Bewertung der antimelanogenen Aktivität und des Mechanismus von Galangin in Silico und in Vivo

Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com

Ki Wung Chung, ein Hyeong Oh Jeong, ein Eun Kyeong Lee, ein Su Jeong Kim, ein Pusoon Chun, bHae Young Chung,*, a und Hyung Ryong Moon*, a

Eine abnormale Pigmentierung aufgrund einer übermäßigen Melaninsynthese kann zu ernsthaften Problemen wie Sommersprossen, Altersflecken und Melanomen führen. Tyrosinase-Inhibitoren sind ein interessantes Ziel für die Behandlung von Hyperpigmentierung, da Tyrosinase das geschwindigkeitsbestimmende Enzym bei der Melaninsynthese ist. Das Screening nach starken Tyrosinase-Hemmern führte zur Entdeckung des FlavonoidsGalanin, die bemerkenswerte inhibitorische Wirkungen auf die Pilztyrosinase zeigten. Der IC50-Wert von Galanin (3,55 ± 0,39 µM) war niedriger als der von Kojisäure (48,55 ± 1,79 µM), die als positive Kontrolle verwendet wurde. In-silico-Docking-Simulationen und mechanistische Studien zeigten, dass Galanin mit den katalytischen Zentren von Tyrosinase interagiert und mit Tyrosin konkurriert. In B16F10-Melanomzellen, die mit -Melanozyten-stimulierendem Hormon stimuliert wurden, hemmte Galanin sowohl die Tyrosinaseaktivität als auch die Melaninproduktion. Obwohl hohe Dosen vonGalaninzytotoxisch waren, wurden bei niedrigen Dosen keine zytotoxischen Wirkungen beobachtet. Darüber hinaus wurde die In-vivo-Wirksamkeit von Galanin in HRM2-Melanin-besitzenden haarlosen Mäusen bewertet. Wie anhand des Hautaufhellungsindex und der Melaninfärbung gemessen, erhöhte die wiederholte UVB-Exposition die Melaninsynthese der Haut. Die Anwendung von Galangin reduzierte die durch UVB-Exposition induzierte Melanogenese signifikant. Zusammengenommen weisen unsere Daten darauf hinGalaninzeigt eine starke Tyrosinase-Inhibierungsaktivität, was darauf hindeutet, dass es ein wirksames Mittel zum Aufhellen der Haut sein könnte.

SchlüsselwörterGalanin; Melanogenese; Pigmentierung; Tyrosinase

Cistanche-Extrakt

Galangin, eine Flavonoidverbindung, kommt in hohen Konzentrationen in Alpinia officinarum und Helichrysum vor. Frühere Studien haben gezeigt, dass Galangin verschiedene pharmakologische Aktivitäten hat, Pflanzen vor UV-Strahlung, Krankheitserregern und Pflanzenfressern schützt und antibakterielle und antivirale Aktivitäten ausübt.2– 4) Es hat jedoch auch antioxidative Eigenschaften, die auf seine wohltuenden Wirkungen zurückzuführen sind.5) Galangin übt auch Antikrebswirkungen aus, indem es das Wachstum der Krebszellen hemmt.6,7)

