Extrazelluläre Azidose schränkt den Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel ein und bewahrt die T-Zell-Stammfunktion

Die Ansammlung saurer Stoffwechselabfallprodukte in der Mikroumgebung des Tumors hemmt die Effektorfunktionen tumorinflatorischer Lymphozyten (TILs). Es bleibt jedoch unklar, wie sich eine saure Umgebung auf den Stoffwechsel und die Differenzierung von T-Zellen auswirkt. Hier zeigen wir, dass eine längere Säureexposition den intrazellulären Stoffwechsel und die mitochondriale Fitness der T-Zellen umprogrammiert und die T-Zell-Stammfunktion erhält. Mechanistisch gesehen beeinträchtigt eine erhöhte extrazelluläre Azidose die Methioninaufnahme und den Methioninstoffwechsel durch Herunterregulierung von SLC7A5 und verändert dadurch die H3K27me3-Ablagerung an den Promotoren wichtiger T-Zell-Stammgene. Diese Veränderungen fördern die Aufrechterhaltung eines „stammähnlichen Gedächtniszustands“ und verbessern die langfristige In-vivo-Persistenz und Antitumorwirksamkeit bei Mäusen. Unsere Ergebnisse zeigen nicht nur eine unerwartete Fähigkeit der extrazellulären Azidose, die stammähnlichen Eigenschaften von T-Zellen aufrechtzuerhalten, sondern erweitern auch unser Verständnis darüber, wie sich der Methioninstoffwechsel auf die Stammzellen von T-Zellen auswirkt.

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Der adoptive Transfer von Tumorantigen-spezifischen T-Zellen stellt einen großen Fortschritt auf dem Gebiet der Krebstherapie dar, da er zur vollständigen Rückbildung bestimmter bösartiger Erkrankungen geführt hat. Seine therapeutische Wirksamkeit hängt stark von der Persistenz und dem Differenzierungsstatus der übertragenen T-Zellen ab1,2. Weniger differenzierte Gedächtnis-T-Zellen sind aufgrund ihrer stammzellähnlichen Eigenschaften der Selbsterneuerung und Multipotenz die bevorzugte Population für den adoptiven T-Zelltransfer (ACT)3,4. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass die Verwendung von Stammzellen-Gedächtnis-T-Zellen für ACT überlegene Antitumorreaktionen erzielt5. Im Vergleich zu terminal differenzierten Effektor-T-Zellen weisen stammähnliche T-Zellen deutliche Merkmale auf6. Sowohl menschliche als auch mausstammähnliche T-Zellen zeichnen sich durch die Expression von Antigen-erfahrenen und Homing-assoziierten Molekülen aus, einschließlich hoher Konzentrationen an CD62L und CCR7 (Lit. 7). Unser Verständnis der Transkriptionsprofile, epigenetischen Modifikationen und Stoffwechselwege, die stammähnliche T-Zellen regulieren, hat sich in den letzten Jahren dramatisch verbessert8–10. Es wurde berichtet, dass mehrere Transkriptionsfaktoren wie TCF1, KLF2 und LEF1 eine wesentliche Rolle bei der Förderung oder Aufrechterhaltung der T-Zell-Stammfunktion spielen9. Insbesondere ist TCF1 der Schlüsseltranskriptionsfaktor, der die Bildung langlebiger Gedächtnis-T-Zellen fördert11. Bei chronischen Infektionen unterstützt ein kleiner Teil der stammähnlichen TCF1+-T-Zellen T-Zell-Reaktionen gegen Sekundärinfektionen1,12. Epigenetische Veränderungen bieten T-Zellen die Möglichkeit, sowohl die Transkriptionsänderungen auszulösen, die dem Erwerb von Gedächtniszelleigenschaften zugrunde liegen, als auch diese Transkriptionsexpressionsmuster aufrechtzuerhalten13. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Trimethylierung von Histon H3 an K4 (H3K4me3), eine aktivierungsassoziierte Modifikation, an gedächtnisassoziierten Genorten, einschließlich TCF7, KLF2, LEF1, CCR7 und SELL, während der Differenzierung von naivem CD{{47 }} T-Zellen in Gedächtnis-T-Zellen, wohingegen die Trimethylierung von H3 an K27 (H3K27me3), eine repressive Modifikation, an diesen Orten verloren geht13–15. Umgekehrt zeigen Effektor-assoziierte Gene (GZMB, PRF1, IFNG und TBX21) verringerte repressive und erhöhte aktivierende epigenetische Modifikationen an diesen Loci in Effektor-T-Zellen13,16. Schließlich deuten immer mehr Beweise darauf hin, dass Stoffwechselkreisläufe die Schicksalsentscheidungen von T-Zellen bestimmen und deren epigenetischen und funktionellen Zustand beeinflussen17. Kurzlebige Effektor-T-Zellen sind stark glykolytisch und abhängig vom Ein-Kohlenstoff-Metabolismus18,19, wohingegen stammähnliche Gedächtnis-T-Zellen unterschiedliche Stoffwechselprofile aufweisen, die durch erhöhte Fettsäureoxidation (FAO) und mitochondriale Ersatzatmungskapazität (SRC), den Kardinal, gekennzeichnet sind Merkmale, die an der Langzeitpersistenz beteiligt sind20–22. Daher ist die Neuprogrammierung des Stoffwechsels wichtig für den effizienten Erwerb von Stammzellen und das langfristige Überleben von T-Zellen.

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Die immunsuppressive Tumormikroumgebung (TME), die durch niedrigen pH-Wert, Hypoxie, Glukosemangel und Milchsäureanreicherung gekennzeichnet ist, ist die Hauptbarriere, die die ordnungsgemäße Expansion, Differenzierung und Funktionalität von T-Zellen behindert23,24. Tatsächlich beeinträchtigt der durch TME verursachte Stoffwechselstress die Kapazität und Fitness der Mitochondrien und löst eine Insuffizienz und Dysfunktion des intratumoralen T-Zell-Stoffwechsels aus 25–28. Interessanterweise sind die meisten tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) dysfunktional, aber ein kleiner Teil besitzt stammähnliche Gedächtnis- oder Vorläufereigenschaften7,29. Diese stammartige TIL-Untergruppe bewahrt das Proliferationspotenzial und die Persistenz und ist mit einer günstigen Reaktion auf Immun-Checkpoint-Blockade (ICB) und TIL-ACT bei Menschen mit Krebs verbunden11,30. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine erhöhte extrazelluläre Azidose ( ↑[H+]) die zytolytische Aktivität von T-Zellen sowohl in vitro als auch in vivo unterdrückte31–33. Darüber hinaus hat das saure TME einen erheblichen Einfluss auf die Aktivität und Differenzierung von tumorinfiltrierenden myeloischen Zellen, wie z. B. dendritischen Zellen (DCs) und tumorassoziierten Makrophagen (TAMs)34–36. Der Einfluss von ↑[H+] auf die T-Zell-Stammfunktion und die metabolische Fitness bleibt jedoch weitgehend unbekannt. Hier berichten wir, dass eine langfristige In-vitro-Exponierung mit ↑[H+] die Differenzierung von stammähnlichen CD8+-T-Zellen von Mensch und Maus auf Kosten terminaler Effektor-CD8+-T-Zellen erleichtert. Wir fanden heraus, dass eine langfristige ↑[H+]-Behandlung den T-Zell-Metabolismus umgestaltet und die Atmungskapazität der Mitochondrien aufrechterhält. Darüber hinaus beeinträchtigt eine anhaltende ↑[H+]-Exposition die Methioninaufnahme und den Methioninstoffwechsel, was anschließend zu einer verminderten H3K27me3-Ablagerung gedächtnisbezogener Gene führt und so die Aufrechterhaltung eines „stammähnlichen Gedächtnis“-Status erleichtert. Schließlich zeigt der adoptive Transfer von T-Zellen, die unter ↑[H+]-Bedingungen kultiviert wurden, eine starke Antitumoraktivität in vivo, entsprechend ihrem weniger erschöpften Phänotyp. Somit zeigt unsere Studie die unerwartete Rolle der extrazellulären Azidose bei der Erhaltung der T-Zell-Stammfunktion durch Umbau des Zellstoffwechsels und epigenetischer Muster.

Ergebnisse

↑[H+]-Exposition fördert die CD8+-T-Zell-Stammfunktion

Um festzustellen, ob extrazelluläres ↑[H+] die Differenzierung stammähnlicher T-Zellen beeinflusst, führten wir eine durchflusszytometrische Analyse der wichtigsten stammähnlichen Phänotypen an menschlichen T-Zellen durch, die 12 Tage lang in einem der beiden Kontrollmedien, ↑[H+]-Medien mit 10 mM Milchsäure, kultiviert wurden (Nachahmung der Laktatkonzentration in pathophysiologischen Situationen23,35) oder saures Medium (~pH 6,6, durch Salzsäure) (Abb. 1a). Ein höherer Anteil stammähnlicher CD8+-T-Zellen, einschließlich frühem Gedächtnis (CD45RO− CD27+) und zentralem Gedächtnis (CD45RO+ CD27+), wurde in T-Zellen beobachtet, die in ↑ konditioniert wurden [H+] versus Kontrollmedium (Extended Data Abb. 1a). Darüber hinaus stellten wir fest, dass in ↑[H+]-Medium kultivierte T-Zellen einen höheren Prozentsatz an stammähnlichen Zellen (CCR7+ CD62L+) aufwiesen (Abb. 1b). Bemerkenswert ist, dass wir auf Proteinebene sowohl bei menschlichen als auch bei Maus-CD8+-T-Zellen, die ↑[H+] ausgesetzt waren, eine deutlich erhöhte TCF1-Expression, den Schlüsselfaktor für die stammartige und zentrale Gedächtnisdifferenzierung, feststellten (Abb. 1c und Erweiterte Daten Abb. 1b). Darüber hinaus gab es einen von der [H+]-Konzentration abhängigen Effekt auf die CCR7- und TCF1-Expression (Extended Data, Abb. 1c). In Übereinstimmung mit dem stammähnlichen Phänotyp von ↑[H+]-konditionierten T-Zellen war die Produktion von intrazellulärem Interferon- (IFN-) und Tumornekrosefaktor (TNF-) in diesen Zellen signifikant reduziert (Abb. 1d).

Um den T-Zell-Differenzierungsstatus besser zu untersuchen, führten wir eine RNA-Sequenzierungsanalyse (RNA-seq) durch und stellten fest, dass eine langfristige In-vitro-Exposition mit ↑[H+] zu einem deutlichen Transkriptionsprofil führte (Extended Data Abb. 1d). Die Exposition gegenüber ↑[H+] führte zu einer deutlich verminderten Expression von Genen, die Effektormoleküle wie PRF1, GZMB und IFNG sowie den co-inhibitorischen Rezeptor BTLA kodieren (Abb. 1e, f und Extended Data Abb. 1e). Im Gegensatz dazu zeigten ↑[H+]-kultivierte T-Zellen eine höhere Expression von BACH2, CCR7, LEF1 und TCF7, die mit der T-Zell-Stammfunktion korrelieren (Abb. 1e, f und Extended Data Abb. 1e). Die Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) zeigte, dass das durch ↑[H+]-Exposition induzierte Transkriptionsmuster dem von Gedächtnis-T-Zellen ähnelte (Abb. 1g und erweiterte Daten Abb. 1f). Darüber hinaus bestätigte die quantitative Polymerasekettenreaktionsanalyse (qPCR) eine erhöhte mRNA-Expression von BACH2, KLF2, LEF1 und TCF7 nach der ↑[H+]-Behandlung (Abb. 1h). Zusammenfassend stützen diese Beobachtungen die Tatsache, dass die ↑[H+]-Behandlung die Transkriptionsprofile von T-Zellen stark beeinflusst, um Stammzellen zu etablieren. Bemerkenswert ist, dass wir herausfanden, dass die Behandlung mit ↑[H+] die T-Zell-Proliferation hemmte und die Zellzyklusverteilung in Richtung der G1-Phase und weg von der S-Phase verzerrte (ergänzende Abbildung 1a – c). Als nächstes untersuchten wir die T-Zell-Aktivierung bei ↑[H+]-Behandlung während der TCR-Stimulation und stellten fest, dass die ↑[H+]-Exposition keinen signifikanten Einfluss auf die Expression von T-Zell-Aktivierungsmarkern oder die Zellgröße hat (ergänzende Abbildung 2a, b). Darüber hinaus haben wir weiter bestätigt, dass die ↑[H+]-Exposition nach der T-Zell-Aktivierung immer noch einen stammähnlichen Zustand der T-Zellen induzieren kann (ergänzende Abbildung 2c–f). Diese Ergebnisse schließen die Möglichkeit aus, dass T-Zellen, die ↑[H+] ausgesetzt sind, einfach refraktär gegenüber einer Stimulation sind, anstatt einen stammähnlichen Zustand anzunehmen.

