Experimentelle Untersuchung der Anti-Sport-Müdigkeitswirkungsmechanismen von Cistanche Deserticola

Kontakt : emily.li@wecistanche.com

YANG Hong-xin1, YANG Yong2, YAN Xiao-hong1 (1. Abteilung für Zytobiologie, Inner Mongolia Medical College, Hohhot 010059, China; 2. Abteilung für Onkologie, Krankenhaus der Autonomen Region Innere Mongolei, Huhhot 010017, China)

Abstrakt:Ziel Untersuchung der Wirkung vonCistanche Deserticolaauf Laktatdehydrogenase (LDH)-Isoenzym, Glykogen und Stickoxid-Synthase 3 (NOS3) der Leber in Mäusen beim Schwimmen belasten und relevante molekulare Mechanismen der Anti-Sport-Müdigkeit untersuchen. Methoden Die Mäuse wurden in die normale Kontrollgruppe, die Sportkontrollgruppe und dieCistanche Deserticolaexperimentelle Gruppe. Jede Maus der oralen Kontrollgruppe und der Sportkontrollgruppe erhielt Kochsalzlösung 0,2 ml pro Tag. Jeder Maus der Cistanche-Deserticola-Versuchsgruppe wurde ein Wassersud gegebenCistanche Deserticola00,2 ml (3 g/kg) pro Tag. Die Verabreichungen dauerten 15 Tage. Das Belastungsschwimmen für 90 Minuten wurde an den Mäusen der Sportkontrollgruppe und der Cistanche-Deserticola-Versuchsgruppe 1 Stunde nach der letzten Verabreichung durchgeführt. Die Lebern der Mäuse wurden nach 10 Stunden Schwimmen entfernt. Ein Teil der Leber wurde in der neutralen Formalinflüssigkeit fixiert, um die Paraffinschnitte herzustellen, und der andere wurde zur Messung der LDH-Aktivität verwendet. Die Struktur der Leber wurde durch Anfärben von HE beobachtet und das Leberglykogen wurde durch Anfärben von Glykogen gemessen. NOS3 wurde durch das SP-immunhistochemische Verfahren untersucht. Ergebnisse Die Leberstruktur der sportlichen Kontrollgruppe war ernsthaft geschädigt, die Isoenzyme von LDH4 und LDH5 waren höher, das Leberglykogen war schlecht, NOS3 war im Vergleich zur normalen Kontrollgruppe erniedrigt (P<0.05). the="" liver="" structure="" of="" the="" cistanche="" deserticola="" experimental="" group="" was="" good,="" ldh5="" isoenzyme="" was="" low,="" the="" glycogen="" was="" rich="" and="" expression="" of="" nos3="" was="" upregulated="" compared="" with="" the="" sport="" control="" group="" (p=""><0.05). conclusions="">Cistanche Deserticolakönnte LDH5 verringern, die Leber der beim Schwimmen belastenden Mäuse schützen und die Glykogenakkumulation beschleunigen, indem die Expression von NOS3 erhöht wird, um die Leber zu schützen und die Wiederherstellung der körperlichen Leistungsfähigkeit zu verbessern.

Schlüsselwörter:Cistanche Deserticola;Leberglykogen;Stickstoffoxid-Synthase 3;Mäuse.

Cistanche-Bild

Cistanche,auch bekannt als Dayun, ist ein zweijähriges parasitäres Kraut der Ledanaceae. Es hat trockene, fleischige Stiele mit Schuppen. Es wird hauptsächlich auf sandigen Böden und halbsandigen Wiesen in der Inneren Mongolei, Gansu, Xinjiang, Qinghai und anderen Orten produziert. Innere MongoleiCistanchehat die beste Qualität unter allen Anbaugebieten.Cistancheist süß, salzig und warm in der Natur. Es betritt dieNierenund Dickdarmmeridian. Seine Hauptfunktionen bestehen darin, die Nieren zu nähren und das Yang zu stärken, die Essenz und das Blut zu nähren und den Darm mit Feuchtigkeit zu versorgen. Es wird häufig zur Behandlung von Impotenz, Unfruchtbarkeit, schwacher Taille und Knien, Muskel- und Knochenschwäche, trockenem Darm und Verstopfung eingesetzt. Diese Studie zielt darauf ab, die Auswirkungen von zu beobachtenCistanchean lasttragenden schwimmenden Mäusen Leberlaktatdehydrogenase (LDH), Leberglykogen und Stickoxidsynthase 3 (NOS3) durch einen lasttragenden Schwimmtest an Mäusen und um ihren Schutzmechanismus an der Leber zu untersuchen. Daher kann es eine theoretische Grundlage für die eingehende Erforschung, Entwicklung und Nutzung von bietenCistanche in Sportgesundheitskost.

