Bewertung des intestinalen Transports eines Phenylethanoidglycosid-reichen Extrakts aus Cistanche Deserticola über das Caco-2-Zellmonoschichtmodell

Einführung

Die Caco-2-Zelllinie, die aus menschlichen Adenokarzinomen des Dickdarms abgeleitet wurde, weist enterozytenähnliche Eigenschaften auf. Unter normalen Bedingungen differenzieren sich Caco-2-Zellen spontan von reifen Zellen und bilden intakte Monoschichten [1]. Die benachbarten Zellen haften über enge Verbindungen an der apikalen Seite der Monoschicht, die die passiv und aktiv transportierten Medikamente über die Epithelschicht unterscheiden können [2]. Aufgrund der morphologischen und biochemischen Ähnlichkeit mit normalen Enterozyten dienen Caco-2-Zellmonoschichten als gut akzeptiertes In-vitro-Modell für die Untersuchung des intestinalen Absorptionspotentials und der Transporteigenschaften von Arzneimitteln [3, 4].

Im Gegensatz zu Chemikalien handelt es sich bei Pflanzenextrakten (PE) um Gemische, deren biologische Aktivität und aktive Bestandteile oft nicht genau identifiziert sind [5]. Darüber hinaus stehen die intestinalen Transporteigenschaften von PE im Gegensatz zu den Eigenschaften seiner Bestandteile in engem Zusammenhang mit der klinischen Verwendung. Flussmessungen für eine Testprobe über eine Caco-2-Zellmonoschicht umfassen üblicherweise chemische Methoden wie HPLC, LC/MS usw. Obwohl diese Methoden leistungsstarke Werkzeuge sind, sind sie komplex, zeitaufwändig, teuer und gelegentlich erfordern eine hochentwickelte Ausrüstung. Noch wichtiger ist, dass weder eine Einzelkomponente noch eine Minderheitskomponente die PE als Ganzes widerspiegeln kann. Daher muss ein neuartiger Ansatz unabhängig von der Bestimmung der Bestandteile etabliert werden, um die Transporteigenschaften von PE zu identifizieren und zu bewerten.

Cistanche deserticola YC Ma (CD), eine holoparasitische Pflanze, ist eine gängige traditionelle chinesische Medizin, die hauptsächlich zur Behandlung von Nierenversagen, Körperschwäche und Verstopfung eingesetzt wird. Diese Anwendungen wurden offiziell im Chinesischen Arzneibuch aufgeführt [6]. Phenylethanoidglykoside (PhGs), einschließlichEchinacosid (EC), Acteosid (AC) und Isoacteosid(IS) usw. sind eine Klasse von Polyphenolverbindungen [7]. Sie gelten als einer der bedeutendstenbioaktive Bestandteile von Cistanche-Arten[8]. Pharmakologische Studien haben gezeigt, dass die Bioaktivität von PhGs vielfältig ist und antioxidative [9], ermüdungshemmende [10], hepatoprotektive [11], immunmodulatorische [12], entzündungshemmende [7, 13] und neuroprotektive Wirkungen umfasst [ 14]. Die intestinalen Transporteigenschaften von PhGs wurden jedoch nicht untersucht. In dieser Studie haben wir das untersuchtDarmpermeabilität eines PhG-reichen Extrakts (PRE) aus CDals integriertes System und die Permeabilität von drei Haupt-PhGs (AC, IS und EC) in differenzierten Caco{0}}-Zellen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass PRE hauptsächlich durch schlecht absorbierte passive Diffusion entlang eines Konzentrationsgradienten ohne Efflux transportiert wird, was die pharmakokinetische Grundlage für die klinische Anwendung von PhGs bei CD darstellt.

