Moon1

Abstrakt:Die Autoren entwarfen und synthetisierten 17 (2-substituierte Phenyl-1,3-dithiolan-4-yl)methanol (PDTM)-Derivate, um ein neues chemisches Gerüst zu finden, das sich hervorragend zeigteTyrosinase-hemmendAktivität. Ihre Tyrosinase-hemmenden Aktivitäten wurden im Vergleich zu Pilz-Tyrosinase bei 50 μM bewertet, und es wurde festgestellt, dass fünf der PDTM-Derivate (PDTM3, PDTM7–PDTM9 und PDTM13) Pilze hemmenTyrosinasemehr als Kojisäure oder Arbutin, die Positivkontrollen. Von siebzehn PDTMs zeigte PDTM3 (halbmaximale Hemmkonzentration 13,94 ± 1,76 μM) mit einer 2,4--Dihydroxyphenyleinheit die größte Hemmwirkung (halbmaximale Hemmkonzentration von Kojisäure 18,86± 2,14 μM). Interessanterweise hatten auch PDTM-Verbindungen ohne Hydroxylgruppe, PDTM7–PDTM9, stärkere inhibitorische Aktivitäten als Kojisäure. In-silico-Studien zu Wechselwirkungen zwischen Tyrosinase und den fünf PDTMs legen nahe, dass ihre Bindungsaffinitäten eng mit ihren Tyrosinase-hemmenden Aktivitäten zusammenhängen. Zellbasierte Experimente, die mit B16F10-Maushaut-Melanomzellen durchgeführt wurden, zeigten, dass PDTM3 wirksam hemmtMelanogeneseund zellularTyrosinaseAktivität. Eine mit B16F10-Zellen durchgeführte Zellviabilitätsstudie zeigte, dass die antimelanogene Wirkung von PDTM3 nicht auf seine Zytotoxizität zurückzuführen war. Kinetische Studien zeigten, dass PDTM3 die Tyrosinase kompetitiv hemmt, was auf eine Bindung an das aktive Zentrum der Tyrosinase hindeutet. Wir fanden heraus, dass PDTM3 mit einem neuen chemischen Gerüst ein vielversprechender Kandidat für Hautaufheller sein könnte und dass der 1,3--Dithiolanring als chemisches Gerüst für eine starke Tyrosinase-Hemmung verwendet werden könnte.Schlüsselwörter:Tyrosinase-Inhibitor, Melanogenese, 1,3-Dithiolan, PDTM

Cistanche ist ein Tyrosinase-Hemmer.

Einführung

In den letzten JahrzehntenTyrosinase-Inhibitorensind aufgrund der Schlüsselrolle der Tyrosinase von erheblichem InteresseMelanogenese. Melanin wird durch eine Kombination aus enzymatisch katalysierten und chemischen Reaktionen hergestellt. Der für die Melaninproduktion verantwortliche Biosyntheseweg wurde ursprünglich von Raper1 und Mason2 aufgeklärt und kürzlich von Cooksey et al.3 und Schallreuter et al.4 modifiziert. Die Melanogenese wird durch das Enzym Tyrosinase initiiert, das die ersten beiden oxidativen Schritte im Melaninbiosyntheseweg katalysiert: die Oxidationen von L-Tyrosin zu L-Dopa, gefolgt von L-Dopa zu L-Dopachinon (Abbildung 1). Diese beiden Schritte sind auch die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte in der Melaninbiosynthese, da der physiologische pH-Wert spontan nachfolgende Schritte fortsetzen kann.5 Das im zweiten Schritt produzierte Dopachinon wird durch Glutathion oder Cystein in Cysteinyldopa und schließlich in Phäomelanin umgewandelt, das für Yellow To verantwortlich ist roten Farben der Säugetierhaut oder zu Dopachrom durch Autooxidation und schließlich zu Eumelanin, das für die braun/schwarzen Farben der Säugetierhaut verantwortlich ist (Abbildung 1). Melanin schützt die menschliche Haut vor schädlicher UV-Strahlung und bestimmt auch das phänotypische Erscheinungsbild. Andererseits kann eine übermäßige Ansammlung von Melanin in der Haut Hyperpigmentierungs-assoziierte Krankheiten und kosmetische Probleme wie Sommersprossen, Melasma und senile Lentigines verursachen.