1 Experimentelle Materialien

1.1 Tiere

3 0 männliche Kunming-Ratten, sauber, Körpergewicht (20 ± 0,5) g, bereitgestellt vom Animal Center der Inner Mongolia University.

1.2 Medikamente

Cistanche DeserticolaYCMa, hergestellt in Ejina Banner, Innere Mongolei, und wurde identifiziert. Nach dem Original-Arzneimaterial: Wasser=100 g: 400 ml, zuerst 30 min einweichen, erhitzen und kochen und dann 30 min auf warmem Feuer abkochen. Gießen Sie das flüssige Arzneimittel aus und kochen Sie es im Verhältnis von 100 g: 200 ml erneut aus. Die beiden Abkochungen wurden zusammengemischt und mit zwei Lagen Gaze filtriert und dann auf das Äquivalent von 1 g des ursprünglichen medizinischen Materials pro Milliliter Wasserabkochungs-Stammlösung konzentriert, die in einem Kühlschrank bei 4 Grad gelagert wurde.

1.3 Reagenzien und Instrumente

Polyklonaler NOS3-Antikörper wurde von Wuhan Boster Bioengineering Co., Ltd. erworben. Das SP-Kit wurde von Fujian Maixin Reagent Company erworben. Das Laktatdehydrogenase-Isoenzym-Kit wurde von der Inner Mongolia Tongri Reagent Company (ausschließliches Eigentum von Nissan) bezogen. Nanjing JD-80 Farbbildanalysator. Amerikanisches UVP-Gelbildanalysesystem.

2 Experimentelle Methode

2.1 Gruppierung und Dosierung

Kunming-Mäuse wurden zufällig in eine normale Kontrollgruppe, eine Übungskontrollgruppe undCistancheexperimentelle Gruppe, mit 10 Mäusen in jeder Gruppe. Die normale Kontrollgruppe und die Übungskontrollgruppe erhielten einmal am Tag normale Kochsalzlösung, 0,2 ml/Zeit; dasCistancheVersuchsgruppe gegebenZistancheAbkochung (nehmen Sie 3 ml der ursprünglichen Wasserabkochung und fügen Sie Wasser zu 10 ml hinzu). Einmal täglich, 0,2 ml/Zeit, Tagesdosis beträgt 3 g/kg und 15 Tage hintereinander. Eine Stunde nach der letzten Dosierung trieben die Mäuse in der Kontrollgruppe und derCistancheDie Versuchsgruppe wurde mit einem 1-g-Bleigewicht an ihren Schwänzen belastet und sie wurden in ein Becken mit einer Höhe von 5 0 cm, einer Länge von 50 cm und einer Breite von 35 cm gesetzt, um bei einer Temperatur von (30 ± 0,5) Grad zu schwimmen , Beobachten Sie die Mäuse ständig, wenn sie aufhören zu schwimmen, verwenden Sie einen Holzstab, um ihre Bewegung für 90 Minuten zu stimulieren. Essen Sie nach dem Training eine normale Diät, ruhen Sie sich 10 Stunden lang aus und töten Sie die Mäuse dann mit Mäusen der normalen Kontrollgruppe. Nehmen Sie die Leber heraus, fixieren Sie ein Teil mit 10 Prozent neutralem Formaldehyd und machen Sie es nach der Dehydrierung, Transparenz, Wachsimmersion und Einbettung 4 µm dick. Verwenden Sie die HE-Färbemethode, um die Lebergewebestruktur jeder Gruppe zu beobachten. Der andere Teil wurde mit normaler Kochsalzlösung gewaschen und bei -20 Grad gefroren gelagert und während der Messung bei Raumtemperatur aufgetaut. Mit Filterpapier trocken tränken und wiegen, dann Leberhomogenat mit physiologischer Kochsalzlösung herstellen, 15 min bei 3 500 U/min zentrifugieren. Nehmen Sie den Überstand und messen Sie die Laktatdehydrogenase-Isoenzymaktivität durch Elektrophorese.

