Expressionsmuster von -Tubulin, Inversin und seinem zerzausten Ziel-1 und Morphologie von primären Zilien bei normaler menschlicher Nierenentwicklung und -krankheiten

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrakt:Die räumlich-zeitliche Expression von -Tubulin-, Inversions- und zerzausten -1 (DVL-1)-Proteinen, die mit dem Wnt-Signalweg assoziiert sind, und die primäre Zilienmorphologie wurden in der Entwicklung analysiertNieren(14.–38. Entwicklungswoche), gesunder postnataler (1,5- und 7- Jahre alter) und pathologisch veränderter MenschNieren,einschließlich multizystischer DysplasieNieren(MCDK), fokale segmentale Glomerulosklerose (FSGS) und nephrotisches Syndrom vom finnischen Typ (CNF). Die Analyse wurde durch doppelte Immunfluoreszenz, Elektronenmikroskopie, semiquantitative und statistische Methoden durchgeführt. Eine zytoplasmatische Koexpression von -Tubulin, Inversion und DVL-1 wurde in den proximalen gewundenen Tubuli (pct), den distalen gewundenen Tubuli (dct) und den Glomeruli (g) der analysierten Gewebe beobachtet. WährendNiereEntwicklung nahm die Gesamtexpression von -Tubulin, Inversion und DVL-1 ab, während sie in der postnatalen Phase leicht zunahm. Die höchsten Ausdrücke von - Tubulin und Inversion charakterisierten dct und g, während hohes DVL -1 pct charakterisierte. -Tubulin, Inversion und DVL-1-Expressionsmuster in MCDK, FSGS und CNFNierendeutlich von der gesunden Kontrolle ab. Im Vergleich zu gesundNieren, pathologisch verändertNierenhatte dysmorphe primäre Zilien. Unterschiedliche Expressionsdynamik von -Tubulin, Inversion und DVL-1 währendNiereDie Entwicklung könnte darauf hindeuten, dass der Wechsel zwischen der kanonischen und der nicht-kanonischen Wnt-Signalgebung für die Normalität wesentlich istNiereMorphogenese. Im Gegensatz dazu ist ihr gestörter Ausdruck pathologischNierenkann mit abnormen primären Zilien assoziiert sein, was zu einer chronischen Erkrankung führtNierenerkrankungen.

Schlüsselwörter:menschliche Nierenentwicklung; -Tubulin; inversin; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; Niere, Niere

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENERKRANKUNGEN VERBESSERN

Einführung 

Die Entwicklung des definitiven oder metanephrischenNierenbeginnt in der fünften Schwangerschaftswoche (SW), die sich dann kontinuierlich zu den Dauernieren ausdifferenziert [1,2]. Die Signalwechselwirkungen zwischen dem metanephrischen Mesenchym und der Ureterknospe sorgen für die richtige FunktionNiereEntwicklung während der Nephrogenese. Kurz gesagt, die Ureterknospe induziert im metanephrischen Mesenchym einen Übergang von Mesenchym zu Epithel (MET), der kondensiert und sich bildetNieren-Bläschen, gefolgt von kommaförmigen und S-förmigen Körpern und schließlich zur Bildung von Glomeruli [3]. Im Gegenzug bewirkt das Mesenchym eine weitere Verzweigung der Ureterknospe. Die metanephrischen Nieren werden in der 11. Woche der menschlichen Entwicklung zu funktionellen Ausscheidungseinheiten. Die Nephrogenese ist jedoch innerhalb der 34. bis 36. Woche der fötalen Entwicklung abgeschlossen, wenn mehrere Verzweigungsereignisse abgeschlossen sind, aber der weitere Differenzierungsprozess der Nieren bis in die postnatale Phase fortgesetzt wird [4,5]. Störungen dieser komplexen Wechselwirkungen führen zu verschiedenen angeborenen Anomalien der Niere und der Harnwege (CAKUT), einschließlich Dysplasie, polyzystischer Nierenerkrankung, multizystischer DysplasieNierenerkrankung(MCDK), was folglich zu einer chronischen führtNierenerkrankung(CNI) [6].

In dieser Studie konzentrierten wir uns auf das Aussehen der primären Zilien und den Wnt-Signalweg, der eine wichtige Rolle während der normalen Nephrogenese und bei der Nephrogenese spieltNiereReparaturprozess, nach akuten oder chronischenNierenerkrankung[7]. Die Existenz von primären Zilien während der Nephrogenese und die große Anzahl von Entwicklungs-NiereDefekte, die bei Patienten mit Ziliarerkrankung auftreten, weisen darauf hin, dass eine echte primäre Zilienfunktion für eine normale Funktion notwendig istNiereOrganogenese [8,9]. Das primäre Cilium ist eine auf Mikrotubuli basierende Organelle, die für die Gewebehomöostase wichtig ist, wobei -Tubulin die grundlegende Komponente ist [10]. Der Verlust der -Tubulin-Acetylierung in immortalisierten Zellen löst den Übergang vom Epithel zum Mesenchym (EMT) aus, was impliziert, dass acetyliertes -Tubulin wichtig für die Stabilisierung von Mikrotubuli ist [11]. Während der menschlichen Entwicklung ermöglicht der primäre Zilien-vermittelte Wnt-Weg die Zellproliferation, Differenzierung und Gewebemorphogenese [12]. Eine beträchtliche Anzahl von Kindern mit eingeschränkter primärer Zilienfunktion und gestörtem Wnt-Signalweg entwickelt CNE, sofern angeborenNieren-Erkrankungen sind für fast die Hälfte der Fälle verantwortlich [13]. Die häufigste angeborene zystische Erkrankung bei Kindern ist die multizystische DysplasieNierenerkrankung(MCDK) [14]. Mehrere Zysten, die nicht kommunizieren [15] und nicht normal sindNieren-Parenchym sind charakteristische mikroskopische Befunde für MCDK. Die fokale segmentale Glomerulosklerose (FSGS) ist eine der häufigsten glomerulären Erkrankungen, die zum Endstadium führenNierenerkrankung[16]. Am Anfang ist FSGS charakteristisch dafür, dass es fokal ist und nur eine Minderheit der Glomeruli betrifft, und segmental ist und nur Veränderungen in einem Segment des glomerulären Kreises beinhaltet [17]. Das kongenitale nephrotische Syndrom vom finnischen Typ (CNF) ist eine seltene autosomal-rezessiv vererbte ErkrankungNierenerkrankungdargestellt durch einen pränatalen Ausbruch von umfangreichem Proteinverlust [18], verbunden mit einer Zystogenese der proximalen Tubuli [19]. Viele Formen primärer glomerulärer Erkrankungen entwickeln eine Proteinurie als Folge der geschädigten glomerulären Filtrationsbarriere [20]. Eine beträchtliche Anzahl von Studien impliziert, dass Verletzungen und Funktionsstörungen der Podozyten eine intrinsische Rolle bei der Pathogenese der CKD-Proteinurie spielen [21]. Die Studie von Vukojevic et al. zeigt eine erhöhte Anzahl bewimperter und schlecht differenzierter Podozyten bei CNF [22]. Frühere Studien zeigten, dass der Wnt/-catenin-Signalweg eine grundlegende Rolle bei der Moderation von Podozyten-Dysfunktion mit Proteinurie spielt [23]. Es gibt zwei Haupt-Wnt-Signalwege, einen bekannt als kanonisch -catenin-abhängig und einen anderen nicht-kanonisch, -catenin-unabhängig. Während der MausNiereEntwicklung ist die kanonische Wnt-Signalgebung an den Ureterknospenspitzen und in S-förmigen Körpern aktiv [24]. Darüber hinaus hat Wnt über die kanonische Signalisierung Bedeutung für die Aufrechterhaltung von MET während der Nephrogenese [25]. Die Bindung des Proteinkomplexes, der Dvl enthält, an den Membranrezeptor ist nämlich für die Aktivierung des Wnt-Signalwegs zwingend erforderlich, während die Deaktivierung der Schlüsselkomponenten dieses Signalwegs aufgrund des Fehlens der nephrogenen Zone in der zu früher perinataler Sterblichkeit führtNiere[25]. 