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Frühere Berichte haben gezeigt, dass das saure Milieu die zytolytische Aktivität von T-Zellen sowohl in vitro als auch in vivo stark hemmt23,31. Wir fanden auch heraus, dass eine kurzfristige ↑[H+]-Exposition die Produktion von Zytokinen beeinträchtigte, jedoch nur geringe Auswirkungen auf den stammähnlichen Phänotyp in T-Zellen hatte (Extended Data Abb. 1g–i und ergänzende Abb. 3a–c). Darüber hinaus sind die hemmenden Wirkungen der Zytokinproduktion durch ↑[H+]-Exposition vorübergehend und reversibel, da die Entfernung von ↑[H+] die Zytokinproduktion durch T-Zellen schnell wiederherstellt (Extended Data Abb. 1h). Daher erfolgt die Hemmung der T-Zell-Effektorfunktion durch das saure Milieu sehr schnell, wohingegen die Neuprogrammierung der T-Zell-Stammfunktion eine längere ↑[H+]-Exposition erfordert. Da Laktat in Lösung entweder in seiner undissoziierten Form (Milchsäure) oder als Ionensalz (Natriumlaktat) vorliegt, wollten wir als Nächstes herausfinden, ob Natriumlaktat ähnliche Auswirkungen auf die T-Zell-Stammfunktion hat und fanden heraus, dass Natriumlaktat auch die Stammzellensignaturen förderte. obwohl seine Wirksamkeit viel geringer war als die der Milchsäurebehandlung (10 mM) (Extended Data Abb. 1j, k und ergänzende Abb. 4a – f). Diese Ergebnisse legen sowohl die Bedeutung von ↑[H+] als auch seinen Unterschied zur Behandlung mit Laktationen bei der Induktion des stammähnlichen Phänotyps von CD8+-T-Zellen nahe.

Abb. 1|↑[H+]-Exposition erleichtert die Differenzierung stammähnlicher CD8+-T-Zellen. a Schematische Darstellung der Aktivierung menschlicher T-Zellen unter den angegebenen Bedingungen: pH 7,4 (– ↑ [H+], Kontrolle), pH 6,6 (+ ↑ [H+], Salzsäure) oder 10 mM Milchsäure (+ ↑ [H+]). PBMCs, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes. b, Repräsentative CCR7- und CD62L-Expressionsprofile in menschlichen CD8+-T-Zellen unter verschiedenen Bedingungen am Tag 12. n=3 unabhängige Proben. c, Repräsentative Histogramme und Quantifizierung der TCF1-Expression in menschlichen CD8+-T-Zellen unter verschiedenen Bedingungen am Tag 12. n=3 unabhängige Proben. MFI, mittlere Fluoreszenzintensität. d, Menschliche T-Zellen wurden wie in a für 12 Tage expandiert und mit Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA), das Brefeldin A (BFA) enthielt, für 4,5 Stunden stimuliert. Das intrazelluläre Expressionsprofil von IFN- und TNF- ist für T-Zellen im Zustand pH 7,4 (links), 10 mM Milchsäure (Mitte) oder pH 6,6 (rechts) dargestellt. n=3 unabhängige Stichproben. e,f, RNA-seq-Analyse menschlicher T-Zellen, die in Kontrolle (pH 7,4) oder Milchsäure (10 mM) expandiert wurden. Wärmekarte ausgewählter Gene (e) und Vulkandiagramm aller Gene, in denen Gene markiert wurden, die mit Gedächtnis-, Effektor- und erschöpften T-Zellen assoziiert sind (f). Im Vulkandiagramm stellt die x-Achse die log{41}}transformierten Fold Change (FC)-Werte für mit Milchsäure behandelte Zellen im Vergleich zu den Kontrollen am Tag 12 dar, und die y-Achse stellt die angepassten P-Werte dar. n=4 unabhängige Stichproben. g, GSEA-Diagramm zum Vergleich der Kontrolle mit milchsäurekonditionierten T-Zellen für Effektor- und Gedächtnisanreicherung. NES, normalisierter Anreicherungsscore. h, Quantitative mRNA-Expression von Transkriptionsfaktoren, die mit der T-Zell-Stammfunktion (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) in T-Zellen unter den angegebenen Bedingungen assoziiert sind. n=3 unabhängige Stichproben. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die statistischen Analysen wurden durch den ungepaarten zweiseitigen Student-t-Test (b–d,h) ermittelt. Nominale P-Werte und False-Discovery-Raten (FDRs) wurden mit der Standardmethode der GSEA-Software (g) berechnet.

Erhöhtes [H+] löst eine metabolische Neuprogrammierung aus

Über die unterschiedlichen Transkriptionsprogramme hinaus erwerben stammähnliche T-Zellen bevorzugt auch einzigartige Stoffwechseleigenschaften, einschließlich erhöhter FAO und eingeschränktem glykolytischem Stoffwechsel17,20,37. Um die Stoffwechselmerkmale von langfristig in vitro ↑[H+]-exponierten T-Zellen zu untersuchen, führten wir eine Gene Ontology (GO)-Anreicherungsanalyse durch und fanden signifikante Unterschiede in der Expression von Genen, die mit Stoffwechselwegen wie dem Stoffwechsel kleiner Moleküle und anderen zusammenhängen Glykolyse (Abb. 2a). Tatsächlich zeigten langfristig mit ↑[H+] konditionierte T-Zellen eine verringerte Glykolyse und einen verringerten Aminosäurestoffwechsel im Gegensatz zu einem erhöhten langkettigen Fettsäurestoffwechsel (Extended Data Abb. 2a,b). Im Gegensatz zur langfristigen ↑[H+]-Exposition hemmte die kurzfristige ↑[H+]-Behandlung nur die Glykolyse, hatte jedoch keine signifikanten Auswirkungen auf die FAO (ergänzende Abbildung 5a). Die quantitative PCR-Analyse bestätigte außerdem, dass die Glykolysegene SLC2A1, SLC2A3 und LDHA in ↑[H+]-exponierten T-Zellen signifikant verringert waren (Extended Data Abb. 2c). Umgekehrt förderte die ↑[H+]-Konditionierung die Expression von Carnitin-Palmitoyltransferase 1 (kodiert durch CPT1A), einem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym, das an FAO beteiligt ist (Extended Data, Abb. 2c). Um die durch ↑[H+] induzierten Stoffwechselveränderungen weiter aufzuklären, führten wir eine unvoreingenommene Metabolomikanalyse durch und fanden 285 verschiedene Zwischenprodukte in mit ↑[H+] kultivierten T-Zellen im Vergleich zu Kontrollen (Extended Data Abb. 2d). Insbesondere führte die Exposition gegenüber ↑[H+] zu einer signifikanten Verringerung der glykolytischen Zwischenprodukte und bestimmter essentieller Aminosäuren, statt zu einer Erhöhung mehrerer Carnitinspezies, der aktivierten Form von Fettsäuren, die zur Oxidation in die Mitochondrien übertragen werden (Extended Data Abb. 2e–g). Die Analyse des Stoffwechselflusses unter Verwendung von [13C6]Glucose oder [13C16]Palmitat zeigte, dass die Exposition gegenüber ↑[H+] den Einbau von [13C6]Glucose in TCA-Zwischenprodukte und Milchsäure drastisch behinderte und gleichzeitig den Einbau von [13C16]Palmitat in Acetyl-CoA und Citrat förderte, was diese Annahme stützt dass die extrazelluläre Azidose die Glykolyse unterdrückt und die FAO in T-Zellen verstärkt (Abb. 2b – e). Diese ↑[H+]-konditionierten T-Zellen zeigten Einschränkungen hinsichtlich der Nährstoffaufnahme, was durch den verringerten Verbrauch von [13C6]Glucose und die Absorption von Lipidanaloga (BODIPY FL C16) belegt wurde, ein Befund, der auf einen erhöhten elektrochemischen Gradienten zurückzuführen sein könnte (Erweiterte Daten Abb. 2h, i).

Die begrenzte Nährstoffaufnahme und der Wechsel des Zellstoffwechsels könnten zu Veränderungen der Signalnetzwerke in T-Zellen führen. Die GO-Anreicherungsanalyse von mit Milchsäure behandelten T-Zellen ergab, dass die meisten der betroffenen Gene hauptsächlich an der PI3K-AKT-, mTOR- und TCR-Signalübertragung beteiligt sind (Extended Data Abb. 3a). Die mTOR-Signalübertragung spielt eine zentrale Rolle bei der Integration von Immunsignalen und metabolischen Hinweisen für die ordnungsgemäße Aktivierung von T-Zellen, und die Hemmung der mTOR-Signalübertragung führt dazu, dass die Zellen statt zur Effektordifferenzierung CD8+-Gedächtniszellen bilden38–40. Unsere GSEA-Analyse ergab, dass die Aktivität sowohl der AKT-mTOR- als auch der NF-кB-Signalübertragung in ↑[H+]-konditionierten T-Zellen im Vergleich zu der in Kontroll-T-Zellen verringert war (Abb. 2f und erweiterte Daten Abb. 3b). Dies wurde weiter durch die verringerte Phosphorylierung von S6 (bei Ser235 und Ser236), 4EBP1 (bei Thr37 und Thr46), AKT (bei Ser473) und NF-кB (bei Ser536) in ↑[H+]-konditionierten T-Zellen bestätigt (Abb. 2g,h und erweiterte Daten Abb. 3c). Es ist bekannt, dass mTOR ein entscheidender Regulator verschiedener biologischer Prozesse ist, darunter Zellgröße, Energieerzeugung und Proteinsynthese41. Tatsächlich fanden wir heraus, dass die Zellgröße von ↑[H+]-konditionierten T-Zellen im Vergleich zu der von Kontroll-T-Zellen verringert war (Extended Data Abb. 3d). Als nächstes untersuchten wir die bioenergieabhängige Proteinsynthese in ↑[H+]-konditionierten T-Zellen mithilfe von SCENITH, einer neu entwickelten Methode, die den Einbau von Puromycin als Messwert für die Proteinsyntheseniveaus nutzt42. Wie erwartet unterdrückte die ↑[H+]-Exposition die energieintensive Proteinsynthese (Abb. 2i), was darauf hindeutet, dass der Energiestoffwechsel in CD8+-T-Zellen verändert war. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Erkenntnissen überein, dass die Hemmung der mTOR-Aktivität durch Rapamycin die Expression stammassoziierter Transkriptionsfaktoren erhöhte (Extended Data, Abb. 3e, f). Wenn wir unsere Ergebnisse zusammenfassen, kommen wir zu dem Schluss, dass eine langfristige ↑[H+]-Exposition einen Stoffwechselwechsel in Gang setzt und die mTOR-Aktivität unterdrückt, wodurch der Erwerb und die Aufrechterhaltung der T-Zell-Stammfunktion erleichtert wird.