Melanin ist ein biologischer Farbstoff, der in den meisten Organismen vorkommt. In der Hautbiologie entsteht Melanin durch die Oxidation der Aminosäure Tyrosin. In der normalen Physiologie verhindert Melanin Hautverletzungen durch die Absorption schädlicher UV-Strahlung.8) Das synthetisierte Melanin in Haut-Melanozyten wird auf Keratinozyten verteilt, wo es hauptsächlich am Schutz vor schädlicher UV-Strahlung beteiligt ist.8) Trotz gewisser Vorteile jedoch überschüssiges Melanin kann auch ästhetische Probleme und Hautkrankheiten verursachen.9) Abnormale Pigmentierungen wie Sommersprossen, Altersflecken, Melasma und senile Lentigines verursachen ernsthafte Probleme der normalen Hautphysiologie.10,11) Daher ist die Modulation der Melanogenese eine wichtige Strategie für die Behandlung übermäßiger Hautpigmentierung. An den Prozessen der Melanogenese sind eine Reihe von Enzymen beteiligt. Unter diesen verschiedenen Enzymen ist die Tyrosinase, die die Oxidationsprozesse von L-Tyrosin zu 3,4--Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) und L-DOPA zu Dopachinon katalysiert, das wichtigste.12) Diese durch Tyrosinase vermittelten Prozesse sind geschwindigkeitsbegrenzende Prozesse. Unter abnormalen Bedingungen wurde die Hyperaktivierung von Tyrosinase mit erhöhter Gesamtmelaninproduktion nachgewiesen.13) Aufgrund ihrer Schlüsselrolle bei der Melanogenese ist Tyrosinase ein attraktives Ziel für ein depigmentierendes Mittel.14) Daher sind verschiedene Tyrosinase-Inhibitoren sowohl natürlich vorkommend als auch synthetisch Quellen wurden entwickelt. Viele Tyrosinase-Inhibitoren, darunter Hydroxychinon, Kojisäure und Arbutin, wurden bereits in der Arzneimittel- und Kosmetikindustrie verwendet. Obwohl mehrere Tyrosinase-Inhibitoren kommerziell entwickelt wurden, sind zytotoxische Nebenwirkungen offensichtlich geworden.12) Daher werden wirksame und sichere Mittel zur Hautaufhellung benötigt.

Der Zweck dieser Studie war es, Galangin mit verschiedenen experimentellen Methoden als potenten Tyrosinase-Inhibitor zu charakterisieren. Bei der Suche nach Tyrosinase-Inhibitoren aus natürlichen Quellen fanden wir heraus, dass Galangin die Tyrosinase-Aktivität mit hoher Wirksamkeit signifikant reduzierte. Da bereits über die inhibitorische Wirkung von Galanin auf Tyrosinase berichtet wurde, konzentrierten wir uns auf die inhibitorischen Mechanismen und die Potenz in Zell- und Tierversuchen.1) Unter Verwendung verschiedener In-silico-, In-vitro- und In-vivo-Experimente deuteten unsere Daten darauf hin, dass Galanin a starker Hautaufheller zur Behandlung von Hautpigmentierung.

cistanche tubolosa gesundheitliche Vorteile:Hautaufhellung

MATERIALEN UND METHODEN

Materialien

Galangin, Kojisäure, Pilz-Tyrosinase, L-Tyrosin, -Melanozyten-stimulierendes Hormon (-MSH) und andere chemische Reagenzien wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) bezogen.

Messung der Tyrosinase-Hemmwirkung und des Hemmmechanismus in einem zellfreien System

Um die inhibitorische Wirksamkeit und die Mechanismen von Galangin auf Tyrosinase zu bewerten, wurde Pilz-Tyrosinase wie zuvor beschrieben verwendet. Kurz gesagt, 1000 Einheiten Pilztyrosinase wurden in 20 &mgr;l phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst und zu 170 &mgr;l der Testmischung gegeben, die 1 mM L-Tyrosin, 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) und 10 &mgr;l enthielt das Testmaterial. Das Gemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur (25 Grad) inkubiert. Die Menge an produziertem Dopachrom wurde spektrophotometrisch bei 492 nm (OD492) in einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen. Die IC50 wurde aus Wiederholungen des Experiments bei unterschiedlichen Galangin-Dosen berechnet. Um den inhibitorischen Mechanismus von Galanin zu bestimmen, wurde ein Tyrosinase-Kinetik-Assay durchgeführt. Für den Hemmtest wurden verschiedene Konzentrationen von L-Tyrosin (1, 2, 4 und 8 mM) verwendet. Nach der Untersuchung wurde jeder Wert gemäß Lineweaver-Burk-Plots in seinen Kehrwert umgewandelt. Die Ergebnisse zeigten den Plot von 1/V gegen 1/[S]. Der Schnittpunkt jeder Auftragung wurde verwendet, um den Hemmmechanismus zu bestimmen.