Als ein Protein, das als molekularer Schalter zwischen kanonischen und nicht-kanonischen Wnt-Signalwegen entscheidend ist, wurde die Inversion gefunden [26]. Obwohl Interaktionen verschiedener Proteine ​​mit Inversion nachgewiesen wurden, ist ihre genaue Funktion noch nicht vollständig geklärt. In demNieren-Epithelzellen befindet sich die Inversion in den primären Zilien und wirkt als Ziliarprotein [27]. Darüber hinaus bildet die Inversion in Kulturen von Tubulin einen stetigen KomplexNieren-Zellen, und sie kolokalisieren in vivo [27,28]. Die Inversion scheint eine wesentliche Rolle bei der frühen Morphogenese des pronephrischen Systems und der Bestimmung der Links-Rechts-Symmetrie während der Entwicklung zu spielen [29,30]. Ein signifikantes Ereignis für sowohl kanonische als auch nicht-kanonische Wnt-Signalwege bei der Rekrutierung des zytoplasmatischen Dvl an die Zellmembran. Da frühere Befunde zeigten, dass Inversion und Dvl in den Nierenepithelzellen kolokalisieren, kann spekuliert werden, dass Inversion auch eine Rolle bei der nichtkanonischen Signalübertragung spielen könnte. Eine durch Inversion vermittelte Fehlregulation des Wnt-Signals löst eine aberrante Proliferation in den Tubuli aus [31]. Genetische Tests ergaben eine DVL-1-Mutation bei Patienten mit autosomal-dominantem Robinow-Syndrom, die bei einigen Patienten heterogene Störungen im Zusammenhang mit urogenitalen undNieren-Anomalien [32].

CISTANCHE WIRD DIE NIEREN-/RENALE DIALYSE VERBESSERN

Das entwicklungsbedingte Expressionsmuster von -Tubulin, Inversion und DVL-1 wurde in verschiedenen Tiermodellen untersucht. So wurde ihre Expression im Pronephros von Xenopus laevis durch Intravitalmikroskopie bestätigt [31], während sie in Zelllinien gefunden wurden, die von murinen proximalen Tubuluszellen abgeleitet wurden, indem sie konfokale Mikroskopie und Massenspektrometrie verwendeten [33]. Darüber hinaus zeigten Lichtmikroskopie und doppelte Immunfluoreszenz ihre Anwesenheit in Schnitten von MäusenNieren[34]. Studien an Inversions-Knockout-Mäusen berichteten von vergrößerten, diffusen Zysten imNieren-Medulla und Kortex im Zusammenhang mit einer viszeralen Situs-Inversion [35]. Beim Menschen wurde die Mutation der Inversion mit infantiler Nephronophthise präsentiert, die zum Abbruch der Schwangerschaft führte [36]. Trotz zahlreicher Studien zuNieren--Tubulin, Inversion und DVL-1 Expressionsmuster und Funktion, nach unserem besten Wissen wurde ein Expressionsmuster dieser Proteine ​​im menschlichen fötalen und postnatalen menschlichen Gewebe noch nicht untersucht und zu einer Korrelation gebracht. Darüber hinaus wurden keine Hinweise auf die Expression von Inversion und DVL-1 in der frühen menschlichen Entwicklung gemeldet. Daher zielte diese Studie darauf ab, das räumliche und zeitliche Expressionsmuster von -Tubulin, Inversion und DVL-1 während der fötalen und postnatalen Stadien gesunder Menschen zu analysierenNieren, sowie imNiereGewebe von MCDK, FSGS und CNFNierenum eine mögliche fehlende Verbindung zwischen diesen Einheiten herzustellen. Wir schlagen nämlich vor, dass gestörte Expressionsmuster von -Tubulin-, Inversions- und DVL-1-Proteinen der zugrunde liegende Zystogeneseprozess und eine abnormale Funktion der primären Zilien sein könnten, die zu chronischen führenNierenerkrankungen. 

Ergebnisse

Die Analyse der Entwicklung und postnataleNiereGewebe wurde an deutlich differenzierten Strukturen der durchgeführtNiere:proximale gewundene Tubuli (pct), distale gewundene Tubuli (dct) und Glomeruli (g). Während der analysierten Entwicklungsstadien und postnatalNiereGewebe, -Tubulin, Inversion und DVL-1 zeigten positive Expressionsmuster, jedoch mit Unterschieden in Intensität, Verteilung und Menge. Die Analyse des PathologischenNierengewebevon MCDK, FSGS und CNF wurde bei voller Bildzählung der positiven Zellen im Vergleich zu gesunden Nierengewebekontrollen durchgeführt.

2.1. Lichtmikroskopie, Elektronenmikroskopie und Immunhistochemie (-Tubulin) von gesundem und pathologisch verändertem postnatalem menschlichem Nierengewebe

2.1.1. Gesundes postnatales Nierenlicht

Mikroskopie der postnatalenNiereGewebe zeigt gut definiertNiereStrukturen, mit einem deutlichen Unterschied zwischen Medulla und Cortex und der Bildung von pct, dct und g in der kortikalen Region. Die immunhistochemische Färbung von -Tubulin zeigt das Vorhandensein eines primären Ciliums im Zentrum der apikalen Zelloberfläche jeder tubulären Zelle und in 0.018 Prozent ± 0,00014 Prozent SD auf der Oberfläche der glomerulären Zellen. Die Elektronenmikroskopie zeigt das Vorhandensein von nur einem primären Cilium, das aus dem Basalkörper an der apikalen Zelloberfläche des Tubulus entsteht (Abbildung 1a).

2.1.2. CNF

Die meisten der analysierten g sind kleiner und gelappt (80 Prozent), während die Minderheit normal groß oder hypertroph ist (20 Prozent, n=100). Segmentale oder globale Sklerose von g wird gefunden, während pct und dct teilweise dilatiert und mit atrophischem Epithel überzogen sind. Ultrastrukturell wird ein Verlust von Mikrovilli und eine Abnahme der Zellhöhe mit Multifragmentierung der Zellkerne beobachtet. In Podozyten gehen Fußfortsätze diffus verloren. Tubuläre primäre Zilien sind desorganisiert, insbesondere in den Zysten der proximalen Tubuli, und zeigen Veränderungen in Länge und zytoplasmatischer Position (Abbildung 1b).

2.1.3. MCDK

Im Nierengewebe können sporadisch unreife und reife g gefunden werden.NiereGewebe ist mit zahlreichen ovalen Zysten gefüllt. Säulenepithelzellen bedecken die Zysten und sind von lockerem Bindegewebe umgeben. Die immunhistochemische Färbung mit -Tubulin zeigt mehrere lange und desorganisierte primäre Zilien auf der Oberfläche der Epithelzellen (Abbildung 1c).