NATÜRLICHE CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE KRÄUTER PHGS75 % ECH 30 % WIRKUNG 12 %

Materialen und Methoden

Materialien

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>98 %) wurden von Must Biotechnology Co. (Chengdu, China) gekauft. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), fötales Rinderserum (FBS) und nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA) wurden von Gibco BRL (Grand Island, NY, USA) hergestellt. 6-well TranswellTM-Platten (Einsatzmembran-Wachstumsfläche 4,67 cm²) wurden von Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, USA) bezogen. Rattenschwanzkollagen wurde von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) erhalten. Alle Reagenzien und Chemikalien für die HPLC-Analyse waren von analytischer Qualität.

Vorbereitung von PRE von CD

Das luftgetrocknete CD-Material wurde pulverisiert und durch Perkolation mit 70 % Ethanol extrahiert. Die PhG-reiche Fraktion wurde wie zuvor beschrieben hergestellt [10] und mit wassergesättigtem n-Butylalkohol extrahiert. Die Extraktflüssigkeit wurde eingeengt und unter vermindertem Druck getrocknet. Die UV-Spektrophotometrie mit makroporösem Harz [15] ergab einen PhG-Gehalt von 78,4 %. Die Endprobe entsprach einer Rohmaterialausbeute von 1,75 %, bezogen auf das Trockengewicht. Die erhaltene Probe wurde bis zur weiteren Verwendung bei –20 Grad gelagert.

Bestimmung von AC, IS und EC mittels HPLC

Ein Shimadzu HPLC-System, das mit LC-Lösungssoftware ausgestattet ist, wurde verwendet, um den Gehalt an AC, IS und EC in PRE zu testen. Eine Umkehrphasen-Intersil C18-Säule (4,6 mm × 25 0 mm, 5 μm) wurde verwendet und bei Raumtemperatur gehalten. Die mobilen Phasen waren Acetonitril und Wasser mit 0,1 % Phosphorsäure (v/v) mit Gradientenelution (Tabelle 1) bei einer Flussrate von 1,0 ml/min. Der UV-Spektrophotometer-Detektor wurde auf 334 nm eingestellt. Um den Fluss von AC und IS genau zu bestimmen, haben wir eine neuartige HPLC-Fluoreszenzdetektionsmethode (HPLC-FLD) entwickelt. Nach einer Strukturanalyse und einem Fluoreszenzwellenlängenscan (Daten nicht gezeigt) erhielten wir die optimalen Fluoreszenzdetektionsbedingungen für AC (Beispiel: 338 nm, Em: 448 nm) und IS (Beispiel: 320 nm, Em: 434 nm).

Die HPLC-Analysemethode wurde anhand der folgenden Leistungsmerkmale validiert: Stabilität, Linearität, Empfindlichkeit, Präzision (Variabilität innerhalb und zwischen Tagen) und Genauigkeit. Die Analyten im Transportpuffer wurden 24 Stunden lang bei 25 Grad im Dunkeln gelagert und ihre Stabilität gemessen. Die Analyten waren in Gegenwart von Vitamin C (0,4 %) sehr stabil, da die relativen Standardabweichungswerte (RSD) in den Peakbereichen < 3,5 % lagen. Die lineare Regressionsgleichung, der Korrelationskoeffizient, der Linearitätsbereich, LOD und LOQ für AC, IS und EC sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die LODs (18–30 nM) und LOQs (60–100 nM) Die Werte verdeutlichen, dass die Methoden HPLC-FLD und HPLC-UV sehr empfindlich sind. Die RSD-Werte, die die Präzision der Methode ausdrücken, lagen für die Variabilität innerhalb und zwischen Tagen alle unter 2 %, was auf eine gute Präzision hinweist. Zur Auswertung der Wiederfindung wurden AC, IS und EC zum Transportpuffer hinzugefügt, um drei (hohe, mittlere und niedrige) Konzentrationsniveaus zu ergeben. Die Wiederfindungswerte der Methode für die Analyten sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Die durchschnittlichen Wiederfindungen lagen zwischen 90,0 % und 96,4 %, was auf eine gute Genauigkeit hinweist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die etablierten HPLC-Methoden hinsichtlich Linearität, Empfindlichkeit, Präzision und Genauigkeit für die Quantifizierung von AC, IS und EC im Transportpuffer zufriedenstellend sind.