Docking-Simulation

Für die In-Silico-Protein-Ligand-Docking-Simulation haben wir AutoDock4.2 verwendet. Zwischen dem Protein und dem Liganden wurde eine erfolgreiche Bindung erhalten. Die dreidimensionale (3D) Struktur der Tyrosinase, die in der Kristallstruktur verwendet wurde, stammte von Agaricus bisporus (PDB ID: 2Y9X), und eine vordefinierte Bindungsstelle von Tyrosin wurde als Docking-Tasche verwendet.15) Die Docking-Simulationen wurden zwischen Tyrosinase und Galangin durchgeführt /Kojisäure. Die Verbindungen wurden für die Docking-Simulation durch die folgenden Schritte vorbereitet: (1) 2D-Strukturen wurden in 3D-Strukturen umgewandelt; (2) Ladungen wurden berechnet und (3) Wasserstoffatome wurden unter Verwendung des Programms ChemOffice hinzugefügt. Die Vorhersage möglicher Wasserstoffbindungsreste zwischen den Verbindungen und Tyrosinase und die Erzeugung von Pharmakophoren wurden von LigandScout 3 berechnet.0.

Zellkultursystem

Murine Melanom-B16F10-Zellen, die von der American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) erhalten wurden, wurden zuerst verwendet, um die Wirkungen von Galanin auf die Tyrosinase-Hemmung zu bewerten. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; WELGENE Inc., Korea, LM001-05), ergänzt mit 10 Prozent fötalem Rinderserum (FBS; WELGENE Inc., S101-01) und Penicillin/Streptomycin, kultiviert (100 IE/50 µg/ml; WELGENE Inc., LS202-02) bei 37 Grad in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 in der Luft. Um die Auswirkungen von Galangin auf die Zelllebensfähigkeit zu bewerten, wurde ein Zelllebensfähigkeitsassay unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (EZ-1000, Dogen Bio, Korea) durchgeführt. Kurz gesagt, die Zellen wurden in Platten mit 96- Vertiefungen kultiviert und mit unterschiedlichen Galanginkonzentrationen behandelt. Nach der angegebenen Zeit wurde die Extinktion bei 450 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts abgelesen. Alle Zellversuche wurden mindestens dreimal durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

Tyrosinase-Aktivität

Tyrosinase-Aktivität in B16F10-Zellen wurde durch Messung der Oxidationsgeschwindigkeit von L-DOPA untersucht. Die Zellen wurden in Schalen mit 60 π-Wells ausplattiert, in Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 &mgr;M -MSH inkubiert und dann 24 h lang mit 5 und 10 &mgr;M Galangin behandelt. Als Positivkontrolle diente die Behandlung mit Kojisäure. Die Zellen wurden in 500 &mgr;l 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,8), enthaltend 25 &mgr;l 1 % Triton X-100 und 25 &mgr;l 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, lysiert und dann bei –80 Grad für 30 min eingefroren. Nach dem Auftauen und Mischen wurden die Zelllysate durch Zentrifugation bei 12000 × g für 30 min bei 4 Grad geklärt. Die Überstände (80 ul) wurden in eine 96--Well-Platte gegeben, 20 ul L-DOPA (2 mg/ml) wurden hinzugefügt, und die Extinktion wurde bei 492 nm alle 10 Minuten für 1 Stunde bei 37 Grad abgelesen ein Plattenlesegerät.

Cistanche-Extrakt: Hemmt die Tyrosinase-Expression

Melaningehalt

In der aktuellen Studie wurde der Melaningehalt als Index der Melanogenese verwendet. Kurz gesagt, B16-Zellen wurden in einer 60π-Schale ausplattiert und in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 &mgr;M -MSH inkubiert. Die Zellen wurden dann für 24 h mit oder ohne Galangin bei 5 und 10 &mgr;M inkubiert. Als positive Kontrolle diente die Behandlung mit Kojisäure. Nach zwei Waschgängen mit PBS wurden die Proben in 500 &mgr;l 1 N NaOH gelöst, 1 h bei 60 Grad inkubiert und gemischt, um das Melanin zu solubilisieren. Die Extinktion bei 405 nm wurde unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts gemessen.