2.1.4. FSGS

In 90 Prozent von g findet sich eine ausgedehnte segmentale Sklerose (n=100), verbunden mit interstitieller Fibrose und Zeichen einer tubulären Schädigung. Im Elektronenmikroskop findet sich die Abnahme der Höhe der Epithelzellen mit Verlust der Mikrovilli, während Endothelzellen und mesangiale Regionen eine regelmäßige Ultrastruktur aufweisen. Im Elektronenmikroskop ist das extrem lange und dislozierte (dezentralisierte) Cilium auf der Oberfläche der distalen Tubuluszelle zu beobachten (Abbildung 1e). Podozyten zeigen diffusen Verlust von Fußfortsätzen mit ausgedehntem Mikrovillusgewebe. Die immunhistochemische Färbung von a-Tubulin zeigt mehrere lange und desorganisierte primäre Zilien auf der Oberfläche der Epithelzellen (Abbildung 1c).

2.2. Immunhistochemische Färbung von 心Tubulin, Inversion und DVL-1- und statistische Analyse von sich entwickelnden und gesunden postnatalen menschlichen Nieren

In der 14., 15. und 16. Schwangerschaftswoche wird dieNiereGewebe wird mit verschiedenen Entwicklungsstadien der Nephronbildung vorgestellt: von metanephrischen Schalen,Nieren-Vesikelstadien, um S-förmige Nephrone zu befehlen und so die nephrogene Zone in der äußeren Rinde zu bilden (Abbildung 2). Die Differenzierung von pct, dct und g kann in kortikalen Regionen näher an der beobachtet werdenNiereMark. Während der 22. SSW wurden Teile des Marks und der Rinde deutlich unterscheidbar, während in der 38. SSWNiereStrukturen erscheinen als hoch differenziert und enthalten reife Formen von pct, dct und g

2.2.1. a-Tubulin

Während der Entwicklung wird a-Tubulin in allen sich entwickelnden Zellen stark exprimiertNiereStrukturen, die in erster Linie die Form der primären Zilien auf den Oberflächen der Parietalepithelzellen der Bowman-Kapsel visualisieren, g, pct und dct. InnerhalbNiereGewebe exprimieren 82–97 Prozent der pct-Zellen a-Tubulin, während die Expression in dct von 99 Prozent auf 72 Prozent in der 38. SSW abfällt (siehe Abbildung 3, Tabelle 1). Unter den verschiedenen Entwicklungsstadien findet sich die stärkste Expression von a-Tubulin im g des 16. SSWNieren, enthaltend 93 Prozent der positiven Zellen. Beim 14., 15. und 22. SSW (siehe Abbildung 3a,b, Tabelle 1) exprimieren etwa 70 Prozent der g-Zellen a-Tubulin, während die geringste Expression im 38. SSW beobachtet wird (p < 0,01)="" mit="" 34="" prozent="" der="" positiven="" zellen="" (abbildung="" 3c).="" in="" der="">NiereGewebe (1,5- Jahre und 7- Jahre altNieren), wird die stärkste Immunreaktivität gegenüber a-Tubulin auf der apikalen Zelloberfläche von pct und dct beobachtet (Abbildung 3d-f). Die a-Tubulin-Expression ist auch im perinukleären Zytoplasma des DCT und den Parietalepithelzellen der Bowman-Kapsel vorhanden. a-Tubulin färbt allesNieren-Strukturen mit einem Mittelwert von 50 Prozent positiver Zellen in pct, 94 Prozent in dct und 85 Prozent in g (Abbildung 3f). Dct färbt sich signifikant verschieden von pct (p < 0,0001).="" alle="" untersuchten="" strukturen="" färben="" sich="" positiv="" auf="" a-tubulin,="" mit="" 77="" prozent="" positiver="" zellen="" in="" pct,="" 72="" prozent="" in="" dct="" und="" 58="" prozent="" in="" g="">

Abbildung 3. Immunfluoreszenzfärbung von -Tubulin und DAPI in sich entwickelndem und postnatalem menschlichem Nierengewebe (a–e). Nieren der 14., 15./16., 38. SSW (a–c);Nierenvon 1,5-- und 7--jährigen Kindern (d,e). Eine positive Färbung von -Tubulin (Pfeile) wird in jeder Struktur im Kortex während der Entwicklungs- und postnatalen Phasen (a–e), der proximalen gewundenen Tubuli (pct), der distalen gewundenen Tubuli (dct) und der Glomeruli (g) gezeigt. Details der primären Zilien in pct (d) und dct (a–c, e) sind als Einsätze mit stärkerer Vergrößerung (weißer Kasten) dargestellt. Vergrößerung ×40, Maßstabsleiste 100 µm. Die Verteilung von -Tubulin-positiven Zellen pro Struktur über verschiedene Stadien der Entwicklung und in der postnatalen Periode ist in Diagramm (f) gezeigt. Diagramm (g) (Gesamtzahl proteinpositiver Zellen in beobachteten Strukturen) zeigt die Proteinexpression in Bezug auf die Entwicklungszeit (lineare Regression) und die Wechselbeziehung von -Tubulin zu DVL-1 während der Entwicklung und Reifung (Zweiweg-ANOVA, gefolgt von Posthoc-Test von SIDAK). Die Daten sind als Mittelwert ± SD gezeigt.

Die Verteilung von -Tubulin-positiven Zellen pro Struktur über verschiedene Entwicklungsstadien und in der postnatalen Phase ist in Grafik (f) gezeigt. Diagramm (g) (Gesamtzahl proteinpositiver Zellen in beobachteten Strukturen) zeigt die Proteinexpression in Bezug auf die Entwicklungszeit (lineare Regression) und die Wechselbeziehung von -Tubulin zu DVL-1 während der Entwicklung und Reifung (Zweiweg-ANOVA, gefolgt von Sidaks Post-Hoc-Test). Die Daten sind als Mittelwerte ± SD gezeigt.

2.2.2. Doppelte Immunofluoreszenz-Färbung auf Inversion und DVL-1- und DAPI-Kernfärbung in sich entwickelnder und gesunder postnataler Niereninversions-Expression in sich entwickelndem und postnatalem Nierengewebe

In der 14., 15. und 16. SSW zeigt die Inversion eine starke granuläre Expression in g und eine schwache granuläre Expression im Zytoplasma von pct und dct (Abbildung 4a,b), während in der 22. und 38. SSW (siehe Abbildung 4c) die starke positive Expression wird in g beobachtet (Tabelle 1). Zwischen dem 14. und 22. GW exprimieren etwa 5 0 Prozent der Zellen Version. In der 16. SSW exprimieren pct-Zellen eine Inversion in 73 Prozent der Zellen, während sie in der 38. SSW auf 29 Prozent der Zellen (p < 0,05)="" abnimmt="" (siehe="" abbildung="" 4f).="" eine="" positive="" expression="" der="" inversion="" findet="" sich="" in="" etwa="" 80–90="" prozent="" der="" dct-="" und="" g-zellen="" im="">NiereGewebe des 14. und 16. SSW, mit der niedrigsten Expression im DCT des 38. SSW (p < 0.05,="" p="">< 0,0001),="" wo="" 66="" prozent="" der="" zellen="" positiv="" waren.="" in="">Nieren, pct färbt sich stark an der apikalen Zellmembran, während dct hauptsächlich an der Basalzellmembran und im perinukleären Zytoplasma färbt (Abbildung 4d, e). In diesem Stadium fanden wir bei allen Untersuchten einen Ausdruck der InversionNieren-Strukturen, einschließlich pct, dct und g, mit einer mittleren Expression positiver Zellen von 92 Prozent für pct, 88 Prozent für dct und 90 Prozent für g (Abbildung 4f). Wir haben keinen signifikanten Unterschied in der Signalstärke der Inversions-Expression zwischen den Strukturen beobachtet. Die höchste Expression der Inversion findet sich in g, mit einem Mittelwert von 94 Prozent positiver Zellen (Abbildung 4f). Ein signifikanter Unterschied wird festgestellt, wenn man die Färbung von g (wobei 94 % der Zellen positiv färben) mit pct vergleicht, wo 58 % der Zellen positiv färben (p < 0.01)="" und="" mit="" dct,="" wo="" 49 %="" der="" zellen="" positiv="" färben="" positiv="" (p=""><0,0001, abbildung="">