NATÜRLICHER CISTANCHE TUBULOSA-EXTRAKT PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Bestimmung von PRE durch Bioassay-System

Der Bioassay (gesamte antioxidative Kapazität) basierte auf dem FRAP-Assay (eisenreduzierende/antioxidative Kraft), den wir zuvor beschrieben haben [16], und wurde hinsichtlich Linearität und Präzision (Variabilität innerhalb und zwischen Tagen) validiert. Die Linearität der Bioassay-Methode wurde anhand der Kalibrierungskurven bestimmt. Der Konzentrationsbereich der Linearität betrug 0.0625 − 40 ug/ml (y=0.0258x+0.0968, R2=0.996). Die Präzision der etablierten Bioassay-Methode wurde anhand der intra- und intertägigen Variabilität für eine Analyse von PRE (10,0 ug/ml) bestimmt. Die Wiederholbarkeit der Methode innerhalb eines Tages wurde anhand von fünf aufeinanderfolgenden Bestimmungen am selben Tag bestimmt. Die Wiederholbarkeit zwischen den Tagen wurde anhand von fünf aufeinanderfolgenden Bestimmungen an drei verschiedenen Tagen gemessen. Die RSD-Werte für die Präzision der Methode betrugen 1,014 % bzw. 4,72 % für die Variabilität innerhalb und zwischen Tagen, was auf eine gute Präzision hinweist. Somit ist die etablierte Bioassay-Methode hinsichtlich Linearität, Präzision und Genauigkeit für die Quantifizierung von PRE in einem Transportpuffer zufriedenstellend.

Zellkultur

Caco{{0}}-Zellen wurden bei 37 Grad und 95 % relativer Luftfeuchtigkeit in einer Atmosphäre mit 5 % CO2 und einem Medium bestehend aus DMEM, 10 % FBS, 1 % NEAA, 1 % L-Glutamin und Penicillin kultiviert (100 U/ml) und Streptomycin (100 ug/ml). Während des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung wurde das Medium jeden zweiten Tag gewechselt. Die Zellen wurden in 75-cm2 großen Plastikflaschen gezüchtet und alle 3–5 Tage mit 0,05 % EDTA-Trypsin geerntet. Für die Transportexperimente wurden die Zellen mit einer Dichte von 1×105 Zellen/cm2 auf mit Kollagen beschichtete Transwell-Einsätze ausgesät. Ungefähr 21 Tage nach der Aussaat wurden die Monoschichten für die Transportexperimente verwendet. Ihre Integrität wurde durch Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) über die Monoschichten mit einem mit ENDOHM-SNAP ausgestatteten EVOM (World Precision Instruments, Inc., USA) bestimmt. Die TEER-Werte der Caco-2-Zellmonoschicht mussten 500 O∙cm2 überschreiten.

Transportexperimente

Die Monoschicht wurde mit Transportpuffer (P-Puffer mit 1 0 mM HEPES, 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM Glucose, 3 mM CaCl2 und 145 mM NaCl, pH 7,4) gewaschen und dann 20 Minuten vorinkubiert bei 37 Grad. Nach dem Entfernen des Transportpuffers wurde frischer Transportpuffer mit Testproben in die apikale (AP) Kammer (1,5 ml) bei AP-zu-basolateralen (BL)-Richtungsstudien oder in die BL-Kammer (2,5 ml) bei BL-zu-AP-Richtungsstudien gegeben. Für AC-, IS- und EC-Assays mittels HPLC wurde in unterschiedlichen Zeitintervallen (30, 60, 90 und 120 Minuten) ein Aliquot (300 µl) aus jeder Aufnahmekammer entnommen. Die Aufnahmekammer wurde nach jeder Probenahme mit der gleichen Menge frisch vorgewärmtem (37 Grad) Transportpuffer aufgefüllt. Die gesammelten Proben wurden zur weiteren Verwendung bei –20 Grad gelagert. Für die PRE-Bestimmung mittels Bioassay wurden nur die Proben nach 120 Minuten entnommen. Aufgrund der Instabilität von PRE, AC, IS und EC wurden 0,4 % (w/v) Vitamin C verwendet