In-vivo-Experimente

Die depigmentierende Wirksamkeit von Galangin in vivo wurde in Tierversuchen untersucht. Die Tierversuche wurden von der Aging Tissue Bank konzipiert, vom Institutional Animal Care Committee der Pusan ​​National University genehmigt und gemäß den von der Pusan ​​National University herausgegebenen Richtlinien für Tierversuche durchgeführt. Sechs Wochen alte männliche HRM2-Melanin-besitzende haarlose Mäuse wurden von Hoshino Laboratory Animals (Yoshino, Saitama, Japan) erhalten und unter kontrollierten Bedingungen gehalten (23 ± 1 Grad, 55 % ± 5 % Luftfeuchtigkeit, 12- h Licht /Dunkelzyklus) mit freiem Zugang zu Wasser und einer Standard-Labordiät. Nach einer Eingewöhnungszeit von 1 Woche wurden die Mäuse zufällig in vier Gruppen von sechs Tieren eingeteilt. Galangin (10 µM) und Kojisäure (50 µM) wurden in einer Lösung aus Propylenglycol und Ethanol (3:7) hergestellt. Gelöste Lösung (200 &mgr;l) oder Vehikel wurde einmal täglich topisch auf die Rückenhaut des Tieres aufgetragen. Die Tiere wurden mit UVB aus einem CROSSLINKER (BEX-800, Ultra-Lum Inc., CA, USA) mit 50 mJ/cm2 gemäß dem Tierversuchsplan bestrahlt. Die Farben der Hautstellen wurden unter Verwendung eines Spektrophotometers CR-10 (Konica Minolta Sensing, Inc., Sakai, Osaka, Japan) gemessen, in dem die Farben durch ihre L*-, a*- und b*-Werte beschrieben wurden gemäß dem Farbsystem der Commission International de L'Eclairage. Nachdem die Tiere getötet worden waren, wurden die Häute gesammelt, in 4 Prozent Paraformaldehyd über Nacht bei Raumtemperatur fixiert und unter Verwendung eines Fontana-Masson-Färbekits von American Master*Tech Scientific, Inc. (Lodi, CA, USA) auf Melanin gefärbt gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, geschnittene Häute wurden mit einer ammoniakalischen Silberlösung für 60 Minuten bei 60 Grad gefärbt, in 0,1 Prozent Goldchlorid und dann in 5 Prozent Natriumthiosulfat inkubiert.

Statistische Analysen

Der Student's t-Test wurde verwendet, um Unterschiede zwischen zwei Gruppen zu analysieren, und ANOVA wurde verwendet, um Unterschiede zwischen Gruppen zu analysieren. Werte von p<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" analysis="" was="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 5="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">

cistanche tubolosa

ERGEBNISSE

In-Silico-Docking-Simulation von Galangin an Tyrosinase

Galangin ist ein natürlich vorkommender sekundärer Pflanzenstoff und enthält eine Flavonoideinheit in seiner Struktur (Abb. 1). Zunächst wurde eine Docking-Simulation zwischen Pilz-Tyrosinase (Tertiärstruktur) und Verbindungen (Galangin, Kojisäure und Tyrosin) durchgeführt. Die Andockstelle, an der Galangin und Kojisäure gebunden waren, wurde zuvor als aktive Stelle der Tyrosinase bestimmt.15) Diese Simulation war erfolgreich und es wurde eine signifikante Punktzahl erzielt. Die Bindungsenergie zwischen Galangin und Tyrosinase betrug –7,67 kcal/mol, bestimmt durch Analyse mit Autodock4.2. Die Bindungsenergie zwischen Tyrosinase und Kojisäure (der positiven Kontrolle) betrug –4,09 kcal/mol und –5,13 kcal/mol zwischen Tyrosinase und dem ursprünglichen Substrat Tyrosin (Tabelle 1). Diese Ergebnisse zeigten, dass Galangin Tyrosinase mit einer höheren Affinität als die anderen Wechselwirkungen band. Basierend auf den Docking-Simulationsergebnissen suchten wir die Wechselwirkungen zwischen Tyrosinase und Verbindungen mit dem LigandScout-Programm. Wir fanden heraus, dass Galangin mit ASN-260, VAL-283, ALA-286 und PHE-292 interagierte, während Kojisäure nur mit ASN-260 und MET280 interagierte ( Abb. 2, Tabelle 1). Diese Wechselwirkungen können daher die Schlüsseldeterminanten der Inhibitoraktivität sein und einen wichtigen Einfluss auf den Docking-Score haben.