DVL-1-Expression in sich entwickelndem und postnatalem Nierengewebe

Eine leichte bis starke Expression von DVL{{0}} wird im Zytoplasma von pct, dct und g in der Fetalperiode beobachtet (siehe Abbildung 4a–c, Tabelle 1). In pct exprimieren 76–86 Prozent der Zellen DVL-1 in der 14.–22. SSW, während in der 38. SSW 57 Prozent positive Zellen vorhanden sind (Abbildung 4g). Im DCT des 14. und 15. SSW exprimieren 68–70 Prozent der Zellen DVL-1, im 16. und 22. SSW sinkt die Anzahl positiver Zellen auf 42–5{{41} } Prozent, während in der 38. GW eine Expression (p < 0,001)="" in="" 19="" prozent="" der="" dct-zellen="" beobachtet="" wird.="" die="" expression="" von="" dvl-1="" steigt="" in="" g="" während="" der="" fötalen="" stadien="" an:="" in="" der="" 14.="" ssw="" beträgt="" sie="" 6="" prozent,="" während="" sie="" in="" der="" 15.,="" 16.="" und="" 22.="" ssw="" auf="" 10="" prozent="" ansteigt="" (p="">< 0,01).="" in="" der="" 38.="" ssw="" exprimieren="" 14="" prozent="" der="" g-zellen="" dvl-1="" (abbildung="" 4="" g).="" in="" der="" postnatalen="" phase="" ist="" die="" dvl-1-immunreaktivität="" im="" zytoplasma="" (tabelle="" 1)="" sowohl="" von="" pct="" als="" auch="" von="" dct="" verteilt="" (abbildung="" 4d,e).="" das="" signal="" findet="" sich="" in="" allen="" untersuchten="" strukturen,="" hauptsächlich="" aber="" im="" perinukleären="" zytoplasma.="" die="" intensität="" der="" dvl-1-expression="" ist="" signifikant="" höher="" in="" pct="" im="" vergleich="" zu="" dct="" und="" g="" (p="">< 0,01).="" 39–45 %="" der="" zellen="" in="" pct="" und="" dct="" exprimieren="" dvl-1,="" während="" in="" g="" 21 %="" der="" zellen="" positiv="" sind="" (abbildung="" 4="" g).="" wir="" fanden="" keinen="" signifikanten="" unterschied="" zwischen="" dem="" prozentsatz="" an="" immunreaktiven="" zellen="" in="">Nieren-Strukturen. Der Prozentsatz der immunreaktiven DVL-1-Zellen beträgt 34 ​​Prozent in pct, 36 Prozent in dct bzw. 27 Prozent in g (Abbildung 4g).

Abbildung 4. Doppelte Immunfluoreszenzfärbung von Inversion (grün), DVL-1 (rot) und DAPI (blau) im sich entwickelnden und postnatalen Nierengewebe (14.–38. SSW, 1.5- und {{6 }} einjähriges Nierengewebe). Positive Färbung (Pfeile) wird in jeder Struktur in allen Phasen der Entwicklung (a–c) und der postnatalen Phase (d, e) gezeigt. Zusammengeführte Mikrofone zusammen mit interessanten Strukturen im Kortex: proximale gewundene Tubuli (pct), distale gewundene Tubuli (dct) und Glomeruli (g). Die Kolokalisation von Inversion/DVL-1 (Pfeilspitze) wird in zusammengeführten Mikrofotografien gezeigt. Negative Kontrollfärbungen sind als Einschübe bei Inversion und DVL-1 (a) gezeigt. Erythrozyten sind als stark gefärbte Zellen in der Nähe von dct zu sehen. Details werden als Einschübe mit stärkerer Vergrößerung gezeigt. Vergrößerung ×40, Maßstabsleiste 100 µm. Dynamische positive Zellverteilung der Inversion und DVL-1 in Nierenstrukturen (pct, dct, g) während der Entwicklungs- und postnatalen Stadien sind in den Grafiken (f, g) gezeigt. Diagramm (h) zeigt die Proteinexpression (Gesamtzahl positiver Zellen in Strukturen) in Bezug auf die Entwicklungszeit (lineare Regression) und die Wechselbeziehung der Inversion zu DVL-1 während der Entwicklung und Reifung (Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Sidaks Post-Hoc-Test). ). Die Daten sind als Mittelwerte ± SD gezeigt.

Die Koexpression von Inversion und DVL-1 wird während der Entwicklung im Zytoplasma von Niere g, dct und pct beobachtet (siehe Abbildung 4a–c, Verschmelzung). In der postnatalen Phase charakterisiert die Co-Expression von Inversion und DVL-1 unterschiedliche Zellkompartimente von tubulären Zellen in pct und dct, während die Co-Expression in g durch die starke Prävalenz der Inversions-Expression gekennzeichnet ist (siehe Abbildung 4d, verschmelzen ). In den 7- postnatalen Nieren wird eine Koexpression von Inversion und DVL-1 in tubulären Zellen von dct und pct und in g beobachtet, wo die Inversionsexpression im Vergleich zu DVL-1 leicht überwiegt. (Abbildung 4e, zusammenführen).

2.2.3. Unterschiede in der Expression von -Tubulin, Inversion und DVL-1 zwischen verschiedenen Nierenentwicklungsstadien und postnatalen Nieren

Die Anzahl Tubulin-positiver Zellen im pct des fötalen Nierengewebes war statistisch signifikant höher im Vergleich zum Nierengewebe der 7-jährigen Kinder (13. (p < 0.0{="" {11}}1),="" 15.="" (p="">< 0.0001)="" und="" 16.="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" dct="" der="" frühen="" fetalen="" stadien="" (13.,="" 15.,="" 16.="" und="" 22.="" ssw)="" hatte="" mehr="" positive="" zellen="" im="" vergleich="" zum="" nierengewebe="" der="" 38.="" ssw="" und="" 1,5--jährigen="" kindern="" (jeweils="" p="">< 0,0001,="" abbildung="" 3f).="" beim="" vergleich="" verschiedener="" entwicklungsstadien="" fanden="" wir="" im="" vergleich="" zu="" 13.="" (p="">< 0,0001),="" 15.="" (p="">< 0,00001),="" 22.="" (p="">< 0,001)="" und="" 38.="" (p="">< 0,0001)="" ssw="" niedrigere="" inversionsexpressionsniveaus="">Nieren-Gewebe des 1,5--jährigen Kindes. In dct wurde eine statistisch signifikant niedrigere Expression der Inversion gefunden, verglichen mit Nierengewebe von 16. SSW zu 38. SSW (p < 0.0001).="" darüber="" hinaus="" wurde="" eine="" geringere="" expression="" der="" inversion="" in="" dct="" in="" nierengewebe="" von="" 7--jährigen="" kindern="" beobachtet;="" vergleich="" von="" 13.,="" 15.="" (p="">< 0,001,="" beide),="" 16.="" und="" 1,5-="" jahre="" altem="" nierengewebe="" mit="" dct="" von="" 7-="" jahre="" altem="" nierengewebe="" (jeweils="" p="">< 0,00001,="" abbildung="" 4f).="" das="" beobachtete="" signal="" der="" dvl-1-expression="" in="" den="" verschiedenen="" stadien="" zeigte,="" dass="" pct="" des="" 13.="" (p="">< 0,01),="" 15.,="" 16.="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4. Beziehung zwischen Expressionen von -Tubulin und Inversion zu DVL-1 in sich entwickelndem und postnatalem Nierengewebe