2.2 Bestimmung der Laktatdehydrogenase-Aktivität

Mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese werden die Isoenzyme von LDH nach ihren elektrophoretischen Mobilitätsunterschieden aufgetrennt. Die Trenngelkonzentration der Probe beträgt 7 Prozent, pH 8,9, und die Konzentration des konzentrierten Gels beträgt 4 Prozent, pH 6,8. 10 µL der Probe werden mit 1 Tropfen Glycerin und Bromphenolblau-Indikator gemischt. Der Elektrodenpuffer ist Tris-Glycin (pH 8,7), beginnen Sie mit der Stabilisierung der Spannung bei 100-150 V, fügen Sie nach 30 min zu 200-250 V hinzu und Elektrophorese für 4 h. Nach der Elektrophorese wurde es mit dem Lactate Dehydrogenase Isoenzyme Kit gefärbt und 30 min lang bei 37 Grad gefärbt, wobei eine blaue Lactatdehydrogenase-Isoenzymbande gezeigt wurde, dann mit Wasser gespült und mit Eisessig fixiert. Verwenden Sie schließlich das UVP-Gelbildanalysesystem für die Datenanalyse.

2.3 Glykogenfärbung

4 µm dicke Serienschnitte werden routinemäßig mit Wasser entparaffiniert. 15 Minuten lang bei 37 Grad in 1-prozentige Periodsäurelösung geben. mit fließendem Wasser gespült. 60 min in Schiff-Lösung geben. mit fließendem Wasser gespült, mit Gradienten-Ethanol, transparentem Xylol dehydriert und mit neutralem Gummi fixiert. Beobachten Sie dann die Färbeergebnisse unter dem Mikroskop.

2.4 Immunhistochemische Färbung

Die Schnitte werden routinemäßig zu Wasser entparaffiniert und das Antigen wird mit Citratpuffer-Mikrowelle repariert. Mit Lösung A 10 Minuten einwirken lassen, um endogene Peroxidase zu entfernen, und mit Lösung B (verdünntes Ziegenserum) 10 Minuten blockieren. Fügen Sie den primären Antikörper in einer befeuchteten Box bei 4 Grad über Nacht hinzu und waschen Sie mit pH 7,4 PBS-Lösung für 5 min × 3 mal am zweiten Tag. Dann Biotin-markierte C-Lösung (Sekundärantikörper-Arbeitslösung) zugeben und 10 min inkubieren, 5 min x 3 mal mit PBS-Lösung waschen. Zugabe von Meerrettichperoxidase-markierter D-Lösung und Inkubation für 10 min, Waschen mit PBS-Lösung für 5 min × 3 mal. Schließlich wurde es in DAB-Lösung für 5 min entwickelt, mit Leitungswasser gewaschen, mit HE gegengefärbt, mit Gradienten-Ethanol dehydriert, mit Xylol transparent und mit neutralem Gummi fixiert. Beobachten Sie unter einem Lichtmikroskop, nachdem Sie die Folie montiert haben. In jeder Versuchsreihe wurde anstelle des primären Antikörpers phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) als Negativkontrolle verwendet.

2.5 Analyse der Stickoxid-Synthase 3-Expression

Vorläufige Beobachtung durch visuelle halbquantitative Methode unter dem Lichtmikroskop, NOS3-positives Produkt ist dunkelbraun oder braun. Das positive Produkt befindet sich im Zytoplasma von Hepatozyten oder Endothelzellen zwischen Hepatozyten, und der blaue Hintergrund ist negativ. Verwenden Sie dann das Farbbildanalysesystem, um den Grauwert des positiven Reaktanten zu messen. Unter einem 40x-Objektiv werden die Parameter von 4 Gesichtsfeldern zufällig für jeden Film gemessen und der Mittelwert genommen. Dieser Parameter wird verwendet, um die Änderung der NOS3-Färbungsintensität widerzuspiegeln.