Bestimmung von antimelanogenen Wirkungen und Mechanismen in Pilz-Tyrosinase

Basierend auf den Ergebnissen von in silicore und anderen zuvor berichteten Ergebnissen haben wir die antimelanogenen Wirkungen und Mechanismen unter Verwendung von Pilztyrosinase bewertet. Beim Testen mit der Pilz-Tyrosinase in einem zellfreien System war die inhibitorische Wirksamkeit von Galangin stärker als die von Kojisäure (Fig. 3A). Außerdem verringerte Galangin dosisabhängig die Tyrosinaseaktivität (Fig. 3B). Die IC50-Werte von Galangin und Kojisäure wurden berechnet und sind in Tabelle 2 dargestellt. Der niedrige IC50-Wert von Galangin (3,55 ± 0,39 µM) zeigte an, dass die Wirksamkeit signifikant höher war als die von Kojisäure Säure (48,55 ± 1,79 uM). Der Hemmmechanismus von Galangin wurde weiter unter Verwendung von Lineweaver-Burk-Double-Reciprocal-Plots bewertet. Für den Inhibitionsassay wurden verschiedene Konzentrationen von L-Tyrosin (1, 2, 4 und 8 mM) und Galangin (0, 7,5 und 15 &mgr;M) verwendet. Die zeitabhängigen Änderungen der Extinktion wurden gemessen und die doppelt-reziproken Ergebnisse aufgetragen (Fig. 3C). Die Ergebnisse zeigten, dass das Diagramm von 1/V gegenüber 1/[S] drei verschiedene Linien mit unterschiedlichen Steigungen erzeugte, die sich auf derselben vertikalen Achse schnitten. Als die Konzentration der Verbindung zunahm, stieg der Wert von Km, aber die Werte von Vmax blieben gleich, was darauf hindeutete, dass Galangin ein kompetitiver Inhibitor der Bindung an Tyrosinase war. Diese Daten stimmten mit den in silico-Ergebnissen überein, dass Galangin an die aktive Stelle von Tyrosinase gebunden und diese gehemmt hat.

Abb. 1. Die Strukturen von Galangin, Kojisäure und Tyrosin

Bewertung der Depigmentierungsaktivität von Galangin in B16F10-Mäuse-Melanomzellen

Als nächstes wurde die Depigmentierungsaktivität von Galangin unter Verwendung von B16F10-Mäuse-Melanomzellen bewertet. Zunächst wurden die zytotoxischen Wirkungen von Galangin auf B16F10-Mäuse-Melanomzellen getestet. Wie in Fig. 4A gezeigt, verringerte Galangin signifikant die Lebensfähigkeit der Zellen bei Dosen über 25 uM. Um Zytotoxizität zu vermeiden, verwendeten wir daher 5 uM und 10 uM Galangin in den Experimenten, um die antimelanogenen Wirkungen zu bewerten. B16F10-Zellen wurden mit Galangin in Gegenwart von 1 &mgr;M -MSH behandelt. Die durch -MSH-Behandlung verursachte Gesamtmelaninsynthese war mit bloßem Auge sichtbar und zeigte, dass Galangin die -MSH-ausgelöste Melaninsynthese stark hemmte (Fig. 4B). -MSH-Behandlung erhöhte die Tyrosinaseaktivität und den Melaningehalt von B16F10-Zellen signifikant (Fig. 4C, D). Die Behandlung mit Galangin hemmte die zelluläre Melanogenese, die durch -MSH dosisabhängig gesteigert wurde (Fig. 4C, D). Insgesamt deuteten diese Ergebnisse darauf hin, dass Galangin ein wirksames Mittel zur Unterdrückung der Melanogenese durch die Hemmung von Tyrosinase sein könnte.