-Tubulin- und Inversionsexpressionen wurden mit der DVL-1-Expression während der Entwicklungsstadien und im postnatalen Nierengewebe verglichen. -Tubulin hatte in allen beobachteten Stadien eine statistisch höhere Expression im Vergleich zur Expression von DVL-1 (p < 0.001,="" abbildung="" 3g).="" in="" allen="" beobachteten="" stadien="" war="" die="" inversion="" im="" vergleich="" zu="" dvl-1="" stärker="" ausgeprägt="" (p="">< 0,0001,="" abbildung="" 4="">

2.2.5. Vergleich der immunhistochemischen Färbung mit -Tubulin, Version und DVL-1- und statistischer Analyse von pathologisch verändertem Nierengewebe (MCDK, CNF, FSGS) -Tubulin Der Unterschied der -Tubulin-Färbung in MCDK, FSGS und CNF war im Vergleich statistisch signifikant zu gesundem postnatalem Nierengewebe als Kontrollgruppe (jeweils p < 0.0001).="" dysplastisches="" nierengewebe="" hatte="" im="" vergleich="" zur="" kontrollgruppe="" eine="" signifikant="" höhere="" expression,="" während="" fsgs="" und="" cnf="" im="" vergleich="" zur="" gesunden="" kontrolle="" eine="" signifikant="" geringere="" expression="" von="" -tubulin="" zeigten="" (abbildung="">

Umkehrung

Die Inversion wird im Zytoplasma von desorganisierten Epithelzellen und Tubuli von MCDK exprimiert (Abbildung 5a). In CNF charakterisiert die Inversionsexpression g und dct, während sie sich in pct-Zysten weniger intensiv zeigt (Abbildung 5b). In FSGS wird die Inversion stark in g und dct exprimiert, aber weniger intensiv in pct-Zysten (Abbildung 5c). Die räumliche Expression der Inversion zeigte eine statistisch signifikant höhere Färberate in gesundem Nierengewebe (Abbildung 5g) im Vergleich zu MCDK, FSGS und CNF (jeweils p < 0="">

Abbildung 5. Doppelte Immunfluoreszenzfärbung von Inversion (grün), DVL-1 (rot) und DAPI (blau) in pathologischem Nierengewebe in MCDK (a), CNF (b) und FSGS (c): Tubuli (t) , Glomeruli (g), PCT-Zyste (c), die Höhe der PCT-Epithelzellen (*). Struktur und Zellkolokalisierung von Inversion und DVL-1 (Pfeilspitzen) sind in den zusammengeführten Abschnitten mit Details in stärker vergrößerten Einsätzen gezeigt. Negativkontrollfärbungen sind als Einschübe bei Inversion und DVL-1 (a) gezeigt. Vergrößerung ×40, Maßstabsbalken 10{{20}} µm. Beziehung von -Tubulin (d) und Inversion (e) zur DVL-1-Expression in MCDK, FSGS und CNF (Zweiweg-ANOVA, gefolgt von SIDAKs Post-Hoc-Test). Der Unterschied in der Epithelzellhöhe (f) von FSGS, CNF und MCDK pct im Vergleich zu einer gesunden Kontrolle (Einweg-ANOVA, gefolgt von Tukey's Post-Hoc-Test, n=50). Der Unterschied im Gesamtprozentsatz positiver Zellen von -Tubulin, Inversion und DVL-1 in MCDK, CNF und FSGS im Vergleich zur gesunden Kontrolle (g–i), einfache ANOVA, gefolgt von Post-Hoc-Test nach Tukey). Die Daten sind als Mittelwerte ± SD gezeigt. Signifikante Unterschiede werden durch den p-Wert angezeigt (* p < 0,05,="" **="" p="">< 0,01,="" ****="" p="">< 0,0001).="" dvl-1="" dvl-1="" wird="" nur="" in="" desorganisierten="" tubuli="" von="" mcdk="" sehr="" schwach="" exprimiert,="" während="" seine="" expression="" in="" cnf="" dct="" und="" g="" charakterisiert="" (abbildung="" 5a,b).="" in="" fsgs="" wird="" dvl-1="" als="" leichte="" reaktivität="" in="" g,="" dct="" und="" pct="" beobachtet="" (abbildung="" 5c).="" gesundes="" nierengewebe,="" das="" mit="" dvl-1="" gefärbt="" wurde,="" zeigte="" eine="" signifikant="" höhere="" färberate="" (abbildung="" 5="" h)="" im="" gegensatz="" zu="" mcdk="" und="" fsgs="" (p="">< 0,0001,="" beide),="" während="" für="" cnf="" kein="" signifikanter="" unterschied="" gefunden="">

2.2.6. Beziehung zwischen Expressionen von -Tubulin und Inversion zu DVL-1 in pathologisch verändertem Nierengewebe (MCDK, CNF, FSGS)In MCDK, FSGS und CNF ist -Tubulin signifikant stärker gefärbt als DVL-1 (p < 0.0001,="" abbildung="" 5d).="" die="" inversion="" färbte="" im="" vergleich="" zu="" dvl-1="" in="" mdck="" (p="">< 0,0001)="" und="" in="" fsgs="" (p="">< 0,01,="" abbildung="" 5e)="" signifikant="" stärker="">

2.2.7. Unterschiede in der Epithelzellhöhe proximaler gewundener Tubuli zwischen gesunder Kontrolle und pathologisch verändertem Nierengewebe (MCDK, CNF, FSGS)Die Höhe der pct-Epithelzellen (n {0}} pro Gruppe) wurde zwischen Tubuluszellen in gesundem Nierengewebe und pathologisch verändertem Nierengewebe verglichen (Abbildung 5b, c, f). Die mittlere Epithelzellhöhe in HC betrug 12,91 µm ± 1,847 µm und war im Vergleich zu CNF und FSGS signifikant höher (jeweils p < 0.0001).="" die="" mittlere="" zellhöhe="" in="" cnf="" pct="" betrug="" 9,011="" µm="" ±="" 1,453="" µm,="" während="" sie="" in="" fsgs="" 8,114="" µm="" ±="" 0,9248="" µm="" betrug.="" pct-epithelzellen="" von="" mcdk="" zeigten="" im="" vergleich="" zu="" hc="" keine="" signifikanten="" änderungen="" in="" der="" höhe="" (12,17="" &mgr;m="" ±="" 1,476="">

2.2.8. Unterschiede in der Länge der primären Zilien zwischen gesunder Kontrolle und pathologisch verändertem Nierengewebe (MCDK, CNF, FSGS)