Tyrosinaseist weit verbreitet in Bakterien, Pilzen, Insekten, Pflanzen und Tieren, einschließlich des Menschen, und ist verantwortlich für die Farben der menschlichen Haut und Haare und die unerwünschte Bräunung von Obst und Gemüse.6 Unerwünschte enzymatische Bräunung und Krankheiten, die mit Hyperpigmentierung der Haut verbunden sind haben Wissenschaftler dazu ermutigt, nach neuen potenten Tyrosinase-Inhibitoren zur Verwendung als Hautaufheller und Mittel gegen Bräunung zu suchen. VieleTyrosinase-Inhibitorenwurden bisher entdeckt,7–9, aber aufgrund von Sicherheitsbedenken oder schwacher aufhellender Wirkung wurden nur relativ wenige als hautaufhellende Materialien zugelassen.

In unseren früheren Studien haben wir auf der Grundlage von Strukturen von L-Tyrosin und L-Dopa, natürlichen Substraten von Tyrosinase, zwei potenzielle Tyrosinase-Inhibitoren mit einem Thiazolidinring (MHY384 und MHY794; Abbildung 1) entworfen und sie durch Kondensation eines geeigneten synthetisiert Benzaldehyd und L-Cystein oder Cysteaminhydrochlorid. Diese beiden Verbindungen wurden als stark kompetitiv identifiziertTyrosinase-Inhibitorenund um die Melanogenese in haarlosen HRM2-Mäusen wirksam zu reduzieren.10,11 Zusätzlich zur direkten Hemmung der Tyrosinaseaktivität hemmte MHY384 die Tyrosinaseexpression durch Unterdrückung der zyklischen Adenosinmonophosphat-PKA10- und NO-induzierten zyklischen Guanosinmonophosphat-PKG12,13-Signalwege, und MHY794 unterdrückte ebenfallsTyrosinasedurch NO-vermittelte Expression induziertMelanogeneseSignalisierung.11 Diese positiven Ergebnisse und die Tatsache, dass das zweiwertige –S– ein klassisches Isoster des zweiwertigen –NH– ist, ermutigten uns, Derivate mit einem Dithiolanring als Ersatz für den üblicherweise in MHY384 und MHY794 vorhandenen Thiazolidinring zu synthetisieren, um neue zu finden Tyrosinase-Inhibitoren.

In der vorliegenden Studie, als Teil unserer laufenden Bemühungen, ein neues und starkes chemisches Gerüst zur Hemmung der Tyrosinase zu finden und neu zu entwickelnTyrosinase-Inhibitorensynthetisierten wir eine Klasse von strukturell neuartigen (2-substituierten Phenyl-1,3-dithiolan-4-yl)methanol (PDTM)-Derivaten (Abbildung 1) und untersuchten ihre antimelanogene Wirkung unter Verwendung von Pilztyrosinase und zellbasierte Assays. In dieser Studie wurden Kojisäure und Arbutin als Positivkontrolle für die Tyrosinase-Hemmaktivität verwendet, da Kojisäure eine der am häufigsten verwendeten Positivkontrollen für die Bewertung der Tyrosinase-Hemmung ist und Arbutin klinisch als Weißmacher verwendet wird.