Zur Stabilisierung der Proben wurde zugesetzt, um den AC-, IS- und EC-Gehalt mittels HPLC zu bestimmen, und die Proben für den PRE-Bioassay wurden unmittelbar nach der Probenahme untersucht. Der Wert des scheinbaren Permeabilitätskoeffizienten (Papp oder 'Papp) jeder Probe wurde berechnet.

Datenanalyse

Die Papp-Werte in den AP-BL- oder BLAP-Richtungen von AC, IS und EC wurden auf Grundlage der folgenden Gleichung berechnet: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), Dabei ist Papp der durch HPLC bestimmte scheinbare Permeabilitätskoeffizient (cm/s). (4Q/4t) ist die Geschwindigkeit des Auftretens der Testverbindung (AC, IS oder EC) auf der Empfängerseite (μmol/s); A ist die Oberfläche des Einsatzes (cm2); C0 ist die anfängliche Konzentration der Testverbindung auf der Spenderseite (μmol/ml). Konkret wurde bei der Berechnung der Papp-Werte die Masseneinheit „ug“ anstelle von „μmol“ verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt.

Ergebnisse

Zusammensetzung von AC, IS und EC in PRE von CD

Weil AC, IS und EC als die wichtigsten bioaktiven Substanzen geltenPhGs von Cistanche-Arten[8] haben wir ihren Inhalt in PRE mittels HPLC-UV analysiert. Das repräsentative Chromatogramm ist in Abb. 1 dargestellt. Die Identifizierung dieser Bestandteile basierte auf dem Vergleich der Retentionszeiten und des UV-Spektrums mit denen authentischer Standards bei einer Wellenlänge von 334 nm. Der Gehalt an AC, IS und EC in PRE betrug 26,60 %, 1,84 % bzw. 32,83 %. Somit machen diese drei Verbindungen 61,27 % des PRE aus; Darüber hinaus deuten die obigen Ergebnisse darauf hin, dass der PhG-Gehalt in PRE 78,4 % beträgt. Daher machen AC, IS und EC etwa 80 % der PhGs in PRE aus.

NATÜRLICHES CISTANCHE TUBULOSA ZUR VERBESSERUNG DER NIERENFUNKTION PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

Gesamte antioxidative Kapazitäten von PRE, AC, IS und EC

Es wurde über Studien zur antioxidativen Aktivität von PhGs aus CD berichtet [9], und AC, IS und EC machen etwa 80 % der PhGs in PRE aus. Daher wurden die gesamten antioxidativen Kapazitäten von PRE, AC, IS und EC untersucht und unter Verwendung der FRAP-Werte (× 10–6 mmol) ausgedrückt. Wie in Abb. 2 dargestellt, betrugen die Endkonzentrationen von PRE, AC, IS und EC bei einem FRAP-Wert von 8 × 10–6 mmol 6,20 µg/ml, 3,14 µg/ml, 22,92 µg/ml und 4,89 µg /ml, was darauf hinweist, dass die gesamte antioxidative Kapazität dieser vier Proben wie folgt eingestuft wurde: AC > EC > PRE > IS. Die Bioaktivität von PRE wird auf seine Wirkstoffgruppen (AIG) zurückgeführt. Bei etwa 60 % der PRE zeigten AC und EC insgesamt eine stärkere antioxidative Aktivität als PRE und IS. Da IS (1,84 %) einen sehr geringen Anteil an PRE ausmacht, sind auch andere Komponenten, wie das schwach antioxidative IS, eindeutig in PRE aktiv. Überraschenderweise unterschied sich die gesamte antioxidative Aktivität zwischen AC und seinem Isomer IS um fast das 7-fache, was darauf hindeutet, dass nicht nur die Anzahl der phenolischen Hydroxylgruppen [9], sondern auch die Position der phenolischen Hydroxylgruppen im Molekül beeinflusst wurde antioxidative Wirkung.