Die primäre Zilienlänge (n= 50 pro Gruppe) wurde zwischen HC und pathologisch verändertem Nierengewebe verglichen (Abbildung 6c). Gesundes Nierengewebe und MCDK wurden mit -Tubulin gefärbt, um die Spezifität der -Tubulin-Zilienfärbung zu bestätigen (Abbildung 6a,b). In gesundem Nierengewebe war das primäre Zilium 5,065 µm ± 1,229 µm lang, während in MCDK CNF und FSGS signifikant länger waren (S<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

Diskussion

Das Ziel unserer Studie war es, eine immunhistochemische Expression von A-Tubulin, Inversion und DVL-1 im Fötus zu untersuchenNieren-Gewebe und postnatales Nierengewebe. Darüber hinaus wollten wir untersuchen, ob die Expression und das Färbemuster von a-Tubulin, Inversion und DVL-1 bei verschiedenen Nierenerkrankungen im Vergleich zur gesunden Kontrolle gestört sind. Trotz des großen Interesses der anderen Forscher an der Rolle von a-Tubulin, Inversion und DVL-1 während der Nierenentwicklung haben die meisten früheren Studien nämlich Tiere oder experimentelle In-vitro-Modelle verwendet. Soweit uns bekannt ist, ist dies die erste Studie, die die Expression und Lokalisierung von a-Tubulin zusammen mit Inversion und DVL-1 in fötalen und postnatalen menschlichen Nieren gezeigt hat und die die Expression der erwähnten Proteine ​​in der Niere untersucht hat Krankheiten wie MCDK, FSGS und CNF. Wir analysierten auch Änderungen der Zilienlänge und des Aussehens durch Licht- und Elektronenmikroskopie, da unsere frühere Studie bereits darauf hingewiesen hat, dass Zilienstörungen mit der Zystogenese bei FSGF und CNF assoziiert sein können [19].

Im kanonischen Wnt-Signalweg rekrutiert die Bindung von Wnt-Liganden an Rezeptoren Dvl [37]. Prozesse des MET und des Planarzellpolaritätsweges während der frühen Stadien der Nierenmorphogenese werden durch die Wnt-Signalgebung gesteuert. Durch die Vermittlung des Wnt-Signalwegs steuern die primären Zilien die Zellproliferation, Differenzierung und Gewebemorphogenese [12], indem sie das Zellzytoskelett und die Zellorientierung sowie die Verlängerung der Röhrenstruktur organisieren [2,38]. In unserer Studie waren -Tubulin, Inversion und DVL-1 alle in Nierenstrukturen vorhanden und nicht nur während der fötalen Nierenentwicklung kolokalisiert, sondern auch im Nierengewebe vom 1. 5- und {{9} }}jährige Kinder. Diese Befunde stimmen mit der nachgewiesenen Aktivierung des Wnt-Signalwegs bereits während der Tubulogenese überein [39]. Darüber hinaus haben unsere Ergebnisse gezeigt, dass die Expression von -Tubulin und die Inversion reziprok mit DVL-1 zusammenhängen und dass sie einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen ihren Expressionsmustern aufweisen. Dies steht in Korrelation zu experimentellen Modellen, da die Mutation der gesamten Dvl-Proteinfamilie in Mäusen zu einem fehlenden Gastrulationsprozess führt, während Mutationen, die nicht die gesamte Proteinfamilie umfassen, Defekte in der Nodal-Cilien-Platzierung zusammen mit Organdefekten zeigen [40]. . Frühere Ergebnisse legten nahe, dass die Inversion eine Rolle bei der Zellmigration in Xenopus pronephros spielt. Da dieses Segment mit der Henle-Schleife und den distalen Tubuli bei Säugetieren korreliert, könnte dies auf die Bedeutung der Inversion während der Nierenentwicklung auch beim Menschen hinweisen [41]. In Übereinstimmung mit dieser Prämisse offenbarten frühere Studien, dass eine Mutation des Inversionsgens zu einer Nephronophthise Typ 2 führen könnte, die durch eine abnormale DVL-1-Expression vermittelt wird [42]. Obwohl die Rolle des primären Ciliums bei der Regulation des Wnt-Signalwegs umstritten ist, fanden wir, dass -Tubulin mit Inversion und DVL-1 in den analysierten Nierenproben kolokalisiert. Darüber hinaus wiesen frühere Studien darauf hin, dass das primäre Cilium zusammen mit der Inversion den Abbau von Dvl reguliert, indem es den Wnt-Signalweg beeinflusst [43]. Bei menschlichen Nierenerkrankungen, die mit der Entwicklung von Zysten einhergehen, wurde eine abnormale Lokalisation und Funktion der primären Zilien beobachtet [19]. In ähnlicher Weise bestätigte die vorliegende Studie auch morphologische Veränderungen der primären Zilienbildung bei pathologischen Zuständen wie CNF, FSGS und MCDK. Frühere Ergebnisse bestätigten, dass eine Überaktivierung des kanonischen Wnt-Signalwegs nach einer Nierenschädigung zu irreversiblen strukturellen Veränderungen des Nierengewebes führt [44]. Im Gegensatz dazu wurde dem primären Cilium die Rolle des Wechsels vom kanonischen zum nichtkanonischen Wnt-Weg bei der Unterstützung zugewiesenNieren-Reparatur. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass eine Überaktivierung des kanonischen Wnt-Signalwegs in transplantiertem Nierengewebe einen positiven prädiktiven Wert für Nierenfibrose hat [45]. Wenn sich der kanonische Wnt-Weg auf Kosten des nichtkanonischen durchsetzt, stützt er die Theorie der Nierenfibrose als Ergebnis. Unsere Ergebnisse einer erniedrigten -Tubulin- und Inversions-Expression in CNF und FSGS implizieren eine Inaktivität des nicht-kanonischen Wnt-Signalwegs, insbesondere da beide Zustände dazu neigen, zum Endstadium zu führenNierenkrankheit.Es wird nämlich angenommen, dass eine normale Lokalisierung und Funktion des primären Ciliums ein Faktor bei der Aufrechterhaltung eines regulären Wnt-Wegs und daher eine Voraussetzung für eine normale Entwicklung sein könnte. Im Gegensatz dazu kann eine Verstärkung des Wnt-Signalwegs zu einer dysregulierten Zellproliferation und -differenzierung führen, die zur Karzinogenese führt [46]. Wie zuvor beschrieben, ist der kanonische Wnt-Weg für die Initiierung von MET und die Bildung des Nephrons zwingend erforderlich, während seine Störung dazu führen könnteNieren-Hypoplasie [47]. Unsere Ergebnisse unterstützen diese Idee, indem sie die niedrigste Expression von DVL-1 mit der höchsten Expression von -Tubulin in MCDK im Vergleich zur gesunden Kontrolle zeigen. Diese Ergebnisse können auf die niedrigste Aktivierung des kanonischen Wnt-Signalwegs hindeuten, was eine zugrunde liegende Ursache für das Fehlen der Nephronbildung sein könnte. Im Gegensatz dazu könnte die höchste -Tubulin-Expression mit der niedrigsten DVL-1-Expression die Befunde multipler Zysten erklären, da es keine organisierte Elongation und Zellpolarisation gibt, die durch den nicht-kanonischen Wnt-Weg geleitet wird. Frühere Studien hatten auch gezeigt, dass die Inversion den kanonischen Wnt-Signalweg hemmt, indem sie den Abbau von Dvl anvisiert [26]. Es wurde festgestellt, dass dieser Schritt in ihrer Interaktion notwendig ist, um die kanonische Wnt-Signalgebung bei der Aufrechterhaltung der normalen tubulären Verlängerung und Positionierung zu hemmen. Die Inversionsmutation führt zu einer Hochregulierung der kanonischen Wnt-Signalgebung, die anschließend eine abnormale Proliferation in tubulären Zellen provozierte. Dieser Schritt hat sich als entscheidend für die Zystogenese erwiesen [42], während das Knockout der Inversion bei Mäusen zu einer polyzystischen Nierenerkrankung führt [48]. Nach der Theorie derNieren-Zystogenese, Inversion wird wegen seiner Lokalisation an primären Zilien als "Mykoprotein" angesehenNieren-tubuläre Zellen. In unserer Studie waren in allen analysierten Stadien primäre Zilien auf der apikalen Zelloberfläche von tubulären Zellen vorhanden, während während der fötalen Stadien die Expression von -Tubulin stärker war als in der postnatalen Phase.