Tabelle 1. Docking-Scores und die wichtigsten interaktiven Reste von Verbindungen

Auswirkungen von Galangin auf die in vivo-Hautpigmentierung

Die inhibitorischen Wirkungen von Galangin wurden anschließend an Melanin-besitzenden haarlosen Mäusen untersucht, die gemäß dem Schema in Fig. 5A behandelt wurden. Die Farben der Hautstellen wurden unter Verwendung eines Spektrophotometers genau gemessen. Die UVB-Exposition von Mäusen führte zu einer Abnahme des L*-Werts, der repräsentativ für die Pigmentierung war (Abb. 5B). Die UVB-induzierten Abnahmen des L*-Werts wurden bei den mit Galanin behandelten Tieren im Vergleich zu den mit Vehikel behandelten Kontrolltieren signifikant blockiert, was die starke depigmentierende Wirksamkeit von Galanin zeigte ( 5B ). Der ΔL*-Wert zeigte auch die Potenz von Galangin während der Versuchszeiträume an (Fig. 5C). Zusätzlich zeigten die mit bloßem Auge am Tag 14 festgestellten Hautfarben auch die antimelanogene Potenz von Galangin (Fig. 5D). Die Fontana-Mas-Son-Färbung, die Melanin hervorhebt, bestätigte die Wirkung von Galangin. Die Hautproben von UVB-bestrahlten Tieren zeigten erhöhte Melaninflecken (Fig. 5E). In Übereinstimmung mit den numerischen Daten aus der Spektrophotometrie zeigten mit Galanin behandelte Tiere eine Abnahme der gefärbten Melaninflecken im Vergleich zu den UVB-bestrahlten Kontrolltieren (Fig. 5E). Zusammengenommen deuteten diese Daten darauf hinGalaninwar im UVB-induzierten In-vivo-Melanogenesemodell ein wirksames angiogenetisches Mittel.

Abb. 2. Ergebnisse der In-Silico-Docking-Simulation zwischen Tyrosinase und den Kandidatenverbindungen

DISKUSSION

Es wurde bereits berichtet, dass Galangin verschiedene biologische Wirkungen ausübt, einschließlich Zytoprotektion. Obwohl die Anti-Tyrosinase-Aktivität von Galangin zuvor untersucht wurde, wurden die Mechanismen und die genaue Wirksamkeit in Zellkultursystemen nicht vollständig beschrieben.1,16) Daher wollten wir die Wirksamkeit und die inhibitorischen Mechanismen von Galangin untersuchen. Die inhibitorische Wirksamkeit von Galangin wurde zunächst mithilfe einer In-Silico-Docking-Simulation bewertet. Die Docking-Simulationen zeigten, dass die Bindung von Galangin an das aktive Zentrum der Tyrosinase stabiler war als die des ursprünglichen Substrats (Tyrosin) oder der Kojisäure (Positivkontrolle). Die inhibitorische Wirksamkeit und Mechanismen wurden auch unter Verwendung von Pilz-Tyrosinase bestätigt. Schließlich wurde die inhibitorische Wirksamkeit von Galangin gegen die Melanogenese in -MSH-stimulierten B16F10-Mäuse-Melanomzellen bewertet. Zusammenfassend identifizierte die vorliegende Studie Galanin als potenten Wirkstoff.