2.6 Statistische Methoden

Alle Daten werden als x-±s ausgedrückt, und SPSS11.0 statistisches Softwarepaket wird für den t-Test verwendet, und P<0.05 is="" considered="" as="" significant="">

3. Ergebnisse

3.1 Beobachtung der Gewebestruktur unter dem Lichtmikroskop

Die Struktur der Leberläppchen in der normalen Gruppe ist klar, die Zellstränge sind ordentlich angeordnet, die Lebersinusoide sind normal, die Leberzellen haben keine offensichtlichen Läsionen und die Kernstruktur ist klar. Die normale Gewebestruktur der Übungskontrollgruppe verschwand, die Läppchengrenzen waren unklar und der Zellstrang war gestört, die meisten Lebersinusoide verschwanden und eine ausgedehnte vakuoläre Degeneration von Hepatozyten manifestierte sich durch ein erhöhtes Zellvolumen. Das Zytoplasma ist locker, leicht gefärbt, sogar klar und transparent, und einige Leberzellen zeigen eine typische Ballonveränderung mit einer geringen Menge an fokaler oder punktförmiger Nekrose. Die Leberzellen derCistancheexperimentelle Gruppe waren leicht trüb, aber sie wurden regelmäßig angeordnet. Es gab keine offensichtlichen Vakuolen und Lockerheit in den Zellen, die Zellstränge waren sauber angeordnet und die Zellkernstruktur war klar.

3.2 Auswirkungen auf die Aktivität von Leber-Laktat-Dehydrogenase-Isoenzymen bei Mäusen unter Belastungsbelastung (siehe Tabelle 1)

3.3 Beobachtung der Glykogenfärbung der Leber unter dem optischen Mikroskop

Obwohl der Glykogengehalt in der normalen Kontrollgruppe nicht hoch ist, gibt es Glykogen in jeder Leberzelle, die Verteilung ist gleichmäßig und es gibt kein Vakuolenphänomen. Die Trainingskontrollgruppe hatte weniger Glykogen, das in den Leberzellen verstreut war, und in einigen Bereichen traten Vakuolen auf; Die Cistanche-Versuchsgruppe war reich an Glykogen, sammelte aber viel auf einer Seite der Zelle.

3.4 Beobachtung der Expression von Stickoxid-Synthase 3 durch optisches Mikroskop und quantitative Bildanalyse

Es gibt eine starke positive Expression im Zytoplasma von Hepatozyten in der normalen Kontrollgruppe, die diffus verteilt ist, insbesondere in zweikernigen Zellen, und eine positive Expression in Endothelzellen. Die Expression im Zytoplasma von Hepatozyten und Endothelzellen in der Belastungskontrollgruppe war abgeschwächt.CistancheDie experimentelle Gruppe hatte eine positive Expression im Zytoplasma von Hepatozyten und eine starke positive Expression in Endothelzellen. Die Analyseergebnisse des Farbbildanalysators sind in Tabelle 2 gezeigt.