Materialen und Methoden

Materialien

Sofern nicht anders angegeben, alle im Handel erhältlichen Reagenzien – L-Tyrosin (Code T3754), L-Dopa (Code PHR1271), Kojisäure (Code K3125), MTT (3-(4,5-dimethyl{{ 8}}Thiazolyl)-2,5-Diphenyl-2H-tetrazoliumbromid) (Code M2128), PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) (Code P7626), Triton X-100 ( 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenylpolyethylenglycol) (Code T8787), Kaliumhydrogenphosphat (Code P9666), Kaliumdihydrogenphosphat (Code PHR1330), 2,3- Dimercapto-1-propanol (Code 64046), 1,4-dioxan (Code 296309), Schwefelsäure (Code 339741) und Benzaldehyde – wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Fötales Rinderserum, Dulbecco's Modified Eagle's Medium, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Penicillin, Streptomycin und Trypsin wurden von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) bezogen. PilzTyrosinase(Code T3824) und -Melanozyten-stimulierendes Hormon (-MSH; Code M4135) wurden ebenfalls von Sigma-Aldrich bezogen. 1 H- und 13 C-kernmagnetische Resonanzspektren (NMR) wurden auf Instrumenten Varian Unity Inova 400 und Varian Unity AS 500 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) aufgezeichnet. Niedrigauflösende Massenspektrometrie- (MS) und hochauflösende MS-Daten wurden auf einem Expression CMS (Advion, Ithaca, NY, USA) bzw. einem 6530 Accurate Mass Quadrupol-Flugzeit-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometer (Agilent) erhalten . Die Synthese von PDTM1–PDTM17 wurde in unserem Labor durchgeführt.

Cistanche-Extrakt

Allgemeines Verfahren zur Synthese von PDTM1–PDTM17

Zu einer gerührten Lösung von 2,3-Dimercapto-1-propanol (100 mg, 0,80 mmol) in 1,4-Dioxan (1 ml) wurden gegeben eine Lösung von Schwefelsäure (0,1 Äquivalente) in 1,4-Dioxan (1 ml) und anschließend einen geeigneten Benzaldehyd (1,1 Äquivalente) hinzu. Nach 10-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung 40 Minuten bis 1 Stunde bei 70 Grad gerührt. Das Gemisch wurde dann zwischen Ethylacetat und Wasser verteilt und die organische Schicht wurde über wasserfreiem MgSO 4 getrocknet, filtriert und eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie gereinigt, um reine PDTM-Produkte zu ergeben: PDTM1–PDTM17.14 Strukturelle Charakterisierung (1H- und 13C-NMR und Massendaten aller PDTMs und 1-D- und 2-D-NMR Spektren einiger PDTMs) synthetisierter Verbindungen finden Sie in Ergänzende Materialien.

Hemmung von PilzenTyrosinasedurch PDTM1–PDTM17

Die hemmenden Wirkungen von PDTM-Analoga auf Pilztyrosinase wurden mit geringfügigen Modifikationen untersucht, wie zuvor in unserer Arbeit beschrieben.15 Jede Verbindung (10 μl, Endkonzentration 50 μM) wurde mit einer Substratlösung (170 μl) gemischt, die aus 14,7 mM Kaliumphosphat hergestellt wurde Puffer (pH 6,5) und 293 µM L-Tyrosin-Lösung (1:1, v/v) in jede Vertiefung einer 96--Well-Platte geben. Zu jeder Vertiefung wurde Pilz-Tyrosinase-Lösung (20 μl, 1,000 U/ml) gegeben und 30 Minuten bei 37 Grad inkubiert. Der Gehalt an in den Vertiefungen gebildetem Dopachrom wurde durch Messen optischer Dichten bei 475 nm unter Verwendung eines VersaMax-Mikroplattenlesegeräts (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) bestimmt. Als Positivkontrollen wurden Kojisäure und Arbutin verwendet. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Hemmraten vonTyrosinasewurden so berechnet:

Hemmung ( Prozent )=× 100 [ ( 1 − AB/ )] (1)

wobei A die optische Dichte der Testverbindung angibt und B die optische Dichte der Kontrolle darstellt.

Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) ist die Konzentration einer Verbindung, die eine standardmäßige 50-prozentige Reaktion hemmt. IC50 wird von der x-Achse auf einer Kurve der Inhibitorkonzentration gegen die Produktbildung abgeleitet und wird aus der Ausrichtung der Dosis-Antwort-Kurve auf der abhängigen y-Achse bestimmt. In der vorliegenden Studie wurden dosisabhängige Hemmungsexperimente dreifach durchgeführt, um die IC50 von Verbindungen zu bestimmen. Gemäß dem Hemmprozentsatz von fünf Dosen (Endkonzentration 10, 20, 30, 40 und 50 &mgr;M) in jedem Experiment wurden die log-linearen Kurven und ihre Gleichungen bestimmt. Individuelle IC50-Werte wurden dann als die Konzentration berechnet, wenn die y-Achse gleich 50 Prozent Hemmung war. Die Ergebnisse der drei Experimente sind gezeigt.

Analyse der Natur der Pilz-Tyrosinase-Hemmung

Um die Natur der inhibitorischen Wirkung von PDTM3 auf Pilztyrosinase aufzuklären, wurden kinetische Studien durchgeführt. PDTM3 (10 μL [0, 5, 10 oder 25 μM Endkonzentration]) wurde zu 170 μL l-Tyrosin-Lösung (0,5, 1, 2 oder 4 mM Endkonzentration) gegeben und dann mit Pilz gemischtTyrosinaseLösung (20 μL, 1,000 U/mL) in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Nachdem das Gemisch 30 Minuten lang bei 37 Grad inkubiert worden war, wurde der Gehalt an in den Vertiefungen produziertem Dopachrom durch Messen der optischen Dichte bei 475 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts bestimmt. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Zur Bestimmung der Art der Hemmung wurde ein Lineweaver-Burk-Diagramm verwendet.

Cistanche-Extrakt Nutzen

Andocksimulation von PDTM3 oder Kojisäure mit Tyrosinase

Die In-Silico-Docking-Simulation von Protein-Ligand wurde mit AutoDock Vina unter Verwendung einer systematischen Suchtechnik und der 3-D-Struktur von Agaricus bisporus durchgeführtTyrosinase(Protein Data Bank ID 2Y9X).16,17 In der Kristallstruktur von Tyrosinase wurde die Bindungsstelle von l-Tyrosin als Andocktasche verwendet. Simulationsergebnisse wurden durch Andocken zwischen Tyrosinase und synthetischen Verbindungen (PDTM3, PDTM7, PDTM8, PDTM9 und PDTM13) oder Kojisäure erhalten. Vor der Docking-Simulation mit den Verbindungen wurden 2--D-Strukturen von Verbindungen in 3--D-Strukturen umgewandelt, Ladungen von Verbindungen bestimmt und Wasserstoffatome mit ChemOffice eingefügt. LigandScout 3.1.2 wurde zur Vorhersage möglicher Wechselwirkungen zwischen Liganden und Tyrosinase und zur Identifizierung von Pharmakophoren verwendet. Docking-Simulationsbilder von 17 PDTMs werden in ergänzenden Materialien bereitgestellt.

Bestimmung des Melanogeneseniveaus in B16F10-Zellen

Melanin-Gehalts-Assays mit geringfügigen Modifikationen wurden in B16F10-Zellen für die inhibitorischen Wirkungen von PDTM3 verwendetMelanogenese.19 Zellen, die mit einer Dichte von 5 × 1 0 4 Zellen/Vertiefung in einer 24- Vertiefungsplatte ausgesät wurden, ließ man bei 37 Grad in einer befeuchteten Atmosphäre, die 5 % CO2 enthielt, über Nacht anhaften. Am folgenden Tag wurden die Zellen -MSH (1 µM) und PDTM3 (0, 5, 10 oder 25 µM) oder Kojisäure (25 µM) ausgesetzt und die Platte 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen durch Inkubation bei 60 Grad in 200 &mgr;l 1 N NaOH für 1 Stunde abgelöst. Die Lysate wurden auf eine 96--Well-Platte überführt, und die optischen Dichten wurden bei 405 nm mit einem enzymgebundenen Immunosorbent-Assay-Lesegerät zur Berechnung der mittleren prozentualen Hemmungen von Kojisäure und PDTM3 gemessen. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Tyrosinase-Aktivitätsassay in B16F10-Zellen