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↑[H+]-vermittelte Einschränkung des Methioninstoffwechsels bewahrt epigenetische Stammzellen

Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass der Ein-Kohlenstoff-Metabolismus die Schicksalsentscheidungen der T-Zellen bestimmt und deren Funktionszustände prägt43,44. Unsere RNA-seq-Analyse zeigte eine schlechte Anreicherung des Ein-Kohlenstoff-Stoffwechselprozesses und der Signatur des Methioninzyklus in T-Zellen, die einer langfristigen statt einer kurzfristigen ↑[H+]-Behandlung ausgesetzt waren (Abb. 3a, Erweiterte Daten Abb. 4a, und ergänzende Abb. 5b). Dementsprechend hemmte die ↑[H+]-Exposition die Expression von Genen, die für Enzyme im Zusammenhang mit dem Methioninzyklus (MTR, AHCY und BHMT) sowie dem Folatstoffwechsel (SHMT1 und SHMT2) kodieren (Extended Data Abb. 4b). Weitere metabolomische Analysen ergaben, dass in Milchsäure kultivierte T-Zellen einen deutlichen Rückgang der am Methioninzyklus beteiligten intrazellulären Metaboliten, einschließlich Methionin, S-Adenosylmethionin (SAM) und S-Adenosylhomocystein (SAH), zeigten, aber erhöhte Serin- und Homocysteinspiegel (Extended). Daten Abb. 4c). Die [13C5]Methionin-Verfolgung bestätigte weiterhin, dass die Aufnahme und intrazelluläre Häufigkeit von Methionin, 13C-markiertem intrazellulärem SAM (m+5), SAH (m+4) und 5′-Methylthioadenosin (MTA, m +1) waren in ↑[H+]-exponierten T-Zellen signifikant reduziert (Abb. 3b–d und erweiterte Daten Abb. 4d). Bemerkenswert ist, dass die exogene Methionin-Supplementierung die Aufnahme und intrazelluläre Häufigkeit von [13C5]Methionin sowie der relevanten Zwischenprodukte in ↑[H+]-exponierten T-Zellen wiederherstellte (Abb. 3c, d und erweiterte Daten Abb. 4d), was darauf hindeutet, dass exogenes Methionin vorhanden ist Eine Nahrungsergänzung könnte die Methioninaufnahme und den Metabolismus von ↑[H+]-exponierten T-Zellen wiederherstellen. Als nächstes untersuchten wir, ob eine Methioninrestriktion die T-Zell-Stammfunktion beeinflussen kann. Wir fanden heraus, dass Methioninmangel tatsächlich die Induktion der TCF1+-CD8+-T-Zellpopulation förderte, jedoch keinen Einfluss auf die Expression von CD62L und CD44 hatte (Extended Data Abb. 4e, f). Um die Rolle des Methioninstoffwechsels bei der ↑[H+]-induzierten T-Zell-Stammfunktion weiter zu untersuchen, kultivierten wir T-Zellen mit ↑[H+]-Medium, ergänzt mit Methionin, SAM oder SAH. Der durch extrazelluläre Azidose induzierte Phänotyp der T-Zell-Stammfunktion wurde tatsächlich teilweise durch die Ergänzung mit Methionin oder SAM, nicht jedoch mit SAH, verhindert (Abb. 3e und erweiterte Daten Abb. 4g – i). Intrazelluläres Methionin wird in SAM umgewandelt, ein wichtiger Methylgruppendonor für DNA- und Histonmethylierungsreaktionen (Extended Data Abb. 5a). Daher charakterisierten wir Histonmethylierungsmuster und stellten fest, dass erhöhtes [H+] die gesamten H3K27me3-Spiegel in T-Zellen stark reduzierte, jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die Expression anderer Histonmethylierungsmarker hatte (Abb. 3f und erweiterte Daten Abb. 5b). Wie erwartet stellte die Methionin-Supplementierung von T-Zellen unter ↑[H+]-Exposition das Gesamtniveau der H3K27me3-Expression wieder her (Abb. 3f). Die spezifische Verringerung des H3K27me3-Spiegels, die in T-Zellen beobachtet wurde, die einer Langzeitbehandlung mit ↑[H+] unterzogen wurden, veranlasste uns zu der Hypothese, dass die Exposition mit ↑[H+] die für die Ablagerung von H3K27me3 spezifische Methyltransferase selektiv reguliert. Tatsächlich beobachteten wir eine deutlich verringerte Expression von EZH2, einer Schlüsselmethyltransferase für H3K27me3, sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene in ↑[H+]-exponierten T-Zellen (Extended Data Abb. 5c,d). Darüber hinaus erhöhte die Hemmung der EZH2-Aktivität durch einen hochspezifischen Inhibitor, GSK126, die Expression von TCF1 sowie den Prozentsatz von CCR7+ CD62L+ CD8+ T-Zellen (Extended Data Abb. 5e,f) , was mit einem früheren Bericht übereinstimmte, dass EZH2 das Potenzial von Gedächtnis-T-Zellen durch selektive epigenetische Modifikationen regulieren könnte . Um genomweite Veränderungen in epigenetischen Mustern der ↑[H+]-induzierten T-Zell-Stammfunktion zu identifizieren, führten wir den CUT&Tag-seq-Assay durch und fanden minimale Veränderungen in der Proportionalität der H3K4me3- und H3K27me3-Ablagerung zwischen verschiedenen behandelten Gruppen entlang des Promotors, des Genkörpers und intergene Regionen (Extended Data Abb. 5g). Insbesondere ergab die epigenomische Profilierung einen verringerten Spiegel des repressiven Histonmarkers H3K27me3 an gedächtnisassoziierten Genorten (z. B. TCF7, CCR7, ID3, LEF1 und KLF2) in langfristig mit ↑[H+] behandelten T-Zellen (Abb. 3g). . Wichtig ist, dass die Zugabe von Methionin unter ↑[H+]-Exposition den H3K27me3-Spiegel an den oben genannten Loci sowie deren Genexpression teilweise wiederherstellte, was darauf hindeutet, dass Methionin eine wichtige Rolle bei der epigenetischen Modulation dieser gedächtnisassoziierten Gene spielt (Abb. 3g und). Erweiterte Daten Abb. 5h). In Übereinstimmung mit einer früheren Studie14 erwarben Effektorgene wie PRF1, GZMB, IFNG, TBX21 und NR4A2 günstigerweise ein aktivierendes Histonmethylierungsmuster (H3K4me3hi und H3K27me3lo) (Abb. 3g). Bemerkenswert ist, dass die Besetzung von H3K4me3 in den Promotorregionen dieser Effektorgene in T-Zellen, die unter ↑[H+]-Exposition kultiviert wurden, beeinträchtigt war und durch Methionin-Supplementierung wiederhergestellt wurde (Abb. 3g). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass eine durch ↑[H+] vermittelte Störung des Methioninzyklus die epigenetische Erhaltung der T-Zell-Stammfunktion fördert.

Mehrere Methionintransporter (SLCs), darunter SLC7A5, SLC38A1, SLC38A2 und SLC43A2, können den Methionintransport vermitteln46. Um zu untersuchen, wie die Exposition gegenüber ↑[H+] die Methioninaufnahme und den Metabolismus in T-Zellen verringert, analysierten wir die Expressionsmuster verschiedener SLCs und stellten fest, dass ↑[H+] die Expression von SLC7A5 und SLC38A2 dramatisch herunterregulierte, aber kaum Einfluss auf die SLC38A1-Expression hatte (Erweitert). Daten Abb. 6a,b). Darüber hinaus verringerte die ↑[H+]-Exposition die Expression und Aktivität von MYC (Extended Data Abb. 6c,d), von dem berichtet wurde, dass es die Expression von Methionintransportern wie SLC7A5 reguliert (Lit. 47). Wir haben außerdem eine hohe Belegung von MYC auf dem SLC7A5-Promotor und in geringerem Maße auf dem SLC38A2-Promotor nachgewiesen (Extended Data, Abb. 6e). Wichtig ist, dass in langfristig mit ↑[H+] behandelten T-Zellen eine signifikant verringerte MYC-Bindung an diese Loci beobachtet wurde (Extended Data Abb. 6e). In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen stellte die Überexpression von MYC die Expression von SLC7A5 und SLC38A2 in ↑[H+]-exponierten T-Zellen bemerkenswert wieder her (Extended Data Abb. 6f). Diese Ergebnisse unterstützen die wichtige Rolle von MYC bei der verringerten Expression von Methionintransportern bei ↑[H+]-Exposition. Interessanterweise fanden wir heraus, dass die Supplementierung von Methionin auch die Expression von MYC und SLC7A5 in ↑[H+]-exponierten T-Zellen wiederherstellen kann (Extended Data Abb. 6g), was darauf hindeutet, dass eine Methionin-Supplementierung die Fähigkeit der T-Zellen zur Methioninaufnahme wiederherstellen könnte Hochregulierung der Expression des Methionintransporters SLC7A5 in MYC-abhängiger Weise. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass SLC7A5 der am häufigsten vorkommende Methionintransporter in aktivierten T-Zellen ist47. Zusammen mit unseren früheren Erkenntnissen legt dies nahe, dass SLC7A5 eine wichtige Rolle bei der ↑[H+]-induzierten Methioninrestriktion und der Aufrechterhaltung eines stammähnlichen Zustands spielen könnte. Tatsächlich fanden wir heraus, dass eine Überexpression von SLC7A5 den ↑[H+]-induzierten stammähnlichen Phänotyp teilweise beeinträchtigte (Extended Data Abb. 6h, i), was die Beteiligung des Methionintransporters SLC7A5 am ↑[H+]-induzierten T-Zell-Gedächtnis weiter unterstützt -ähnlicher Phänotyp. Durch die Analyse verschiedener tumorinfiltrierender CD8+-T-Zell-Subpopulationen fanden wir eine verringerte Expression von MYC und SLC7A5 in gedächtnisähnlichen CD8+-TILs (Extended Data Abb. 7a,b), was im Einklang steht mit unseren In-vitro-Ergebnissen. Diese Ergebnisse legen daher nahe, dass die MYC-SLC7A5-Methionin-Achse möglicherweise zur Erhaltung des gedächtnisähnlichen Status von TILs beitragen könnte.

Abb. 2|↑[H+]-Exposition löst eine metabolische Neuprogrammierung aus und unterdrückt die mTOR-Signalisierung. a, GO-Analyse unter Verwendung von RNA-seq-Daten, die repräsentative differentiell exprimierte Stoffwechselgene in Kontroll- und Milchsäure-konditionierten menschlichen T-Zellen zeigt (angepasster P-Wert < 4,23 × 10–2). b, Schematische Darstellung der Markierungsmuster für [13C6]Glucose oder [13C16]Palmitat. c, Prozentsatz des angegebenen m+3-Laktats am gesamten Laktat oder des m+3-Pyruvats am gesamten Pyruvat in T-Zellen. n=3 unabhängige Stichproben. d, Prozentsatz des Isotopomers für die TCA-Zwischenprodukte, wie Citrat (m+2), Malat (m+2) und Succinat (m+2), abgeleitet von [13C6]Glucose. n=3 unabhängige Stichproben. e, Prozentsatz des angegebenen m+2-Acetyl-CoA am gesamten Acetyl-CoA oder des m+2-Citrat-Isotops am gesamten Citrat in T-Zellen aus [13C16]-Palmitat. n=4 unabhängige Stichproben. f, GSEA mit statistischer Analyse des Gensatzes, der mit der mTORC1-Signalübertragung in der Kontrolle im Vergleich zu milchsäurekonditionierten (links) oder pH 6.6-konditionierten (rechts) menschlichen T-Zellen assoziiert ist. g,h, Durchflusszytometrische Analyse und Quantifizierung für S6, phosphoryliert an Ser235 und Ser236 (g), und 4EBP1, phosphoryliert an Thr37 und Thr46 (h), in menschlichen CD8+-T-Zellen unter den angegebenen Bedingungen. n=3 unabhängige Stichproben. I, Durchflusszytometrische Analyse und Quantifizierung der energieintensiven Proteinsynthese in Kontrollen oder milchsäure- oder pH 6.6-konditionierten menschlichen T-Zellen. n=3 unabhängige Stichproben. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Analysen wurden durch den einseitigen exakten Fisher-Test mit dem Benjamini-Hochberg-Mehrfachvergleichstest (a) oder den ungepaarten zweiseitigen Student-t-Test (c–e,g–i) ermittelt. Nominale P-Werte und FDRs wurden mit der Standardmethode in der GSEA-Software (f) berechnet.