4. Diskussion

Die Bewegung des menschlichen Körpers benötigt Energie, und der Körper benötigt auch Energie für den Stoffwechsel. Der Zellstoffwechsel verwendet direkt Energie aus dem Abbau von Adenosintriphosphat (ATP), und die für die Synthese von ATP erforderliche Energie wird letztendlich hauptsächlich durch den Abbau von Zucker bereitgestellt . Studien haben gezeigt, dass der Körper nach anstrengendem Training eine große Menge H + , freie Radikale, Milchsäure und andere Substanzen produziert, die den normalen Zellstoffwechsel beeinträchtigen. Gleichzeitig führt der Glukosemangel in den Zellen zu Belastungsermüdung und Zellschäden. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Schädigung der Struktur des Lebergewebes nach viel Bewegung sehr schwerwiegend ist und auch den Zellanabolismus beeinflusst, wie z. B. die Verringerung der Glykogensynthese in der Leber. Es kann beobachtet werden, dass Mäuse, die Cistanche einnehmen, den Leberschaden nach viel Bewegung reduzieren, hauptsächlich aufgrund der Verringerung von LDH5, und der Glykogengehalt der Leber ist signifikant höher als der der Kontrollgruppe, was darauf hindeutetCistanchekann einen Leberschutz erreichen und eine normale Physiologie aufrechterhalten, indem es die LDH5-Funktion reduziert. Aus den Ergebnissen der Glykogenfärbung wird der Glykogengehalt derCistancheVersuchsgruppe ist höher als die der normalen Kontrollgruppe. TutCistancheGlykogenreserven der Leber vor dem Training erhöhen oder die Glykogensynthese unter Stress nach dem Training beschleunigen? Es kann keine Schlussfolgerung gezogen werden, da es keine Kontrollgruppe gibt, die nicht trainiertCistancheim Versuch. Es muss im nächsten Schritt noch bestätigt werden, aber die schützende Wirkung von Cistanche auf die Leber und die Förderung der Glykogensynthese nach viel Bewegung sind offensichtlich.

NO ist eine niedermolekulare Substanz, die in den letzten Jahren von der Sportgemeinschaft hoch geschätzt wurde. NOS ist der wichtigste geschwindigkeitsbegrenzende Faktor für die NO-Produktion. Es wurde bestätigt, dass NOS 3 Arten von Isoenzymen enthält. NOS1 wird als neuronale Stickoxidsynthase bezeichnet. Es kommt in neuronalen Zellen, Skelettmuskelzellen usw. vor und ist hauptsächlich an der Neuroentwicklung, Neurosekretion, Lern- und Gedächtnisprozessen beteiligt. NOS2 ist eine induzierbare Stickoxidsynthase, die hauptsächlich in glatten Muskelzellen, Makrophagen und Lymphozyten vorkommt. Sobald dieses Enzym induziert ist, kann es NO synthetisieren, bis das Substrat erschöpft ist oder die Zelle stirbt. Es wird derzeit angenommen, dass es an Zellschäden beteiligt ist; NOS3 ist eine endotheliale Stickoxidsynthase, die hauptsächlich in Endothelzellen und Hepatozyten verbreitet ist. Das produzierte NO ist hauptsächlich an physiologischen Funktionen beteiligt. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Expression von NOS3 in Endothelzellen und Hepatozyten nach viel Bewegung geschwächt und das resultierende NO reduziert wird, sodass Blutgefäße nicht effektiv erweitert werden können, die Durchblutung verringert ist und die Rohstoffe für Synthetisches Glykogen kann nicht zu den Leberzellen transportiert werden, sodass die Glykogensynthese reduziert wird.

Cistanche Anti-Ermüdungsfunktion

Cistanchekann die Expression von NOS3 in Endothelzellen und Leberzellen hochregulieren. Erweitern Sie reaktiv die Blutgefäße. Erhöhen Sie die Durchblutung, beschleunigen Sie die Fähigkeit, Rohstoffe für die Glykogensynthese zu transportieren. Beschleunigen Sie die Glykogensynthese und halten Sie den Körper auf einem normalen physiologischen Stoffwechselniveau. Daher kann die Reduzierung von LDH5 zum Schutz der Leber und die Hochregulierung der NOS3-Expression zur Förderung der Milchsäure-Glukoneogenese ein wichtiger Mechanismus für seinCistanchezum Schutz der Leber und zur Förderung der körperlichen Erholung. Diese Forschung liefert wissenschaftlich experimentelle Grundlagen für die Weiterentwicklung und Nutzung vonCistancheim Bereich der Sportmedizin, und legt auch den Grundstein für die Entwicklung und Reinigung vonCistanches WirkungSubstanzen.

Artikel aus: „Experimental Study of Anti-Sports Fatigue Effect Mechanisms of Cistanche Deserticola“ von YANG Hong-xin1 usw.

-----Chinese Journal of Information on TCM Apr.2008 Vol.15 No.4