Durch Abschätzung der Oxidationsrate von L-Dopa,TyrosinaseAktivitäten wurden mit geringfügigen Modifikationen bewertet, wie in der vorherigen Arbeit beschrieben.20 Zellen, die mit einer Dichte von 5×104 Zellen/Well in einer 24-Well-Platte ausgesät wurden, wurden zugelassen haften bei 37 Grad in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 Prozent CO2 für 24 Stunden. Die Zellen wurden -MSH (1 &mgr;M) und PDTM3 (0, 5, 10 oder 25 &mgr;M) oder Kojisäure (25 &mgr;M) ausgesetzt und die Platte wurde unter den gleichen Bedingungen für 24 Stunden inkubiert. Nach zweimaligem Spülen mit PBS wurden die Zellen mit 100 μl Lysepuffer lysiert, der 0,1 mM PMSF (5 μl), 50 mM PBS (90 μl, pH 6,8) und 1 Prozent Triton X-100 (5 μl) enthielt. und gefroren bei -80 Grad für 30 Minuten. Die Lysate wurden aufgetaut und bei 12 000 g für 30 Minuten bei 4 Grad zentrifugiert, und die Überstände (80 μl) wurden mit 10 mM l-Dopa (20 μl) in einer 96--Well-Platte vereinigt, die dann zentrifugiert wurde 30 Minuten bei 37 Grad inkubiert. Optische Dichten wurden bei 500 nm berechnet und die inhibitorischen Aktivitäten von Tyrosinase wurden wie folgt bestimmt:

Hemmung ( Prozent )=× 100 ([A−B] − [C−D] /[ A−B ] ) (2)

wobei B und A die optischen Dichten der Blindprobe vor bzw. nach der Inkubation sind und D und C die optischen Dichten der Testverbindung vor bzw. nach der Inkubation sind.

statistische Analyse

Eine Einweg-Varianzanalyse, gefolgt von einem Dunnett-Test, wurde verwendet, um zu bestimmen, ob sich die Gruppenmittelwerte signifikant von denen der Kontrollen unterschieden. Der ungepaarte t-Test von Welch wurde verwendet, um zu bestimmen, ob die Wirkungen von PDTM3 und Kojisäure signifikant unterschiedlich waren. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung von GraphPad (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Alle Ergebnisse sind als Mittelwerte ± Standardfehler von drei unabhängigen Experimenten angegeben. Zweiseitige P-Werte von 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Resultate und Diskussion

Herstellung von PDTM1–PDTM17PDTM1–PDTM17 wurden wie in Schema 1 gezeigt synthetisiert. Erhitzen von 2, 3-Dimercapto-1-propanol und zahlreichen geeignet substituierten Benzaldehyden (1–17) in 1,4-Dioxan in die Anwesenheit von Schwefelsäure lieferte die gewünschten PDTM-Produkte als Feststoffe oder klebriges Öl. Die Strukturen der Endprodukte wurden durch 1H- und 13C-NMR, Korrelationsspektroskopie, heteronucleare Einzelquantenkorrelationsspektroskopie, heteronucleare Mehrfachbindungskorrelationsspektroskopie und MS mit niedriger und hoher Auflösung bestätigt. Das Vorliegen des dem –SCH(Ph)S–-Proton entsprechenden Singuletts bei δ=6.09–5.56 ppm in 1H-NMR-Spektren bestätigte die Bildung eines Dithiolanrings zwischen Benzaldehyden und 2,3-Mercapto -1-Propanol. In 1H-NMR-spektroskopischen Daten von PDTMs erschien der 2-H-Peak tiefer im Feld als die Peaks der an sp3-Kohlenstoffatome gebundenen Protonen, und die 4-H-Exomethylen- und 5-H2-Peaks wurden häufiger beobachtet Upfield in benannter Reihenfolge. In 13C-NMR-spektroskopischen Daten lag, abgesehen von den Peaks des Phenylrings, der Kohlenstoffpeak von Exomethylen (~64 ppm) am tiefsten, gefolgt von 4-C (~58 ppm), 2-C (~55,3 ppm) und 5-C (~41 ppm). Vier Produkte – PDTM6, PDTM12, PDTM13 und PDTM15 – wurden jeweils als einzelnes Racemat erhalten, während die anderen als Mischung aus zwei Racematen ([2R,4R]/[2S,4S] und [2R,4S]/ [2S,4R], 1:1–1:1.5), deren Verhältnisse anhand von 1H-NMR-spektroskopischen Daten berechnet wurden. Das Phänomen bei der Produktbildung konnte nicht einfach durch sterische, elektronische und/oder stereoelektronische Effekte erklärt werden. DasTyrosinase-HemmungDer Assay wurde ohne Trennung der Racemate durchgeführt.