Abb. 3|Erhöhtes [H+] verändert den Methioninstoffwechsel der T-Zellen, um die epigenetische Stammzellenfunktion zu erhalten. ein GSEA-Diagramm des Gensatzes, der mit dem Ein-Kohlenstoff-Metabolismus und dem Cystein- und Methionin-Metabolismus in der Kontrolle im Vergleich zu milchsäurekonditionierten menschlichen T-Zellen assoziiert ist. b, Schematische Darstellung der [13C5]Methionin-Markierungsmuster. c, Prozentsatz an intrazellulärem SAM (m+5), SAH (m+4) und MTA (m+1), abgeleitet von [13C5]Methionin, aus ihren jeweiligen Gesamtpools, in T-Zellen, kultiviert unter Kontrollbedingungen oder mit 10 mM Milchsäure oder 10 mM Milchsäure ergänzt mit Methionin (10 mM + Met). n=3 unabhängige Stichproben. d, Relative Häufigkeit von [12C5]Methionin und [13C5]Methionin in T-Zellen. e, Repräsentatives Histogramm und Quantifizierung von TCF1 in menschlichen CD8+-T-Zellen, die unter verschiedenen Bedingungen kultiviert wurden. n=3 unabhängige Stichproben. f, Auswirkungen der Methionin-Supplementierung auf die Histonmethylierung in menschlichen T-Zellen. H3K4me3, an K4 trimethyliertes Histon H3; H3K79me2, H3 dimethyliert bei K79; H3K27me3, H3 trimethyliert an K27; H3K9me2, H3 dimethyliert an K9. n=3 unabhängige Stichproben. g: Genomspuransicht repräsentativer Genorte mit H3K27me3- (rot, oberhalb der Linie) oder H3K4me3-Peaks (blau, unterhalb der Linie). CUT&Tag-seq-Daten stammen aus zwei unabhängigen Stichproben. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Nominelle P-Werte und FDRs wurden mit der Standardmethode der GSEA-Software (a) berechnet. Statistische Analysen wurden mithilfe der Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Mehrfachvergleichstest (c–f) von Tukey durchgeführt.

Die Exposition gegenüber ↑[H+] erhält die mitochondriale Fitness 

Angesichts der verringerten energieintensiven Proteinsynthese in ↑[H+]-konditionierten T-Zellen stellten wir die Hypothese auf, dass eine langfristige Exposition gegenüber ↑[H+] zu erheblichen Veränderungen im zellulären Energiestoffwechsel führen könnte. Sowohl Kontroll- als auch ↑[H+]-konditionierte T-Zellen wurden mit SCENITH42 analysiert, um die Glukoseabhängigkeit, die mitochondriale Abhängigkeit, die glykolytische Kapazität sowie die FAO- und Aminosäureoxidationskapazität zu berechnen (Abb. 4a und erweiterte Daten Abb. 8a). In Übereinstimmung mit unseren Metabolomics- und Isotopenverfolgungsergebnissen beobachteten wir einen erhöhten mitochondrialen Metabolismus in ↑[H+]-exponierten T-Zellen, während die Glykolyseraten verringert waren (Abb. 4b, c und Extended Data Abb. 8b), was auf eine Neuprogrammierung der intrazellulären Zellen hinweist Energiestoffwechsel in ↑[H+]-konditionierten T-Zellen. Die Seahorse-Analyse ergab außerdem, dass ↑[H+]-konditionierte T-Zellen eine höhere Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) sowie SRC zeigten, ein Hauptmerkmal langlebiger Gedächtnis-CD8+-T-Zellen22, und eine niedrigere extrazelluläre Ansäuerungsrate ( ECAR) (Abb. 4d–h und erweiterte Daten Abb. 8c–f). Da eine erhöhte mitochondriale Masse/Fusion und ein verringertes mitochondriales Membranpotential (Δψm) für die Aufrechterhaltung der T-Zell-Stammfunktion wichtig sind48–50, haben wir die Quantität und Qualität der Mitochondrien von ↑[H+]-konditionierten T-Zellen weiter untersucht und festgestellt, dass ↑[H+ ] Die Behandlung erhöhte die mitochondriale Masse sowohl in menschlichen als auch in Maus-T-Zellen (Abb. 4i, j und erweiterte Daten, Abb. 8g, h), die auch ein niedrigeres Δψm beibehalten (Abb. 4k und erweiterte Daten, Abb. 8i). Die Ultrastrukturanalyse mittels Elektronenmikroskopie (EM) ergab, dass ↑[H+]-exponierte T-Zellen im Zytoplasma große, dicht gepackte Mitochondrien und im Vergleich zu Kontroll-T-Zellen viele enge, schmale Cristae aufwiesen, was mit den veröffentlichten Ergebnissen übereinstimmt zur Mitochondrienmorphologie in Gedächtnis-T-Zellen (Abb. 4l, m). In Übereinstimmung mit diesem Befund beobachteten wir auch eine erhöhte Genexpression mehrerer kritischer Regulatoren der Mitochondrienfusion in ↑[H+]-konditionierten T-Zellen (Extended Data Abb. 8j), was vermutlich eine notwendige Rolle für die Bildung von Gedächtnis-T-Zellen spielt50. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Exposition gegenüber ↑[H+] die Masse/Fusion und Fitness der Mitochondrien steigert, um die Bildung stammähnlicher T-Zellen zu fördern.

Cistanche-Pflanze stärkt das Immunsystem

↑[H+]-Exposition steigert die Antitumoraktivität von CD8+-T-Zellen 

Stammähnliche T-Zellen begünstigen die Transplantation, Expansion und Antitumorwirksamkeit bei der adoptiven Immuntherapie51. Um zu untersuchen, ob langfristige in vitro ↑[H+ ]-erhaltene CD8+-T-Zellen beim Transfer eine verstärkte Expansion oder Persistenz zeigen, wurden CD45.1+ OT-I-T-Zellen, die in der Kontroll- oder ↑[ H+]-konditioniertes Medium wurde adoptiv in CD45.2+C57BL/6N-Mäuse ohne implantierten Tumor übertragen (Abb. 5a). Obwohl bei der ↑[H+]-Konditionierung eine leicht erhöhte Anzahl apoptotischer Zellen festgestellt wurde (Extended Data Abb. 9a), gab es einen signifikant höheren Prozentsatz an T-Zellen im peripheren Blut von Mäusen, die mit im ↑[H+]-Zustand expandierten T-Zellen transferiert wurden im Vergleich zu denen, die im Kontrollmedium expandiert wurden (Kontroll-T-Zellen) (Abb. 5b). Ebenso wurden signifikant höhere Häufigkeiten von T-Zellen in der Milz und den Lymphknoten (LNs) festgestellt (Extended Data Abb. 9b, c). Darüber hinaus fanden wir bei Mäusen mit B16-OVA-Tumoren, bei denen ↑[H+]-expandierte Zellen adoptiv übertragen worden waren, im Vergleich zu Mäusen mit B16-OVA-Tumoren eine signifikant erhöhte T-Zell-Akkumulation in Tumoren, Milz und Drainagelymphknoten erhielten Kontrollzellen, was darauf hindeutet, dass in ↑[H+] gehaltene CD8+-T-Zellen eine verbesserte Persistenz aufweisen (Abb. 5c–e und erweiterte Daten Abb. 9d). In Übereinstimmung mit diesen Erkenntnissen war der Prozentsatz an Gedächtnis-T-Zellen in der Milz und den LNs von Mäusen, die ↑[H+]-konditionierte T-Zellen erhielten, signifikant erhöht (Abb. 5f und Extended Data Abb. 9e). Bemerkenswerterweise zeigten ↑[H+]-expandierte OT-I-T-Zellen im Vergleich zu Kontroll-T-Zellen ein deutlich verzögertes Tumorwachstum (Abb. 5g). Als nächstes untersuchten wir die therapeutische Wirksamkeit von ↑[H+]-expandierten CD19-Chimären-Antigen-Rezeptor-modifizierten (CAR) T-Zellen mit einem In-vivo-Tumormodell, bei dem CD19-K562-Tumorzellen subkutan in die Flanken von CD19 injiziert wurden NCG-Mäuse (Abb. 5h). Wir fanden heraus, dass die ↑[H+]-Exposition auch die Stammzellenfunktion von CAR-T-Zellen förderte, jedoch keinen Einfluss auf die Apoptose hatte (Extended Data Abb. 9f), was durch die signifikant erhöhten Prozentsätze von CCR7+ CD62L+ stammähnlichen CAR-T belegt wird Zellen sowie die hochregulierte Expression von TCF1 (Extended Data Abb. 9g, h). Darüber hinaus kam es nach der Infusion mit ↑[H+]-konditionierten T-Zellen zu einer höheren Rate der CAR-T-Zellakkumulation in Tumorstellen und Milzen von NCG-Mäusen (Abb. 5i). Wie erwartet zeigten NCG-Mäuse, die adoptiv mit in ↑[H+] expandierten CAR-T-Zellen transferiert wurden, eine größere Clearance des implantierten CD19+-Tumors im Vergleich zu Mäusen, die expandierte CAR-T-Zellen erhielten im Kontrollmedium (Abb. 5j). Zusammengenommen zeigten diese Daten, dass die Behandlung mit ↑[H+] die In-vivo-Persistenz und die Antitumoraktivität von T-Zellen fördert.

Die Exposition gegenüber ↑[H+] schränkt die Erschöpfung der T-Zellen ein

Um die Auswirkungen einer anhaltenden ↑[H+]-Exposition auf die Erschöpfung von T-Zellen in vitro weiter zu untersuchen, haben wir die LAG-3- und TIM-3-Expression in mit ↑[H+]-primierten menschlichen T-Zellen gemessen, die mehrere Runden durchlaufen haben weitere Stimulation mit Anti-CD3-Antikörpern und wurden in Kontrollmedium konditioniert (Abb. 6a). Wir stellten fest, dass sowohl die LAG-3- als auch die TIM{9}}-Expression in ↑[H+]-exponierten T-Zellen reduziert war (Abb. 6b und erweiterte Daten Abb. 10a), was darauf hindeutet, dass die ↑[H+]-Behandlung zu einer Reduzierung führt Erschöpfung der T-Zellen. Darüber hinaus haben wir herausgefunden, dass eine hohe Methioninkonzentration zu einem Anstieg der Expression von inhibitorischen Markern wie PD-1, LAG-3 und TIM-3 führt, wohingegen eine Behandlung mit einer niedrigen Methioninkonzentration zu einer Erhöhung der Expression von inhibitorischen Markern wie PD-1, LAG-3 und TIM-3 führt Die Methioninkonzentration verringerte die Expression dieser Marker leicht (ergänzende Abbildung 6a – c). Bemerkenswert ist, dass bei langfristiger in vitro ↑[H+]-Exposition die Häufigkeit, mit der TIM-3+ LAG-3+ OT-I-T-Zellen und CD19-CAR-T-Zellen in den Tumoren infiltrierte, deutlich höher war nach adoptivem Transfer reduziert (Abb. 6c – e und erweiterte Daten Abb. 10b), was mit ihrer geringeren Erschöpfung in vitro und einer verbesserten Tumorkontrollkapazität in vivo übereinstimmt. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass langfristig mit ↑[H+] konditionierte T-Zellen sowohl in vitro als auch in vivo eine signifikant verringerte TOX-Expression zeigten (Abb. 6f, g und erweiterte Daten Abb. 10c, d). Wie zuvor beschrieben, können erschöpfte T-Zellen im Allgemeinen in eine vom Vorläufer erschöpfte oder endgültig erschöpfte Untergruppe unterteilt werden, wie durch den TCF1- und TIM-3-Ausdruck52,53 bestimmt. Daher haben wir das Expressionsmuster von TCF1 und TIM-3 in CD45.1+ TILs gemessen und festgestellt, dass die Häufigkeit von TCF1− TIM-3+ im Endstadium erschöpften T-Zellen stark reduziert war, mit a signifikant erhöhter Prozentsatz von TCF1+ TIM-3– Vorläufer-T-Zellen unter ↑[H+]-Konditionierung (Abb. 6h). Darüber hinaus konnten wir eine erhöhte LY108+ TIM-3-Vorläufer-T-Zellpopulation (Extended Data Abb. 10e) sowie eine erhöhte Häufigkeit von IFN- + TNF- + T nachweisen Zellen (Extended Data Abb. 10f), was die Tatsache weiter unterstützt, dass langfristige in vitro ↑[H+]-expandierte, adoptiv übertragene T-Zellen die Erschöpfung begrenzen und die Stammzellen erhalten.

Diskussion

Tumorspezifische ACT ist ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung von Personen mit refraktären Tumoren, die therapeutischen Wirkungen werden jedoch durch eine T-Zell-Dysfunktion im TME weitgehend eingeschränkt. In jüngster Zeit wurde der Vorkonditionierung von T-Zellen mit vorübergehendem Glukosemangel, Glutaminrestriktion oder erhöhtem extrazellulärem Kalium ( ↑[K+ ]) während der In-vitro-Kultur große Aufmerksamkeit geschenkt, um die Stammzellen der T-Zellen zu erhalten und die therapeutischen Ergebnisse zu verbessern54–56. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die Kultivierung von CD8+-T-Zellen unter hohen Konzentrationen von [H+] während des Primings überraschenderweise den Erwerb von T-Zell-Stammeigenschaften und eine erhöhte Resistenz gegen T-Zell-Erschöpfung förderte, was die Antitumorwirkung von deutlich verbesserte adoptiv übertragene T-Zellen.