Validierung der Caco-2-Monoschichten

Um das Caco-2-Zellmonoschichtsystem zu validieren, wurden die Papp-Werte von Propranolol (ein gut transportierter Marker) und Lucifer-Gelb (ein schlecht transportierter Marker) vom AP zum BL über die Caco-2-Monoschichten ermittelt bestimmt als 1,51 × 10–5 cm/s bzw. 2,8 × 10–7 cm/s, und diese Werte stimmten mit den in früheren Berichten veröffentlichten Werten überein [17, 18]. Der alkalische Phosphatase-Aktivitätstest bestätigte auch, dass die Caco-2-Zellmonoschichten qualitativ mit dem Dünndarmepithel vergleichbar waren [19].

Die Durchlässigkeit von AC, IS und EC

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), wohingegen die von schlecht absorbierten Arzneimitteln niedrig waren (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2 [20]. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion. 

Die Durchlässigkeit von PRE

Die obigen Ergebnisse zeigen, dass die gesamte antioxidative Kapazität von PRE mindestens auf 61,27 % des AIG aus PRE zurückzuführen ist. Daher haben wir den TR von PRE anhand seiner Konzentrations-Wirkungs-Kurve der gesamten antioxidativen Kapazität bewertet und die Papp-Werte berechnet, um die Transporteigenschaften von PRE widerzuspiegeln. Die 'Papp-Werte von PRE für AP!BL und BL!AP betrugen (2,16 ± 0,26) × 10–7 cm/s und (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, was darauf hinweist, dass diese Verbindung schlecht durchlässig war. Darüber hinaus war kein Efflux oder aktiver Transport erkennbar, da das Verhältnis von 'Papp BL zu AP / 'Papp AP zu BL für PRE 1,45 betrug [20]. Darüber hinaus stieg der bidirektionale TR von PRE linear zwischen etwa 300 und 900 ug/ml an (Abb. 5). Das Fehlen einer Richtungspräferenz der Ergebnisse legt nahe, dass passive Diffusion der Haupttransportmechanismus von PRE ist.

Diskussion

Im Vergleich zu hochreinen Arzneimitteln handelt es sich bei PE in der Regel um Gemische, die aus Hunderten von Bestandteilen mit sehr unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften bestehen. Daher übt PE aufgrund seines komplexen AIG [21] eine systematische, synergistische Multiziel- und Multikanalwirkung aus, was die Analyse der Transporteigenschaften von PE behindert. Um die Transporteigenschaften von PE wissenschaftlicher zu bewerten, haben einige Forscher in PE mehrere Komponenten anstelle einer einzelnen Komponente identifiziert [22–24]. Dennoch kann eine begrenzte Anzahl von Bestandteilen nicht die PE als Ganzes widerspiegeln. Es ist jedoch unmöglich, alle Komponenten in PE zu bestimmen. Wenn außerdem verschiedene Komponenten in PE völlig unterschiedliche Transporteigenschaften aufweisen, wird es schwierig sein, die ganzheitlichen Transporteigenschaften von PE zu identifizieren.

In den 1990er Jahren wurden Bioassay-Systeme zur Bewertung der TR antimikrobieller Wirkstoffe eingesetzt [25]. Bis 2005 hatten Eguchi und seine Kollegen [26] die antioxidative Aktivität von Karottenextrakt mithilfe von BL-Medien aus differenzierten Caco-2-Zellen untersucht; Dieser Ansatz ist besser geeignet, um In-vivo-Situationen abzubilden.