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENSCHMERZEN VERBESSERN

Frühere Studien haben gezeigt, dass die primäre Zilienfunktion durch eine Dysregulation von -Tubulin während der Entwicklung beeinträchtigt werden kann, was zu Zystogenese, abnormaler Nierenentwicklung und möglichen chronischen Nierenerkrankungen in der Kindheit führen kann [31,49]. Dies steht im Einklang mit unseren Befunden verkürzter und dysmorpher primärer Zilien, die bei MCDK beobachtet wurden, oder mit multiplen und extrem verlängerten oder dislozierten Zilien, die in erweiterten Tubuli von CNF und FSGS im Vergleich zu gesunden Kontrollen gefunden wurden. Um die Tatsache zu untermauern, dass die kanonischen und nicht-kanonischen Wnt-Signalwege, die durch primäre Zilien reguliert werden, als zwingend für eine normale Nierenentwicklung angesehen werden, fanden wir eine signifikant geringere Färbung von Inversion und DVL-1 in MCDK im Vergleich zu einer gesunden Kontrolle [31,49]. Unterschiedliche Expressionsmusterdynamiken von -Tubulin, Inversion und DVL-1 in verschiedenen Phasen der Nierenentwicklung können auf ein Umschalten zwischen dem kanonischen und nichtkanonischen Wnt-Signalweg während der normalen Nierenmorphogenese hindeuten. Wir schlagen vor, dass ihr Austausch die Transkription in einem kanonischen Signalweg oder die Reihenfolge der Zellmigration und Polarisierung während der Nierenentwicklung in einem nicht-kanonischen Signalweg bestimmt. Ihr Gleichgewicht und ihre Expression in allen untersuchten Nierenstrukturen deuten auf ihre wichtige Rolle bei der normalen Nierenentwicklung hin. Während der normalen Nierenentwicklung (vom 13. bis zum 38. GW) nimmt die Gesamtexpression von -Tubulin, Inversion und DVL-1 ab, wenn das Nierengewebe eine reife Morphologie annimmt. In 1,5- und 7- Jahre alten Nierengeweben zeigten -Tubulin und Inversion eine leichte Zunahme der Expression, was die Tatsache unterstützt, dass der nicht-kanonische Wnt-Signalweg nach der Geburt aktiv bleibt. Im Gegensatz dazu bleibt DVL-1 mit vermindertem Expressionsmuster bestehen, was zu der Schlussfolgerung führen könnte, dass der kanonische Wnt-Weg in gesundem Nierengewebe stummgeschaltet ist. Als Folge pathologischer Nierenerkrankungen können Epithelzellen der Niere mit dem Wiederauftreten von EMT und Fibrose reagieren [50], verbunden mit einer Reaktivierung des kanonischen Wnt-Signalwegs [44]. Daher könnten Störungen von -Tubulin, Inversion und DVL-1, die in erkrankten Nieren gefunden werden, der zugrunde liegende pathologische Mechanismus und ein Ergebnis des Wechsels vom nichtkanonischen zum kanonischen Wnt-Weg in der sich entwickelnden Niere sein, was auf den Wechsel von reversibler zu irreversibler Niere anspielt Schaden. Darüber hinaus Veränderungen in ihrer pränatalen und postnatalenNieren-Das Expressionsmuster könnte im Erwachsenenalter mit einer Beeinträchtigung der Nierenfunktion einhergehen, was zu angeborenen Erkrankungen und chronischem Nierenversagen führen kann.

4. Materialien und Methoden

4.1. Menschliche Proben

Proben von fötalem Nierengewebe wurden nach einem Schwangerschaftsabbruch in der 14., 15., 16., 22. und 38. SSW an der Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe des Universitätsklinikums Split entnommen. Das gesamte erworbene fötale Material wurde von einem Pathologen untersucht, und nur Gewebe ohne Anzeichen von Anomalien, Mazerationen oder intrauterinem Tod und mit normalem Karyogramm wurden für die Studie verwendet. Die Krankenakten der Mütter wurden vor der Probenentnahme überprüft, und im Falle von Gesundheitsproblemen, die den Ausgang der Schwangerschaft beeinflussen könnten, wurden Nierengewebe von der Studie ausgeschlossen. Die Reife wurde durch Kopfumfang, Bauchumfang und Femurlänge [51] in Korrelation mit den Menstruationskalendern der Patientinnen bestimmt. Proben von 1,5- und 7- Jahre altem Nierengewebe wurden nach Unfalltod entnommen. Die Proben wurden in der Abteilung für Pathologie des Universitätsklinikums Split erhalten. Die Proben des multizystischen dysplastischen Nierengewebes (MCDK) wurden nach Schwangerschaftsverlust erhalten, fokale segmentale Glomerulosklerose (FSGS) und nephrotisches Syndrom vom finnischen Typ (CNF) wurden aufgrund einer Nephrektomie erhalten. Sämtliches erworbenes Material wurde von einem Pathologen untersucht und ausgewertet, der die Diagnosen einordnete. Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der University of Split School of Medicine (20. Mai 2016) gemäß der Deklaration von Helsinki und ihren Aktualisierungen genehmigt (Klassifikationsnr.: 003-08/16-03/0001, Registernummer: 2181-198-03-04-16-0024, 20. Mai 2016) [52].

4.2. Immunhistochemie

Die Fixierung der gesammelten Gewebeprobe wurde mit 4 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 24 h bei 22 °C verarbeitet. Nach der Dehydratisierung in 100-prozentigem Ethanol wurden die Proben wie zuvor beschrieben in Paraffin eingebettet [53]. Die Proben wurden unter Verwendung eines Mikrotoms in 5 &mgr;m dicke Schnitte geschnitten und anschließend auf Objektträgern befestigt. Zur Überprüfung der Gewebekonservierung wurde jeder 10. Schnitt mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt [54]. Depart-Feminisierung und Immunhistochemie wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [2,55,56]. Nach dem Spülen in PBS wurden die Objektträger über Nacht mit primären Antikörpern in einer feuchten Kammer bei 22 °C inkubiert (StainTray Objektträger-Färbesystem; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Als primäre Antikörper wurden Kaninchen-monoklonaler Anti-Alpha-Tubulin-Antikörper (Verdünnung 1:1000; ab179484, Abcam, Cambridge, UK), polyklonaler Kaninchen-Anti-Inversions-Antikörper (Verdünnung 1:100; ab65187, Abcam, Cambridge, UK), monoklonaler Maus-DVL verwendet -1-Antikörper (Verdünnung 1:150; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) und polyklonaler Kaninchen-anti-Gamma-Tubulin-Antikörper (um die primäre zilienspezifische Färbung mit alpha- Tubulin, Verdünnung 1:500; ab11321, Abcam, Cambridge, UK). Nach dem Spülen in PBS wurden Sekundärantikörper wie aufgeführt eine Stunde lang verabreicht: Esel-Anti-Kaninchen-IgG H&L, Alexa Fluor 488 (Verdünnung 1:400; ab150073, Abcam, Cambridge, UK) und Ziege-Anti-Maus-IgG H&L, TRITC (Verdünnung 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, UK) 4',6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI) wurde zum Anfärben der Zellkerne und nach einer 2--minütigen Inkubation, Objektträger verwendet wurden in PBS gewaschen und mit Eindeckmedium und Deckgläsern überschichtet. Eine unspezifische Färbung wurde verhindert, indem vor der Anwendung des primären Antikörpers ein Proteinblock (ab64226; Abcam, Cambridge, UK) verwendet wurde. Als Negativkontrolle wurde ein Präadsorptionstest durchgeführt, während die Spezifität der sekundären Antikörper überprüft wurde, indem die primären Antikörper von den Färbeverfahren weggelassen wurden.