Eine übermäßige Ansammlung von Milchsäure im TME wird seit langem als Schlüsselfaktor für die Immunflucht des Tumors angesehen. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Milchsäure und das saure TME die zytolytische Aktivität und Zytokinproduktion von CD{{0}}-T-Zellen unterdrücken31–33,57. Im Einklang mit diesen Erkenntnissen stellten wir auch fest, dass eine kurzfristige Exposition gegenüber ↑[H+] in vitro ausreichte, um die Produktion von Effektorzytokinen deutlich zu hemmen, jedoch keinen Einfluss auf die TCF1-Expression oder stammassoziierte Stoffwechselmerkmale hatte. Doch eine Langzeitbehandlung mit ↑[H+] förderte unerwartet die TCF1-Expression und bewahrte den Phänotyp stammähnlicher T-Zellen durch metabolische Reprogrammierung und epigenetische Remodellierung. Die Exposition von T-Zellen gegenüber ↑[H+] nach ihrer vollständigen Aktivierung kann ebenfalls einen stammähnlichen Phänotyp induzieren, wodurch die Möglichkeit ausgeschlossen wird, dass T-Zellen, die einem niedrigen pH-Wert ausgesetzt sind, einfach gegenüber einer Stimulation resistent geworden sind, anstatt einen stammähnlichen Zustand angenommen zu haben. Die physiologische Milchsäurekonzentration im Blut gesunder Personen liegt bei etwa 1,5–3,0 mM, kann im TME jedoch auf 10 mM bis 40 mM ansteigen35,58. Unter Verwendung eines persistenten Anti-CD3/CD28-Stimulationsmodells haben Feng et al. haben kürzlich berichtet, dass eine hohe Konzentration von Natriumlactat die H3K27ac-Spiegel am TCF7-Super-Enhancer-Locus durch die Hemmung der Histon-Deacetylase-Aktivität erhöht, was zu einer erhöhten TCF1-Expression und der Förderung der CD8+-T-Zell-Stammfunktion führt59. Im Gegensatz dazu fanden wir heraus, dass eine langfristige Exposition gegenüber einer relativ geringen Konzentration an Milchsäure (10 mM), nicht aber Natriumlactat, durch die Einschränkung des Methioninstoffwechsels und die Regulierung von H3K27me3 leicht eine stammähnliche Signatur von T-Zellen auslösen kann Ablagerung an stammassoziierten Genorten, was eindeutig eine ausgeprägte epigenetische Regulation durch Natriumlactat und Milchsäure unterstützt. Allerdings hat eine Behandlung mit niedrigem Säuregehalt (pH 6,9) keinen signifikanten Einfluss auf die TCF1-Expression unter anhaltender Anti-CD3/CD28-Stimulation, was darauf hindeutet, dass die stammähnlichen Signaturen von CD8+-T-Zellen, die durch ↑[H+] induziert werden, Die Exposition kann durch die TCR-Stimulation außer Kraft gesetzt werden. Die TCR-Aktivierung kann die Methioninaufnahme verbessern und den Methioninstoffwechsel neu programmieren, um die T-Zell-Aktivierung zu unterstützen19,60. Wir spekulierten, dass die TCR-Stimulation die Aufnahme von Methionin in mit ↑[H+] behandelten T-Zellen verstärken könnte, die einen eingeschränkten Methioninstoffwechsel aufwiesen und daher die durch ↑[H+] induzierte epigenetische Stammzellenstörung störten. Darüber hinaus könnten T-Zellen Laktationen als extrazelluläre Kohlenstoffquelle nutzen, um den Erwerb von Stammzellen in Gegenwart oder Abwesenheit einer anhaltenden TCR-Stimulation zu erleichtern. Die Stoffwechselaktivität ist eng mit der T-Zell-Differenzierung verbunden, und bestimmte Stoffwechseleingriffe können die Bildung langlebiger Gedächtnis-T-Zellen erheblich fördern21,37,61,62. Dementsprechend stützen unsere Metabolomik- und Isotopenverfolgungsanalysen die Annahme, dass eine langfristige ↑[H+]-Exposition zu einer auffälligen metabolischen Neuprogrammierung führt, wie z. B. einer verringerten Glukoseaufnahme und einer verringerten Glykolyse und dem TCA-Zyklus-Metabolismus. Mehrere Studien haben gezeigt, dass CD8+-T-Gedächtniszellen FAO nutzen, um ihren Energiebedarf zu decken, obwohl dies wahrscheinlich eine Anpassung für die Differenzierung der Gedächtnislinien ist und eine Überexpression von Cpt1 die Langlebigkeit von T-Zellen fördert21,22,63,64. In ihrem Modell der T-Zell-spezifischen genetischen Deletion von Cpt1a haben Raud et al. haben kürzlich gezeigt, dass LC-FAO für die Aktivierung von T-Zellen und die Bildung von CD8+-T-Gedächtniszellen weitgehend entbehrlich ist65. Es bleibt eine Herausforderung, eine solche Diskrepanz zu erklären. Im Rahmen unserer Studie spekulieren wir, dass die durch extrazelluläre Azidose bedingte Neuprogrammierung des Fettsäurestoffwechsels wahrscheinlich mit der Bildung von Gedächtnis-T-Zellen zusammenhängt, obwohl der genaue Mechanismus, der dieser Hypothese zugrunde liegt, weiterer Untersuchungen bedarf. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die Exposition gegenüber ↑[H+] die mTOR-Aktivität hemmte, was möglicherweise durch glykolytische Hemmung induziert wird. Insbesondere kann die Unterdrückung der mTOR-Signalübertragung auch zur metabolischen Verlagerung von der Glykolyse zur Mitochondrienatmung beitragen. Tatsächlich zeigten diese ↑[H+]-expandierten T-Zellen eine verbesserte mitochondriale Fitness, was durch eine deutlich erhöhte SRC und mitochondriale Masse sowie ein verringertes Δψm belegt wurde. Diese mitochondrialen Signaturen, die in stammähnlichen T-Zellen angereichert sind und mit Langlebigkeit und überlegener Antitumoraktivität in vivo zusammenhängen, werden durch die mitochondriale Fusions- und Spaltungsdynamik stark moduliert22,48,50. Das mitochondriale Innenmembranfusionsprotein OPA1 spielt eine unverzichtbare Rolle bei der Bildung von Gedächtnis-T-Zellen50. Dementsprechend fanden wir heraus, dass extrazelluläre Azidose auch die OPA1-Expression in T-Zellen förderte, was schließlich zu einem morphologischen Gleichgewicht in Richtung Fusion in T-Zellen führte. Es wurde gezeigt, dass viele zelluläre Metaboliten direkt zu epigenetischen Veränderungen beitragen. Beispielsweise kann der Ein-Kohlenstoff-Metabolismus den universellen Methyldonor SAM für die Histonmethylierung erzeugen66.

Abb. 4|Die mitochondriale Fitness bleibt in T-Zellen erhalten, die ↑[H+] ausgesetzt sind. eine SCENITH-Analyse der menschlichen T-Zellen in Kontroll- oder Milchsäure-konditionierten T-Zellen. Es wird ein repräsentatives Übersetzungsniveau (Anti-Puro) angezeigt (n=3 unabhängige Stichproben). Die gestrichelte Linie stellt den Hintergrundwert dar, der nach der Behandlung mit 2-Desoxy-d-glucose + Oligomycin (2-DG+O) erhalten wurde. b,c, Quantitative Analyse der glykolytischen Kapazität (b) und der mitochondrialen Abhängigkeit (c) innerhalb von a. n=3 unabhängige Stichproben. d–f, OCR (d) von Kontroll- und Milchsäure-konditionierten T-Zellen wurde in Echtzeit unter Basisbedingungen als Reaktion auf die angegebenen Inhibitoren gemessen. FCCP, Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon; ROT/AA, Rotenon und Antimycin A. Repräsentative statistische Analyse der basalen OCR (e), der maximalen Atmung (e) und der SRC (f). n=9 Tests; Es wurden 3 unabhängige Proben analysiert und jede Probe wurde dreimal gemessen. g,h, ECAR (g) von Kontroll- oder Milchsäure-konditionierten T-Zellen, gemessen als Reaktion auf die angegebenen Inhibitoren. Repräsentative statistische Analyse von Basal-ECAR und Stress-ECAR (h). n=9 Tests; Es wurden 3 unabhängige Proben nachgewiesen und jede Probe wurde dreimal gemessen. i, Immunoblot-Analyse von COXIV und TIM23 in menschlichen T-Zellen unter den angegebenen Bedingungen. Als Ladungskontrolle wurde Actin verwendet. j,k, Repräsentative Histogramme oder Konturdiagramme und statistische Analyse der mitochondrialen Masse (MTG) (j) bzw. des mitochondrialen Membranpotentials (TMRM) (k) in der Kontrolle oder Milchsäure oder pH 6.{{30} }konditionierte menschliche T-Zellen. n=3 unabhängige Stichproben. l,m, Repräsentative mitochondriale Morphologie von T-Zellen, die 12 Tage lang unter Kontrollbedingungen, Milchsäure oder pH 6,6 kultiviert wurden, analysiert durch EM (Maßstab, 1 μM) (l). Die Fläche einzelner Mitochondrien in T-Zellen (m), n=45 Zellen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Analysen wurden unter Verwendung des ungepaarten zweiseitigen Student-T-Tests durchgeführt.

Abb. 5|↑[H+]-expandierte T-Zellen zeigen eine erhöhte Antitumoraktivität. a,b: Kontroll- oder Milchsäure-expandierte CD8+-T-Zellen wurden auf Persistenz nach adoptivem Transfer (n=6-Mäuse) analysiert. Frisch isolierte Maus-CD45.1+ OT-I-T-Zellen wurden mit Maus-IL-2 und plattengebundenen Anti-Maus-CD3- und Anti-Maus-CD28-Antikörpern für 2 Tage aktiviert und dann in einem Kulturmedium mit gehalten Maus-IL-2 bis zur adoptiven Übertragung (CD3&CD28+IL-2). Ein Schema des Tierversuchs (a) sowie repräsentative FACS-Diagramme und statistische Analysen von CD45.1+- und CD45.2+-T-Zellen im Blut sind in (b) dargestellt. c–g, CD45.1+ OT-I-T-Zellen wurden 7 Tage lang in Kontroll- oder Milchsäuremedium expandiert und in B16-OVA-tumortragende Mäuse übertragen, und das Infiltrationsverhältnis wurde bewertet (n=5 Mäuse). Ein Schema des Tierversuchs mit B16-OVA-tumortragenden Mäusen (c) sowie repräsentative FACS-Diagramme (links) und Statistiken für die Anzahl (rechts) der übertragenen CD45.1+ OT- I T-Zellen im Tumor (d). sc, subkutane Injektion. Statistiken für den Prozentsatz von CD45.1+ T-Zellen (e) und repräsentative Daten (links) und Statistiken für den Prozentsatz (rechts) von CD62L+ CD44+ CD45.1+ T-Zellen (f ) in der Milz werden angezeigt. Tumorwachstumskurve (g) (n=5 Mäuse, Tag 14). h–j, CD19-CAR-T-Zellen wurden 12 Tage lang in Kontroll- oder Milchsäuremedium expandiert und in CD19-überexprimierende K562-tumortragende NCG-Mäuse übertragen, und das Infiltrationsverhältnis in Tumor und Milz betrug ausgewertet (n=6 Mäuse). Dargestellt sind eine schematische Darstellung des Tierversuchs (h), ein repräsentativer Prozentsatz der übertragenen T-Zellen im Tumor und in der Milz (i) sowie Tumorwachstumskurven (j) (n=6 Mäuse, Tag 10). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Analysen wurden unter Verwendung des ungepaarten zweiseitigen Student-T-Tests durchgeführt.