Hemmende Wirkungen von PDTM1–PDTM17 auf Pilztyrosinase

Das Potenzial der 17 synthetisierten Produkte PDTM1–PDTM17 zur Hemmung der Pilz-Tyrosinase-Aktivität wurde unter Verwendung von Kojisäure22 und Arbutin23 als Positivkontrollen untersucht. Hemmungen wurden unter Verwendung von 293 &mgr;M l-Tyrosin als Substrat und synthetischen Verbindungen in einer Konzentration von 50 &mgr;M bestimmt.TyrosinaseHemmungen durch Kojisäure und Arbutin wurden bei 50 bzw. 500 µM bestimmt.

Drei Verbindungen – PDTM11 (3,4,5-Trimethoxyphenyl), PDTM15 (4-Hydroxy-3-methylphenyl) und PDTM17 (3,5-Di-t-butyl{{ 12}}hydroxymethyl) – hemmte Tyrosinase in gleichem Maße wie Kojisäure und hemmte sie stärker als Arbutin (Tabelle 1). Fünf PDTM-Derivate – PDTM3 (2,4-Dihydroxyphenyl), PDTM7 (4-Methoxyphenyl), PDTM8 (3,4-Dimethoxyphenyl), PDTM9 (2,4-Dimethoxyphenyl), und PDTM13 (3-Brom-4-hydroxyphenyl) – hemmte die Tyrosinase stärker als Kojisäure. Die IC50-Werte dieser Verbindungen wurden untersucht: 13,94 ± 1,76 µM (PDTM3), 16,47 ± 2,36 µM (PDTM7), 16,97 ± 2,99 µM (PDTM8), 27,85 ± 1,47 µM (PDTM9) und 15,57 ± 3,31 µM (PDTM13). Die niedrigen IC50-Werte von PDTM3, PDTM7, PDTM8 und PDTM13 zeigten, dass die Wirksamkeit stärker war als die von Kojisäure (18,86±2,14 µM) und Arbutin (381,26±3,22 µM), die als Positivkontrollen verwendet wurden . Interessanterweise stimmt dieses Ergebnis mit unserem früheren Befund überein, dass viele Analoga mit einer 2,4--Dihydroxyphenyl-Einheit eine höhere besitzenTyrosinase-hemmendAktivität als Kojisäure.10,13,24–32