Basierend auf einem früheren Bericht über die Aktivität von PhGs [9] und unseren Ergebnissen (Abb. 2) kann der TR von AIG in PRE durch Bestimmung der gesamten antioxidativen Kapazität des Mediums in der Aufnahmekammer bewertet werden. Nach den Transportexperimenten stellten wir fest, dass der TR von PRE in beide Richtungen ähnlich war und dieser Transport ungesättigt war und schlecht absorbiert wurde ('Papp < ​​1,0 × 10–6 cm/s) [3], und es deutete nicht auf einen Ausfluss hin, was darauf hindeutet, dass die passive Diffusion entlang eines Konzentrationsgradienten der Haupttransportmechanismus von PRE ist (Abb. 5). Darüber hinaus stimmen die Transporteigenschaften von PRE mit denen von AC, IS und EC überein, den wirksamen Komponenten, die in PRE eine antioxidative Aktivität zeigen (Abb. 4 und Tabelle 4). Dieses Ergebnis wurde erwartet und zeigt, dass das vorliegende Bioassaysystem für die Bewertung der Transporteigenschaften von AIG in PRE in differenzierten Caco-2-Zellen geeignet und zuverlässig ist.

Im Gegensatz zum kanonischen Papp-Wert, der üblicherweise zur Darstellung des Transports einer einzelnen Verbindung verwendet wird, spiegelt der aus der TR basierend auf der Konzentrations-Wirkungs-Kurve ermittelte Papp-Wert möglicherweise nicht nur die Komponenten wider, die Monoschichten mit intakter Struktur durchdringen, sondern auch die Komponenten, die Monoschichten mit intakter Struktur durchdringen umfassen auch andere Faktoren, die mit der Zielaktivität in Zusammenhang stehen, wie z. B. die Metaboliten der Komponenten, chemisch abgebaute Produkte und sogar einige Zytokine, die von Caco-2-Zellen als Reaktion auf eine Stimulation abgesondert werden und die Zielbioaktivität beeinflussen können. Somit bestimmt der oben erwähnte Multifaktor und nicht nur die transportierten intakten Komponenten den Pappwert. Daher korreliert „Papp“ möglicherweise stärker mit In-vivo-Situationen als der kanonische Papp-Wert [26]. In dieser Studie haben wir die passiv verbreitete und schlecht absorbierte Natur von PRE anhand seines Papp-Werts geklärt. Diese Natur könnte mit der hohen Dosierung und der langen klinischen Behandlungsdauer von CD zusammenhängen [27]. Dennoch werden diese Ergebnisse Klinikern eine systematischere Orientierung bei der Anwendung von Zöliakie bieten, wenn nur die Transporteigenschaften der meisten AIG bei Zöliakie und nicht nur von PhGs identifiziert wurden.

NATÜRLICHER CISTANCHE-TUBULOSA-CISTANCHE-EXTRAKT PHGS75 % ECH 30 % WIRKUNG 12 %

Allerdings muss das ausgewählte Bioaktivitätselement ausreichend empfindlich sein, um im Medium der Aufnahmekammer nachgewiesen zu werden, was eine Herausforderung für die Einrichtung eines Bioassaysystems zur Bewertung der Transporteigenschaften von PE darstellt. Darüber hinaus sollte die Bioaktivität auch von möglichst vielen Komponenten abhängen. In unserer Studie war der Test der gesamten antioxidativen Kapazität geeigneter als mehrere andere Methoden (S1-Abb.). Aber trotzdem kann unser Assay den TR von PRE erst nach 120 Minuten nachweisen.

Insgesamt etablierte die vorliegende Studie ein neuartiges Bioassaysystem zur Bewertung der Darmpermeabilität von PRE in differenzierten Caco-2-Zellen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass eine schlecht absorbierte passive Diffusion entlang eines Konzentrationsgradienten ohne Efflux der Haupttransportmechanismus von PRE ist (Abb. 5), der die pharmakokinetische Grundlage für die klinische Anwendung von PhGs bei CD darstellt. Die Verwendung eines neuartigen Bioassay-Systems zur Bewertung des TR und zur Berechnung der Papp-Werte zur Beurteilung desDarmtransporteigenschaftvon AIG in PEs ist machbar. Bei entsprechender Bioaktivität kann dieser Ansatz auch für andere PE geeignet sein.