Abb. 6|↑[H+]-Exposition schränkt die Erschöpfung der T-Zellen ein. a Schematische Darstellung der chronischen Stimulation menschlicher T-Zellen in vitro. b, Repräsentative FACS-Diagramme für LAG-3 und TIM-3 in chronisch stimulierten menschlichen T-Zellen, die unter Kontroll- oder Milchsäurebedingungen kultiviert wurden. n=3 unabhängige Stichproben. c, Die Expression von LAG-3 und TIM-3 in CD45.1+ TILs von B16-OVA-tumortragenden C57BL/6N-Mäusen (n=5 Mäusen ). d, Quantifizierung der Expression von LAG-3, TIM-3 und PD-1 in CD45.1+ TILs aus B16-OVA-tumortragendem C57BL/ 6N Mäuse (n=5 Mäuse). e, Die Expression von LAG-3 und TIM-3 in tumorinfiltrierenden CD19-CAR-T-Zellen von CD19-K562-tumortragenden NCG-Mäusen, bestimmt durch Durchflusszytometrie (n=6 Mäuse). f, Die Expression von TOX in CD45.1+ TILs von B16-OVA-tumortragenden C57BL/6N-Mäusen (n=5 Mäuse). g: Die Histogramme und die statistische Analyse von TOX in tumorinfiltrierenden CD19-CAR-T-Zellen von CD19-K562-tumortragenden NCG-Mäusen (n=6 Mäusen). h, links, repräsentative Durchflusszytometriediagramme für TIM-3 und TCF1 in CD45.1+ TILs von B16-OVA-tumortragenden C57BL/6N-Mäusen (n=5 Mäuse) . Rechts, der Prozentsatz der TCF1+ TIM-3–- oder TCF1– TIM-3+-Populationen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Analysen wurden unter Verwendung des ungepaarten zweiseitigen Student-T-Tests durchgeführt.

Es wurde berichtet, dass Metaboliten wie S-2-Hydroxyglutarat und -Hydroxybutyrat als epigenetische Regulatoren der Differenzierung von Gedächtnis-T-Zellen fungieren67,68. Unsere Ergebnisse zeigten, dass eine dauerhafte ↑[H+]-Behandlung die Methioninaufnahme und den Methioninstoffwechsel einschränkt und durch die Hemmung der Expression von Methionintransportern intrazelluläres Methionin, SAM und SAH verringert. Diese Ergebnisse könnten teilweise erklären, warum T-Zellen nicht in der Lage sind, Tumorzellen um die Methioninaufnahme im TME zu verdrängen69. Mechanistisch haben wir gezeigt, dass die Exposition gegenüber ↑[H+] die MYC-Expression und ihre Bindung an den SLC7A5-Promotor drastisch reduziert, was in der Folge zu einer verringerten SLC7A5-Expression und einem beeinträchtigten Methioninstoffwechsel in T-Zellen führt. Interessanterweise kann eine Methionin-Supplementierung die Expression von MYC und SLC7A5 sowie den Fluss des Methionin-Zyklus in ↑[H+]-exponierten T-Zellen wiederherstellen, was darauf hindeutet, dass die Wiederherstellung der Methionin-Aufnahmefähigkeit wahrscheinlich auf eine Hochregulierung des Methionin-Transporters zurückzuführen ist SLC7A5 in MYC-abhängiger Weise. Es wurde berichtet, dass die mTOR-Aktivität die MYC-Translation reguliert70. Dementsprechend spekulierten wir, dass die durch ↑[H+] induzierte Herunterregulierung von MYC wahrscheinlich auf die Unterdrückung der Translation durch die fortschreitende Hemmung von mTOR und die beeinträchtigte Aufnahme von Methionin zurückzuführen ist. Eine solche Unterdrückung könnte durch eine exogene Methionin-Supplementierung rückgängig gemacht werden, obwohl der genaue Mechanismus weiterer Untersuchungen bedarf. Es wurde angenommen, dass aus dem Methioninzyklus stammendes SAM die Histonmethylierung und den epigenetischen Umbau während der Differenzierung von Effektor-T-Zellen vermittelt8,71. In Übereinstimmung mit der Abnahme des intrazellulären SAM in ↑[H+]-expandierten T-Zellen stellten wir fest, dass sowohl die Gesamthäufigkeit von H3K27me3 als auch seine Besetzung am Promotor von T-Zell-Stammorten stark reduziert waren. H3K27me3 und H3K4me3 werden selektiv in einer Weise modifiziert, die mit der Expression von Genen korreliert, die für das Effektor- oder Stammprogramm von T-Zellen von zentraler Bedeutung sind14. Tatsächlich gab es in ↑[H+]-expandierten T-Zellen eine geringere Anreicherung von H3K4me3 innerhalb der Effektor-Gen-Promotoren. Somit führen die verringerten Mengen an Methyldonor-SAM, die aus einer beeinträchtigten Methioninaufnahme und einem beeinträchtigten Metabolismus unter der Bedingung ↑[H+] resultieren, zu epigenetischen Veränderungen, die letztendlich die T-Zell-Differenzierung in den Gedächtnisstatus begünstigen. Interessanterweise rettet die Zugabe von Methionin unter ↑[H+]-Exposition nicht nur die Expression von MYC und SLC7A5 in ↑[H+]-exponierten T-Zellen, sondern stellt auch das Gesamtniveau der H3K27me3-Expression wieder her, was eine wichtige Rolle von MYC–SLC7A5 unterstützt –Methionin-Stoffwechselachse bei der Regulierung der ↑[H+]-induzierten epigenetischen Stammzellenfunktion. Tatsächlich fanden wir heraus, dass eine Überexpression von SLC7A5 den ↑[H+]-induzierten Stammzellen-ähnlichen Phänotyp teilweise beeinträchtigte, was die entscheidende Rolle des Methionintransporters SLC7A5 beim Erwerb des T-Zell-Gedächtnis-ähnlichen Phänotyps unter ↑[H+]-Exposition weiter unterstützt.

Historisch wurde angenommen, dass die meisten TILs aufgrund der kontinuierlichen TCR-Exposition in Tumoren erschöpft sind, aber paradoxerweise behält eine kleine Untergruppe von T-Zell-Klonotypen in TILs, die den Transkriptionsfaktor TCF1 exprimieren, stammzellähnliche Eigenschaften bei. Unsere Ergebnisse zeigten, dass ↑[H+]-Exposition die T-Zell-Effektorfunktion ausgleicht und die T-Zell-Stammfunktion über die MYC-SLC7A5-Methionin-Stoffwechselachse bewahrt, was eine mögliche Erklärung für das aktuelle Paradoxon liefert, warum ein kleiner Teil der TILs immer noch Stammzellen enthält. wie Gedächtnis- oder Vorläufereigenschaften. Tatsächlich wurde über ähnliche Ergebnisse berichtet, wonach Kaliumionen im TME eine doppelte Rolle bei der Beeinflussung sowohl der T-Zell-Effektorfunktion als auch der Stammzellfunktion spielen56,72, was die komplexen Wirkungen immunsuppressiver TME-Faktoren (z. B. chronische TCR-Stimulation, Hypoxie und niedrige…) weiter unterstützt Glukose) auf die T-Zell-Funktion und -Differenzierung. Darüber hinaus sind die sauren Regionen innerhalb von Tumoren hochdynamisch und sowohl räumlich als auch zeitlich reguliert, und die Fitness von T-Zellen, die an die extrazelluläre Azidose angepasst sind, wird wahrscheinlich in den Schatten gestellt, wenn sie auf andere aggressive TME-Faktoren treffen, die die intratumorale T-Zell-Effektorfunktion und -Differenzierung beeinträchtigen können. Darüber hinaus beobachteten wir eine höhere Expression von MYC in T-Zellen mit terminaler Erschöpfung (LY108− TIM-3+) als in T-Zellen mit erschöpftem Vorläufer (LY108+ TIM-3–). im Einklang mit früheren Berichten, dass MYClo-T-Zellen bevorzugt das Gedächtnisschicksal übernehmen73. In Übereinstimmung mit der verminderten SLC7A5-Expression und Methioninaufnahme in ↑[H+]-exponierten T-Zellen war die Expression von SLC7A5 auch in der LY108+ TIM-3-Vorläufer-erschöpften T-Zellpopulation innerhalb von Tumoren signifikant reduziert. Dies legt nahe, dass die MYC-SLC7A5-Methionin-Regulationsachse auch in vivo funktionieren könnte. Es ist nun offensichtlich, dass weniger differenzierte stammähnliche Gedächtnis-T-Zellen aufgrund ihrer Langzeitpersistenz und Resistenz gegen die Entwicklung von Funktionsstörungen überlegene antitumorale therapeutische Wirkungen haben51,74. Wir haben hier überzeugende Beweise dafür geliefert, dass langfristig ↑[H+]-konditionierte CD8+-T-Zellen in vivo eine erhöhte Persistenz und eine überlegene Antitumorfähigkeit zeigten, mit einer reduzierten Population tödlich erschöpfter T-Zellen (TCF1− TIM{ {39}} ) und eine erhöhte Untergruppe stammähnlicher Vorläufer (TCF1+ TIM-3– ) innerhalb von Tumoren. Zusammenfassend liefert unsere vorliegende Studie Einblicke in die multidimensionalen Auswirkungen der ↑[H+]-Exposition auf die Unterdrückung der T-Zell-Effektorfunktion und ihren gleichzeitigen Einfluss auf die T-Zell-Stammfunktion.

Methoden

Mäuse und Zelllinien

Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Suzhou Institute of Systems Medicine (ISM-IACUC-0151-R) durchgeführt und die Tiere wurden in speziellen pathogenfreien Mäuseeinrichtungen gehalten. Die Mäuse wurden unter Standardbedingungen gehalten, mit 12-h/12-h Licht-/Dunkelzyklen und einer kontrollierten Temperatur von 22–24 Grad und einer Luftfeuchtigkeit von 60%, mit uneingeschränkter Nahrung und Wasser Verfügbarkeit und wurden täglich überprüft. Alle Tumorbelastungen überstiegen nicht die vom Institutional Animal Care and Use Committee des Suzhou Institute of Systems Medicine genehmigte Erlaubnis. CD45.1+ weibliche transgene OT-I-TCR-Mäuse auf einem C57BL/6N-Hintergrund wurden zusammen gehalten. CD45.2+ weibliche C57BL/6N-Mäuse im Alter von 6–8 Wochen wurden als Empfänger vom Vital River gekauft. Weibliche NCG-Mäuse (NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt) im Alter von 6–8 Wochen wurden von GemPharmatech gekauft. Für ein unabhängiges In-vivo-Experiment wurden die CD45.1+- und CD45.2+-Mäuse (6–12 Wochen) geschlechtsangepasst. HEK-293T-Zellen aus der American Type Culture Collection (ATCC) wurden in DMEM-Medium gehalten, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt war. Die Maus-Melanomzelllinie B16 von ATCC wurde zur Expression von OVA transduziert und in DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin, gehalten. K562-Zellen von ATCC wurden transduziert, um menschliches CD19 zu exprimieren, und in RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin, 1 % GlutaMAX, 0,1 M HEPES, 1 % nicht-essentieller Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat und 50, kultiviert μM-Mercaptoethanol. Alle oben genannten Reagenzien wurden von Gibco bezogen.