Die übrigen PDTM-Derivate hatten im Vergleich zu Kojisäure keine (PDTM1 und PDTM2) oder eine geringe hemmende Wirkung (PDTM4, PDTM5, PDTM6, PDTM10, PDTM12, PDTM14 und PDTM16). Gemäß unseren gesammelten Struktur-Aktivitäts-Beziehungsdaten waren Analoge mit mindestens einer Hydroxylgruppe besser in der Lage, Tyrosinase zu hemmen. Etwas überraschend hemmten vier PDTM-Derivate ohne Hydroxylgruppe die Tyrosinase-Aktivität genauso stark oder wirksamer als Kojisäure. Dies waren PDTM7 (4-Methoxyphenyl), PDTM8 (3,4-Dimethoxyphenyl), PDTM9 (2,4-Dimethoxyphenyl) und PDTM11 (3,4,5-Trimethoxyphenyl) . Verbindungen (PDTM1-2, PDTM4-5 und PDTM12) mit nur einer 4--Hydroxylgruppe am Phenylring oder einer Alkoxy- oder Hydroxylgruppe an Position 3 mit einer 4--Hydroxylgruppe Gruppe hatte eine geringe oder keine Aktivität, wohingegen Verbindungen (PDTM13–PDTM17) mit einer Alkyl- oder Bromgruppe an Position 3 mit einer 4--Hydroxylgruppe eine mäßige bis hohe Tyrosinase-hemmende Aktivität zeigten. Diese Ergebnisse der Struktur-Wirkungs-Beziehung unterstützen die Hypothese, dass dietyrosinasehemmendDie Aktivität von Verbindungen mit einer 4--Hydroxylgruppe wird stark von der Art des 3--Substituenten beeinflusst.

ZistancheVorteil: Anti-Aging

Modus der Pilz-Tyrosinase-Hemmung durch PDTM3

Da PDTM3 den Pilz hemmtTyrosinaseIn den meisten Fällen wurde ein Lineweaver-Burk-Diagramm verwendet, um die Art seiner inhibitorischen Wirkung zu bestimmen. Wie in Abbildung 2 dargestellt, wurde ein doppelt-reziprokes Diagramm erhalten, und alle Linien mit unterschiedlichen Steigungen schnitten die y-Achse am selben Punkt. Daher stiegen die Km-Werte (Michaelis-Konstante) allmählich mit der Konzentration von PDTM3 an. Detaillierte kinetische Parameterwerte sind in Tabelle 2 gezeigt. Andererseits wurde die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) nicht durch die PDTM3-Konzentration beeinflusst. Diese Befunde zeigen, dass PDTM3 die Tyrosinase dosisabhängig und kompetitiv hemmt.

In-silico-Docking-Simulationen der Assoziation von Tyrosinase mit PDTM3, PDTM7–PDTM9, PDTM13 und Kojisäure

AutoDock Vina wurde verwendet, um zu bestimmen, ob die synthetisierten PDTM-Analoga die Tyrosinase durch Bindung an ihr aktives Zentrum direkt hemmten. Kojisäure und fünf PDTM-Analoga (PDTM3, PDTM7–PDTM9 und PDTM13), von denen festgestellt wurde, dass sie potente Pilze habenTyrosinase-hemmendAktivität, wurden als Liganden für die Docking-Simulation verwendet. Jedes dieser PDTM-Analoga könnte vier Stereoisomere aufweisen, und die Bindungsenergien der Stereoisomere sind in Fig. 3A angegeben. Es wurde festgestellt, dass alle fünf PDTM-Analoga im Vergleich zu Kojisäure (-5,4 kcal/mol) eine ähnliche oder höhere Affinität für das aktive Zentrum von Tyrosinase aufweisen, und PDTM3 zeigte die größte Affinität. Dieses Ergebnis zeigte, dass die starken inhibitorischen Wirkungen dieser fünf PDTM-Derivate ihrer Bindungsaffinität mit Tyrosinase zuzuschreiben waren, und zeigte eine enge Beziehung zwischen Bindungsaffinität, wie durch Docking-Simulation bestimmt, und Tyrosinase-Hemmung.