4.3. Elektronenmikroskopie

Fixierung vonNiereGewebe wurde in 4 Prozent Paraformaldehyd für 24 Stunden durchgeführt, gefolgt von einer Nachfixierung in 1 Prozent Osmiumtetroxid für 1 Stunde. Der Dehydratisierungsprozess wurde mit einer Ethanolreihe durchgeführt und mit der Einbettung in LX 112-Harz abgeschlossen [22]. Ein Mikrometer dünne Schnitte wurden mit Toluidinblau gefärbt und untersucht, um ultradünne Schnitte auszuwählen. Ultradünnschnitte mit einer Dicke von 0,05 Mikrometer wurden nach Färbung mit Uranylacetat und Bleicitrat untersucht. Das Mikroskop JEOL 1200 EX wurde verwendet, um die Mikrofotografien zu erhalten.

4.4. Genetische Analyse

Wie zuvor beschrieben [19] wurde unter Verwendung von Leukozyten aus dem peripheren Blut genomische DNA extrahiert. Es wurde eine homozygote Missense-Mutation im NPHS1-Gen gefunden (c.1096A > C; p.Ser366Arg), was die Diagnose eines kongenitalen nephrotischen Syndroms vom finnischen Typ (CNF) bestätigte [57].

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENINFEKTIONEN VERBESSERN

4.5. Datenanalyse

Die Schnittanalyse wurde auf einem FL-Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung von 3 FL-Fluoreszenzkanälen (Olympus BX51, Tokio, Japan) durchgeführt. Die Bilder wurden mit einer Digitalkamera DP71 (Olympus, Tokio, Japan) bei starker (40-facher) Vergrößerung aufgenommen. Nur derNieren-Kortex, der proximale gewundene Tubuli (pct), distale gewundene Tubuli (dct) und Glomeruli (g) enthält, waren von Interesse. Die Bilder wurden dann mit der ImageJ-Software verarbeitet (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ (Zugriff am 15. Oktober 2018), 1997–2021. ) und Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, Kalifornien, USA) zur weiteren Auswertung. Vor der Zellzählung wurde das ImageJ-Tool für geteilte Kanäle verwendet. Anschließend wurde das ursprüngliche immunfluoreszenzmikroskopische Foto vom roten oder grünen Kanal (je nachdem, was der ursprüngliche Kanal war) unter Verwendung des Bildrechners ImageJ-Tool subtrahiert, um Signallecks zu verhindern. Werte unter dem Schwellenwert von 50 wurden als negativ gewertet. Wir zählten immunreaktive Signale in Zellen mit mindestens 20 Strukturen (pct, dct oder g) pro Stadium oder einer insgesamt positiven Anzahl von Zellen pro Mikrofoto der multizystischen DysplasieNiereGewebe, FSGS und CNF. Wir stuften Zellen als positiv ein, wenn sich das Immunfluoreszenzsignal auf einer beliebigen Ebene der Membran, des Zytoplasmas oder des Zellkerns über dem Wert 50 ansammelte, der mit der ImageJ-Software unter Verwendung des Schwellenwertbefehls gemessen wurde. Negative Zellen wurden als Zellen ohne jegliche Immunreaktivität kategorisiert. Zwei unabhängige Ermittler analysierten die Daten.

4.6. Semiquantitative Analyse

Die Intensität von -Tubulin, Inversion und DVL-1-Färbungssignal wurde von zwei unabhängigen Forschern unter Verwendung der ImageJ-Software bewertet. Die Gesamtsignalintensität wurde gemessen, nachdem das Bild im 8--Bit-Typ eingestellt wurde; danach wurde die Intensität der Markierungsfärbung in 20 pct, dct und g durch Messen der umrissenen Fläche der Struktur bewertet. Wenn die Ergebnisse zwischen den Bewertern unterschiedlich waren, klärte ein dritter unabhängiger Forscher den Zweifel. Die maximale Signalintensität für -Tubulin betrug 84,125 ± 3,214 SD, für Inversion 71,50 ± 2,715 SD und für DVL-1 80 0,916 ± 1,875 SD. Die höchste Sättigung der Signalfarbe auf den Mikroskopaufnahmen wurde mit 3 (66,66–99,99 Prozent der gesamten Signalbildintensität) markiert, gefolgt von 2 (33,33–66,66 Prozent) für die mittlere Signalintensität und 1 (0,33 Prozent –33,33 Prozent). für niedrige Signalintensität (Tabelle 1.).

4.7. Statistische Analyse

Zur Bestimmung von Unterschieden zwischen Stadien und Strukturen wurde der Kruskal-Wallis-Test durchgeführt, gefolgt von Dunn's post hoc unter Verwendung der Software GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego, Kalifornien, USA, www.graphpad.com (Zugriff am 15. Oktober 2018.)). Die Anzahl positiver Zellen wurde in Prozent als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt, während die statistische Signifikanz bei p < 0,05="" anerkannt="" wurde.="" die="" anzahl="" der="" analysierten="" strukturen="" betrug="" 4200="" in="" 35="" proben,="" wobei="" insgesamt="" 135.256="" zellen="" gezählt="" wurden.="" wir="" haben="" 2-way="" anova="" mit="" sidaks="" post-hoc-test="" verwendet,="" um="" unterschiede="" in="" der="" expression="" von="" -tubulin,="" inversion="" und="" dvl-1="" in="" verschiedenen="" entwicklungsstadien="" zu="" testen.="" um="" die="" proteinexpression="" in="" bezug="" auf="" die="" entwicklungszeit="" zu="" untersuchen,="" haben="" wir="" die="" lineare="" regression="" verwendet.="" eine="" einfache="" anova,="" gefolgt="" von="" tukeys="" post-hoc-test,="" wurde="" verwendet,="" um="" die="" unterschiede="" in="" der="" expression="" von="" -tubulin,="" inversion="" und="" dvl-1="" bei="" gesunden="" zu="">NiereGewebe verglichen mit Geweben von MCDK, FSGS und CNF. Unterschiede in der Expression von Proteinen zwischen MCDK, FSGS und CNF wurden mit 2--Weg-ANOVA, gefolgt von Sidaks Post-Hoc-Test, untersucht. Einweg-ANOVA, gefolgt von Tukey's Post-Hoc-Test, wurde verwendet, um die Unterschiede in der Zilienlänge und Epithelzellenhöhe von pct zwischen gesunder Kontrolle und pathologischer Kontrolle zu bewertenNiereGewebe. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) gezeigt, wobei die statistische Differenz bei p < 0,05="" bestätigt="">