Isolierung, Aktivierung und retrovirale Transduktion primärer T-Zellen

Maus-CD{{0}}-T-Lymphozyten wurden aus der Milz von 6–12 Wochen alten männlichen oder weiblichen OT-I-Mäusen mithilfe eines CD8-naiven T-Zell-Isolationskits (BioLegend) isoliert und in RPMI kultiviert.{{5} } Medium, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren, 1 % GlutaMAX, 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 M HEPES und 50 μM -Mercaptoethanol in Gegenwart von Maus-IL -2 (20 U/ml, Peprotech). Für ein unabhängiges In-vitro-Experiment wurden die verwendeten männlichen und weiblichen Mäuse (6–12 Wochen) geschlechtsangepasst. Gereinigte Zellen wurden 48 Stunden lang durch Anti-Maus-CD3-Antikörper (2 µg/ml, BioLegend) und Anti-Maus-CD28-Antikörper (1 µg/ml, BioLegend) aktiviert. Menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) von gesunden Spendern wurden von Sailybio gekauft und in RMPI-1640-Medium, ergänzt mit 5 % Humanserum AB (Gemini), 1 % Penicillin-Streptomycin, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren, kultiviert. 1 % GlutaMAX, 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 M HEPES und 50 μM -Mercaptoethanol in Gegenwart von menschlichem IL-2 (100 U/ml, Peprotech). Monoklonale Anti-Human-CD3-Antikörper (1 µg/ml, BioLegend) und Anti-Human-CD28-Antikörper (1 µg/ml, BioLegend) wurden verwendet, um PBMCs drei Tage lang zu aktivieren. Gereinigte Maus- und menschliche T-Zellen wurden unter den angegebenen Kulturbedingungen aktiviert und vermehrt: pH 7,4, pH 6,6, Milchsäure (Sangon) oder Natriumlactat (Sangon). Die folgenden Metaboliten wurden zur Ergänzung des Mediums mit pH 6,6 oder Milchsäure (10 mM) verwendet: Methionin 800 μM (MCE), SAM 100 μM (MCE) oder SAH 100 μM (Sigma). Für die Virustransduktion wurden 1 × 106 PBMCs pro Well in 24-Well-Platten aktiviert. Nach 48 Stunden Aktivierung wurde der Großteil des Mediums durch einen nicht konzentrierten retroviralen Überstand mit 10 µg/ml Polybren (Santa Cruz) ersetzt. Nach 90-minütiger Zentrifugation bei 600 g und 30 Grad wurden die Zellen 24 Stunden lang mit frischem Medium im Inkubator kultiviert. Die Transduktion wurde 24 Stunden später wiederholt und dann zur Kultivierung in ein frisches Medium zurückgeführt. Zur Quantifizierung der Infektionseffizienz wurde der Low-Affinity-Nerven-Wachstumsfaktor-Rezeptor (LNGFR) verwendet.

Durchflusszytometrie

Die Zellen wurden mit fluoreszierenden Antikörpern angefärbt und dann mittels Durchflusszytometrie analysiert. Zur Oberflächenmarkierungsfärbung wurden die Zellen mit fluoreszierend konjugierten Antikörpern und dem Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit (Invitrogen) in FACS-Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 2 % FBS) gefärbt und dann mit 2 % Paraformaldehyd (Casmart) fixiert. für 20 Min. bei Raumtemperatur. Zur intrazellulären Färbung von Phosphoproteinen wurden vorgefärbte Zellen mit einem Fixierungspuffer (BioLegend) fixiert und dann mit phosphospezifischen Antikörpern in einem Permeabilisierungspuffer (Invitrogen) gefärbt. Zum Nachweis intrazellulärer Zytokine wurden die Zellen 4,5 Stunden lang mit Phorbolmyristatacetat (PMA) in Gegenwart von Brefeldin A (BFA) (BioLegend) stimuliert. Anschließend wurden die vorgefärbten Zellen fixiert und mit Zytokin-Antikörpern in einem Permeabilisierungspuffer gefärbt. Für die intrazelluläre Transkriptionsfaktorfärbung wurden die Zellen mit Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit und fluoreszierend konjugierten Antikörpern in FACS-Puffer vorgefärbt, um Oberflächenmarker nachzuweisen. Die Zellen wurden dann 30 Minuten lang auf Eis mit FOXP3/Transkriptionsfaktor-Fixierungspuffer (Invitrogen) fixiert und mit Transkriptionsfaktor-Antikörpern in Permeabilisierungspuffer angefärbt. Nach der Färbung wurden die Zellen zur Durchflusszytometrie in FACS-Puffer resuspendiert. Durchflusszytometriedaten wurden von BD LSR Fortessa und BD FACSDiva (v8.0.2) gesammelt und mit der Software FlowJo (v10.4) analysiert. Repräsentative Gating-Strategien finden Sie in der erweiterten Datenabbildung 10b.

RNA-Sequenzierung

Die RNA-seq-Analyse wurde unter Verwendung von 12-Tag-expandierten T-Zellen durchgeführt, die unter den angegebenen Bedingungen kultiviert wurden, wie in Abb. 1a gezeigt. Kurz gesagt, 12 Tage nach der T-Zell-Expansion wurde die Gesamt-RNA durch Homogenisierung in TRIzol (Takara) und Einfrieren in RNase-freien Röhrchen mit flüssigem Stickstoff extrahiert. Die RNA-Integrität wurde mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent) bewertet. Die Bibliotheken wurden mit dem TruSeq RNA Sample Prep Kit (FC-122-1001, Illumina) erstellt. Anschließend wurden die Bibliotheken mit einer Illumina NovaSeq 6000 (PE150)-Plattform sequenziert und etwa 40 Millionen Paired-End-Reads generiert (Novogene). Die Rohlesezahlen wurden extrahiert und dann mithilfe von DESeq2 (v1.28.1) durch ihre Bibliotheksgrößenfaktoren normalisiert. Die regulierte Logarithmustransformation (r-log) wurde verwendet, um die Varianz über die Stichproben hinweg zu stabilisieren. Die GO- und KEGG-Signalweganreicherungsanalyse unterschiedlich exprimierter Gene wurde mit dem Clusterprofil (v3.16.0) durchgeführt. Ausdrucks-Heatmaps wurden mit dem R-Paket „pheatmap“ (v1.0.12) generiert. GSEA v.4.0 wurde für die GSEA-Analyse verwendet.

CUT&Tag-seq

CUT&Tag-seq wurde wie zuvor beschrieben75 unter Verwendung des Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit für Illumina (TD903, Vazyme) durchgeführt. Kurz gesagt, menschliche T-Zellen wurden 12 Tage lang unter Kontrollbedingungen, Milchsäure oder Milchsäure mit 800 μM Methionin, expandiert. Anschließend wurden 1 × 105 T-Zellen zur Extraktion von Nukleinsäurematerialien lysiert und mit ConA-Kügelchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden in 50 µL Antikörperpuffer, vorgemischt mit Primärantikörper (Anti-H3K27me3 oder Anti-H3K4me3), resuspendiert und über Nacht bei 4 Grad inkubiert. Die Proben wurden mit dem Sekundärantikörper 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 1 Stunde lang mit der Protein A/G-Tn5-Transposase bei Raumtemperatur co-inkubiert, um die DNA-Fragmentierung zu stören. Gereinigte DNA wurde für die Bibliotheksvorbereitung verwendet und mit dem Sequenzer PE150 von Illumina Nova6000 sequenziert.

CUT&Tag-seq-Analyse

FastQC (v{{0}}.11.4) (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) wurde verwendet, um die Lesequalität der Sequenzierung zu überprüfen. Die Lesequalität wurde mithilfe von trimmomatic (v0.39) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) auf einen Phred-Mindestwert von 20 getrimmt. . Alle von CUT&Tag-seq von H3K27me3 und H3K4me3 erzeugten Lesevorgänge wurden mithilfe von Bowtie2 (v2.2.8) (https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) mit den Optionen –local– auf das menschliche Genom hg38 ausgerichtet. very-sensitive-local–no-unal–no-mixed–no-discordant–phred33 -I 10 -X 700. Die Proben ohne Spike-in-DNA wurden mit der ChIPseqSpikeInFree-Methode normalisiert neuartige Normalisierungsmethode zur effektiven Bestimmung von Skalierungsfaktoren für Proben bei verschiedenen Erkrankungen und Behandlungen76. Für H3K27me3 wurden Peaks mit MACS2 (v2.2.6) (https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_peak_calling_macs aufgerufen .html) mit den Optionen „-g hs -f BAMPE–keep-dup all– broad–broad-cutoff 0.1“. Für H3K4me3 verwendete Peak Calling MACS2 mit den Parametern „-g hs -q 0.01 -f BAMPE–keep-dup all“. Peaks wurden mit ChIPseeker (v1.22.1) (https://guangchuangyu.github.io/software/ChIPseeker/) kommentiert und Visualisierungen wurden mit deepTools (v3.5.1) (https://deeptools.readthedocs.io/en) erstellt /develop/) und pyGenomeTracks (v3.7) (https://pygenometracks.readthedocs.io/en/latest/).

qRT–PCR

Die Gesamt-RNA wurde mit TRIzol (Takara) isoliert und mit HiScript Reverse Transcriptase (Vazyme) gemäß den Anweisungen des Herstellers revers in cDNA transkribiert. Für die quantitative Echtzeit-PCR wurden das ABI Prism 7500 Echtzeit-PCR-System (Thermo Fisher) und 2×SYBR Green qPCR Master Mix (Bimake) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Als interner Standard wurde ACTB verwendet. Die relative Expression der mRNA wurde mit der 2−ΔΔCT-Methode berechnet. Die für qPCR verwendeten Primersequenzen finden Sie in der Ergänzungstabelle 1.

Western Blot

Zur Proteinexpressionsanalyse wurden Zellen gesammelt und mit kaltem PBS gewaschen und das Gesamtprotein wurde mit 1 % SDS (Sangon) auf Eis extrahiert. Die Proteinkonzentration wurde mit einem BCA-Protein-Assay-Kit (Merck) gemessen. Proteinproben wurden durch SDS-PAGE-Gele aufgetrennt und dann auf PVDF-Membranen (Millipore) übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % fettfreier Milch in PBS, das Tween20 enthielt, blockiert. Nach dem Blockieren wurden die Membranen mit Primärantikörpern über Nacht bei 4 Grad und HRP-gekoppelten Sekundärantikörpern 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das HRP-Signal wurde durch Elektrochemilumineszenz (ChemeMINI610) entwickelt und von Sage Capture (v2.19.12) gesammelt. Die Datenanalyse wurde mit der Software ImageJ (v1.8.0) durchgeführt.

Analyse der mitochondrialen Morphologie

In jeder Vertiefung von {{0}}Well-Platten wurden PBMCs 3 Tage lang durch menschliche Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörper aktiviert und 12 Tage lang in RPMI-1640-Medium unter verschiedenen Bedingungen kultiviert. Dann wurden 1 × 106 PBMCs gesammelt und über Nacht bei 4 Grad in einem vorgekühlten Fixierungspuffer (2,5 % Glutaraldehyd, 0,1 M Phosphatpuffer (PB), pH 7,4) fixiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen 2 Stunden lang in 1 % Osmiumtetroxid in PBS nachfixiert, dehydriert und gemäß dem Standardverfahren in Spurr-Harz eingebettet. Ultradünne Schnitte wurden mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt. Die mitochondriale Morphologie wurde mithilfe der Hitachi HT-7800-Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) (v01.20) und der AMT-XR81DIR-Kamera abgebildet.