Zur Identifizierung wurde LigandScout 3.1.2 verwendetTyrosinaseAminosäurereste, die mit PDTM-Analoga interagieren. Wie in den Abbildungen 3B und C gezeigt, interagierte die 4--Hydroxylgruppe am Phenylring von PDTM3 mit His85 der Tyrosinase über Wasserstoffbrücken, und der Phenylring interagierte mit Val283 und Ala286 über hydrophobe Wechselwirkungen und mit His263 über π–π Stapel-Interaktion. Wasserstoffbindungen zwischen der alkoholischen Hydroxylgruppe und den Aminosäureresten der Tyrosinase wurden nur für PDTM7 und PDTM8 nachgewiesen. Die alkoholische Hydroxylgruppe beider PDTM-Analoga interagierte jedoch mit unterschiedlichen Aminosäureresten, z. B. interagierte PDTM7 mit His244 und Asn260, während PDTM8 mit Gly281 interagierte. Darüber hinaus war Val283 der Tyrosinase an hydrophoben Wechselwirkungen mit allen fünf Analoga beteiligt.

Melanin-Gehalts-Assays

B16F10-Zellen wurden verwendet, um die depigmentierenden Aktivitäten der PDTM-Analoga zu bewerten. PDTM3 wurde aufgrund seines potenten Pilzes für die zellbasierten Experimente ausgewähltTyrosinase-hemmendWirkung und seine fehlende Toxizität für B16F10-Zellen. PDTM3 wurde auf seine hemmende Wirkung gegen -MSH-stimuliert untersuchtMelanogenesein B16F10-Zellen durch Bestimmung des Melaninspiegels in den Zellen. Die Melaninspiegel waren signifikant reduziert, nachdem Zellen mit PDTM3 und -MSH behandelt wurden, verglichen mit Zellen, die nur mit -MSH behandelt wurden. Über den Konzentrationsbereich von 0–25 μM zeigte PDTM3 eine signifikante und dosisabhängige antimelanogene Wirkung. Darüber hinaus zeigte PDTM3 bei einer Konzentration von nur 10 μM eine höhere inhibitorische Potenz als Kojisäure bei 25 μM, wie in Abbildung 5 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigten, dass die antimelanogene Wirkung von PDTM3 in B16F10-Zellen nicht mit Zytotoxizität zusammenhängt.

Tyrosinase-Aktivitätsassay in B16F10-Zellen

Die inhibitorische Wirkung von PDTM3 auf die zelluläre Tyrosinaseaktivität wurde in mit -MSH vorstimulierten B16F10-Zellen untersucht. PDTM3 dosisabhängig gehemmtTyrosinaseAktivität über den Konzentrationsbereich 0–25 μM (Abbildung 6). Darüber hinaus stimmten diese Ergebnisse gut mit den Ergebnissen des Melaningehalts überein, was darauf hindeutete, dass die antimelanogene Wirkung von PDTM3 auf die Hemmung von Tyrosinase zurückzuführen war.

Fazit

In dieser Arbeit wurde eine Vielzahl von PDTM-Analoga synthetisiert und auf ihre Wirkungen untersuchtMelanogeneseund Tyrosinase-Aktivität in B16F10-Zellen. Acht Analoga zeigten eine ebenso starke oder stärkere Hemmung gegen Pilztyrosinase als Kojisäure, und PDTM3 hatte die größte hemmende Aktivität. In B16F10-Zellen hemmte PDTM3 signifikant die Melanin-Biosynthese in dosisabhängiger Weise undTyrosinaseAktivität über den Konzentrationsbereich 0–25 μM ohne zytotoxische Wirkung. Bei einer Konzentration von 10 μM reduzierte PDTM3 die Melaninbiosynthese und die Tyrosinaseaktivität signifikant stärker als Kojisäure bei 25 μM. Angesichts unserer Beobachtung, dass viele PDTM-Analoga starke tyrosinasehemmende Wirkungen zeigten, schlagen wir vor, dass 1,3-Dithiolan als geeignetes Gerüst dafür angesehen wirdTyrosinase-hemmendAktivität. Nun suchen wir nach Trennbedingungen für jedes PDTM-Gemisch aus zwei Racematen, und die Trennbedingungen und die antimelanogene Wirkung jedes einzelnen Racemats werden zu gegebener Zeit mitgeteilt.

Kaufen Sie Cistanche-Ergänzungen