Computerbasierte Docking-Simulationen haben sich als leistungsfähiges Werkzeug zum Screening und zur Bewertung neuer pharmakologischer Wirkstoffe etabliert.17) Docking-Simulationsergebnisse liefern nicht nur die Bindungsstellen, sondern auch die Bindungsaffinität zwischen der Verbindung und dem Enzym, die erste Informationen liefert, ohne dass physikalische Untersuchungen erforderlich sind Experimente.18) Obwohl die Vorhersagen nicht immer genau sind und weitere Experimente erfordern, reduziert die Docking-Simulation die erforderlichen Materialien und Ressourcen und kann auch die biologischen experimentellen Daten unterstützen. Unsere rechnerische Docking-Simulation zeigte, dass Galangin stärker an Tyrosinase binden könnte als Tyrosin oder Kojisäure. Darüber hinaus war die Anzahl der interagierenden Reste zwischen Galangin und Tyrosinase größer im Vergleich zu Tyrosin oder Kojisäure. Die anfänglichen Docking-Daten wurden weiter verifiziert, indem ein Tyrosinase-Enzymtest verwendet wurde, der zeigte, dass der IC50 von Galangin niedriger war als der von Kojisäure; somit waren die inhibitorischen Wirkungen von Galangin auf Tyrosinase stärker als Kojisäure.

Der Hemmmechanismus von Galangin auf Tyrosinase wurde weiter unter Verwendung von Pilz-Tyrosinase untersucht. Da die Docking-Simulationsdaten darauf hindeuteten, dass Galangin an die gleiche aktive Stelle bindet, an die Tyrosinase bindet, wurde angenommen, dass Galangin ein kompetitiver Inhibitor von Tyrosinase sein könnte. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass das Galangin die Tyrosinase kompetitiv daran hinderte, ihr ursprüngliches Substrat Tyrosin zu binden, was die Ergebnisse der Docking-Simulation bestätigte. Insgesamt demonstrierten die Ergebnisse die Zuverlässigkeit der Computer-Docking-Simulation und ihr Potenzial für das Screening von Inhibitoren.

Die Wirksamkeit von Galangin wurde auch in B16F10-Mäuse-Melanomzellen bewertet. Galangin zeigte signifikante zytotoxische Wirkungen in B16F10-Zellen, wenn es in hoher Dosis verabreicht wurde. Dies stimmte mit früheren Berichten über die Antikrebsaktivität von Galangin in mehreren Krebszelllinien überein.19,20) Aufgrund der zytotoxischen Wirkungen erforderten die Experimente zur Verifizierung der antimelanogenen Wirkungen von Zellen eine sorgfältige Auswahl der Bedingungen. Der IC50-Wert von Galangin war jedoch sehr niedrig, wenn es in einem zellfreien System getestet wurde, das keine zytotoxischen Wirkungen zeigte. Tatsächlich war die Wirksamkeit von Galangin zur Hemmung der Melanogenese bei niedrigen Dosen, die keine Zytotoxizität ausübten, akzeptabel. Niedrige Dosen von Galangin reduzierten effektiv den Melaningehalt sowie die Tyrosinaseaktivität im Zellkultursystem. Zusammen mit dem zellfreien System,Galaninwurde gezeigt, dass es eine starke inhibitorische Wirkung auf Tyrosinase im Zellkultursystem hat.

Schließlich wurde die antimelanogene Wirkung von Galangin unter Verwendung einer haarlosen HRM2-Maus bewertet. Das haarlose HRM2-Mausmodell lieferte eine nützliche Basis für in-vivo-Experimente zur Melanogenese, da die Maus Melanin produzieren kann, insbesondere unter Umweltstress.21,22) In diesem Mausmodell zeigte Galangin eine signifikante antimelanogene Wirkung auf die UVB-induzierte Melaninsynthese. Unseres Wissens ist dies die erste Studie, die die antimelanogene Wirksamkeit von Galangin anhand eines In-vivo-Melanogenesemodells zeigt. Es ist wichtig, die In-vivo-Wirksamkeit festzustellen, da viele andere Melanogenese-Inhibitoren aufgrund ihrer Unfähigkeit, das Stratum corneum der Haut zu durchdringen, nicht in vivo wirken konnten. Zusammenfassend,Galaninwurde in vivo als potenter tierischer angiogenetischer Wirkstoff identifiziert. Wir kamen zu dem Schluss, dass der Tyrosinase-Hemmer Galangin einen neuartigen Wirkstoffkandidaten für die Behandlung von Hyperpigmentierungsstörungen bietet.

Cistanche-Kapseln