Antikörper und Reagenzien

Die für die durchflusszytometrische Analyse verwendeten Antikörper waren wie folgt. APC Anti-Human NGFR (Kat.-Nr. 345108, 1:1,000 für FACS), FITC Anti-Human CD4 (Kat.-Nr. 357406, 1:200 für FACS), Pacific Blue Anti-Human CD8 (Kat.-Nr. 300928, 1:200 für FACS), APC-Cy7 Anti-Human/Maus CD44 (Kat.-Nr. 103028, 1:200 für FACS), PE Anti-Human CCR7 (Kat.-Nr. 353204, 1 :200 für FACS), PE-Anti-Human-TNF- (Kat.-Nr. 502909, 1:200 für FACS), PE-Cy7-Anti-Human-CD45RO (Kat.-Nr. 304230, 1:200 für FACS), APC-Anti- humanes IFN- (Kat.-Nr. 502512, 1:200 für FACS), PE-Cy7-Anti-Human-LAG-3 (Kat.-Nr. 369310, 1:200 für FACS), PE-Anti-Human-TIM{{ 52}} (Kat.-Nr. 345006, 1:200 für FACS), BV711 Anti-Human PD-1 (Kat.-Nr. 329928, 1:200 für FACS), Percp-Cy5.5 Anti-Human CD62L (Kat.-Nr. 304824, 1:200 für FACS), APC Anti-Human-CD27 (Kat.-Nr. 302810, 1:200 für FACS), BV711 Anti-Maus-CD8 (Kat.-Nr. 100748, 1:200 für FACS). ), PE-Cy7 Anti-Maus CD62L (Kat.-Nr. 104418, 1:200 für FACS), APC-Cy7 Anti-Maus CD45.2 (Kat.-Nr. 830789, 1:200 für FACS), Pacific Blue Anti- Maus CD45.1 (Kat.-Nr. 110722, 1:200 für FACS), APC Anti-Maus Ly108 (Kat.-Nr. 110722, 1:200 für FACS) NEIN. 134610, 1:200 für FACS), PE Anti-Maus-LAG-3 (Kat.-Nr. 125207, 1:200 für FACS), Alexa Fluor 488 Anti-c-MYC-Antikörper (Kat.-Nr. 626811, 1 :200 für FACS), PE-Anti-Maus-TNF- (Kat.-Nr. 506306, 1:200 für FACS) und APC-Anti-Maus-IFN- (Kat.-Nr. 505810, 1:200 für FACS) wurden von BioLegend erworben . Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit, PerCP-eFluor710 Anti-Maus-PD-1 (Kat.-Nr. 46-9981-82, 1:200 für FACS), PE-Phosphor-S6 (Ser235/236) (Kat . Nr. 12-9007-42, 1:200 für FACS), PE Anti-Mensch/Maus TOX (Kat. Nr. 12-6502-82, 1:200 für FACS) und PE-Cy7 Anti-Maus TIM{ {149}} (Kat.-Nr. 25-5870-82, 1:200 für FACS) wurden von Thermo Fisher gekauft. Alexa Fluor 647 anti-TCF1 (Kat.-Nr. 6709, 1:200 für FACS) und Phosphor-4E-BP1 (Thr37/46) (Kat.-Nr. 2846, 1:200 für FACS) wurden von erworben Zellsignaltechnologie. Alexa Fluor 647 Anti-Puromycin (Kat.-Nr. MABE343-AF647, 1:800 für FACS) wurde von Merck gekauft. Die für Western Blots verwendeten Antikörper waren wie folgt. Kaninchen-Anti-Phospho-Akt (Ser473) (Kat.-Nr. 4060, 1:1, 000 für IB), Anti-Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (Kat.-Nr. 3033, 1:1 ,000 für IB), Anti-c-MYC (Kat.-Nr. 18583, 1:1,000 für IB), Anti-EZH2 (Kat.-Nr. 5246, 1:1,{ {200}} für IB), Anti-Tri-Methyl-Histon H3 (Lys27) (Kat.-Nr. 9733, 1:1,000 für IB), Anti-Tri-Methyl-Histon H3 (Lys4) (Kat.-Nr. 9751, 1:1,000 für IB), Anti-Dimethylhiston H3 (Lys9) (Kat.-Nr. 4658, 1:1,000 für IB) , Anti-Dimethyl-Histon H3 (Lys79) (Kat.-Nr. 5427, 1:1,000 für IB), Anti-Histon H3 (Kat.-Nr. 9715, 1:1,{{242 }} für IB), Anti-COXIV (Kat.-Nr. 850, 1:1,000 für IB), Anti-Kaninchen-IgG (HRP-gebunden) (Kat.-Nr. 7074, 1:2,{ {253}} für IB) und Anti-Maus-IgG (HRP-verknüpft) (Kat.-Nr. 7076, 1:2, 000 für IB) wurden von Cell Signaling Technology erworben. Maus-Anti-Tim23 (Kat.-Nr. 611223, 1:1, 000 für IB) stammte von BD Biosciences. Maus-Anti-- -Actin (Kat.-Nr. 66009-1-Ig, 1:5, 000 für IB), Anti-SLC7A5 (Kat.-Nr. 67951-1-Ig, 1: 1,000 für IB) und Kaninchen-Anti-SLC38A1 (Kat.-Nr. 12039-1-AP, 1:1,000 für IB) stammten von Proteintech. Kaninchen-Anti-SLC38A2 (Kat.-Nr. BMP081, 1:1, 000 für IB) wurde von Medical & Biological Laboratories gekauft.

T-Zell-Stoffwechseltest

Um die BODIPY FL C16-Aufnahme in Kontroll- oder ↑[H+]-behandelten T-Zellen zu überprüfen, wurden T-Zellen 1 Stunde lang mit frisch gelöstem 1 μM BODIPY FL C16 (Invitrogen) kultiviert und dann vor der Oberflächenfärbung zweimal mit PBS gewaschen. Um die Stoffwechselabhängigkeit in verschiedenen Behandlungsgruppen weiter zu untersuchen, wurden Experimente mit der SCENITH-Methode (Single Cell Energy Metabolic by Profiling Translation Inhibition)42 durchgeführt. Kurz gesagt, T-Zellen wurden in Platten mit 96--Wells mit 1 × 106 Zellen/ml ausgesät. Anschließend wurden die Zellen mit Kontrolle (Strg), 2-Desoxy-d-glucose (Endkonzentration 100 mM), Oligomycin (Endkonzentration 5 μM) oder einer Mischung der Inhibitoren in den Endkonzentrationen 40 Minuten lang bei 37 °C behandelt Grad . Puromycin (Endkonzentration 10 µg/ml) wurde während der letzten 30 Minuten zugegeben. Nach der Puromycin-Behandlung wurden die Zellen mit kaltem PBS gewaschen und mit Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit und Antikörpern gegen Oberflächenmarker vorgefärbt. Auf die Färbung von intrazellulärem Puromycin folgte der Färbeprozess für intrazelluläre Transkriptionsfaktoren.

Stoffwechselanalyse mit LC-MS/MS

Die Stoffwechselanalyse und die Probenentnahme wurden wie in früheren Berichten77 durchgeführt. Kurz gesagt, PBMCs wurden einzeln in 24-Well-Platten durch menschliches Anti-CD3/CD28 für 3 Tage aktiviert und bis zum 12. Tag in RPMI 1640-Medium mit Kontrolle oder Milchsäure kultiviert. Dann 8 × 106 Zellen pro Probe (n=4 unabhängige Proben pro Gruppe) wurden gesammelt und zur Zentrifugation bei 300 g für 5 Minuten bei 4 Grad und dann in ein 1,{12}ml-Röhrchen überführt mit kaltem PBS gewaschen. Nach erneuter 5-minütiger Zentrifugation bei 300 g wurde 80 % kaltes Methanol zugegeben und kräftig gewirbelt, um das Zellpellet vollständig aufzubrechen, und dann wurden die Zellen in einen Gefrierschrank bei –80 Grad überführt. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 4 Grad und 12,000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt. Abschließend wurden die Extrakte lyophilisiert und mittels UHPLC-MS/MS in Novogene analysiert. Die durch UHPLC-MS/MS generierten Rohdatendateien wurden mit dem Compound Discoverer (v3.1, Thermo Fisher) verarbeitet, um für jeden Metaboliten eine Peakausrichtung, Peakauswahl und Quantifizierung durchzuführen. Für die weitere Datenanalyse wurde die Software Metaboanalyst (v5.0) verwendet und anschließend wurden signifikant angereicherte Pfade mit P < 0,05 ausgewählt.

Experimente zur Markierung stabiler Isotope

Der 13C-Stoffwechselfluss wurde an T-Zellen mit zuvor beschriebenen Methoden60,78,79 durchgeführt. Kurz gesagt, PBMCs wurden pro Well in 24-Well-Platten mit humanem Anti-CD3/CD28 für 3 Tage aktiviert, wie oben beschrieben. Für die [13C6]-Glukoseverfolgung wurde das Medium nach 11 Tagen auf glukosefreies RPMI (Gibco) umgestellt, ergänzt mit 10 % dialysiertem FBS (Thermo Fisher Scientific), 1 % Penicillin-Streptomycin, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren, 50 μM -Mercaptoethanol und 0,1 M HEPES, enthaltend 11 mM [13C6]Glucose (Cambridge Isotope Laboratories) mit Kontrolle oder 10 mM Milchsäure, für 24 Stunden. Für die [13C16]Palmitat-Nachverfolgung wurden 2 × 107 T-Zellen aktiviert und am 12. Tag in ein fertiges Medium mit Kontroll- oder 10 mM Milchsäurebedingungen wie oben beschrieben gegeben, das 200 μM [13C16]Palmitat (Cambridge Isotope Laboratories) enthielt, für 8 H. Für die [13C5]Methionin-Nachverfolgung wurden T-Zellen 12 Tage lang unter kontrollierten Bedingungen mit Milchsäure oder Milchsäure mit 800 μM Methionin expandiert. Dann wurden 4 × 107 T-Zellen auf methioninfreies vollständiges RPMI-Medium (Gibco) umgestellt und unter Kontrollbedingungen, Milchsäure oder mit Methionin ergänzter Milchsäure (enthaltend 100 μM, 100 μM oder 800 μM [13C5]Methionin) kultiviert. (Cambridge Isotope Laboratories), für 8 Stunden. Die jeweiligen Überstände wurden gesammelt und dann bei –80 Grad gelagert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (300 g, 4 Grad, 5 Minuten) pelletiert, zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 Grad gelagert. Die Metaboliten wurden mit eiskaltem 80 %igem Methanol in HPLC-Qualität extrahiert und kurz verwirbelt, gefolgt von der Zugabe von 200 ml Wasser in HPLC-Qualität und dann 500 ml Chloroform in HPLC-Qualität (Verhältnis Methanol:Wasser:Chloroform, 5:2:5). ). Die Mischung wurde verwirbelt und zentrifugiert, um eine Phasentrennung zu erreichen. Die Überstände wurden zur anschließenden Derivatisierung durch Vakuumschleudern getrocknet und dann mit 2 % (Gew./Vol.) Methoxyaminhydrochlorid (226904, Sigma-Aldrich) in Pyridin für 60 Minuten bei 37 Grad inkubiert und durch N-Methyl-N-( tert-Butyldimethylsilyltrifluoracetamid mit 1 % tert-Butyldimethylchlorsilan (TBDMS, 18162-48-6, Regis Technologies) für 30 Minuten bei 45 Grad. Die [13C6]Glucose-Derivate wurden mittels GC-HRMS, dem Gaschromatographen Trace 1310 (Thermo Fisher) mit der DB–35MS-Säule (Agilent Technologies) und dem Q Exactive GC Orbitrap GC–MS/MS-System (Thermo Fisher) analysiert. GC-MS/MS-Metabolomics-Assays wurden von Metabo-Profile durchgeführt. Die Metaboliten wurden mit Xcalibur (v4.1) und TraceFinder (v5.1) (Thermo Fisher) identifiziert und quantifiziert, einschließlich Retentionszeit, Ladungs-zu-Masse-Verhältnis der Ionenfragmente und Peakintensität. Die [13C16]Palmitat- und [13C5]Methionin-Derivate wurden mittels Ultrahochdruckflüssigkeitschromatographie-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (UPLC-TQMS) analysiert. Die Rohdaten von UPLC-TQMS wurden mit der MassLynx-Software von Waters (v4.1, Waters) zur Peakextraktion, Integration, Identifizierung und Quantifizierung der Metaboliten analysiert. Für die anschließende statistische Analyse wurde die Sprache R (v4.1.1) verwendet.

B16-Tumormodell und adoptive Zelltransfer-Immuntherapie

Um die Antitumoraktivität von T-Zellen in vivo zu untersuchen, wurden 0,2 × 106 B16-OVA-Melanomzellen subkutan in weibliche C57BL/6N-Mäuse injiziert. Neun Tage nach der Tumorimplantation wurden Mäusen intravenös 5 × 106 T-Zellen von weiblichen OT-I-Mäusen injiziert, die sieben Tage lang unter verschiedenen Bedingungen expandiert wurden. Tumortragende Mäuse erhielten vor der ACT eine subletale Bestrahlung mit 5 Gy. Die Tumorfläche wurde alle 2 Tage gemessen und als Länge (mm) × Breite (mm) berechnet. Mäuse mit einer Tumorfläche von annähernd 300 mm2 wurden eingeschläfert. Um die Persistenz expandierter T-Zellen unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen, wurden 4 × 106 CD45.1+ T-Zellen von weiblichen OT-I-Mäusen adoptiv in weibliche C57BL/6N-Mäuse übertragen. Eine Woche später wurden die Mäuse eingeschläfert und die Zellen aus isoliertem Blut, Milz und Lymphknoten wurden gezählt. Der Anteil der übertragenen T-Zellen wurde durch Gating auf T-Zellen, die CD45.1+ und CD45.2+ exprimieren, mittels Durchflusszytometrie bestimmt.

NCG-Mäusemodell und CD19-CAR-T-Therapie

Weiblichen NCG-Mäusen wurden 1 × 106 CD19-K562-Zellen subkutan implantiert. Als das Tumorvolumen 75 mm3 erreichte, erhielten die Mäuse 5 × 106 nicht-transduzierte T-Zellen und CD19-CAR-T-Zellen, kultiviert in Kontrollmedium oder 10 mM milchsäurehaltigem Medium. Das Tumorwachstum wurde alle 2 Tage mit elektronischen Messschiebern gemessen und anhand der Länge (mm) × Breite (mm) berechnet. Mäuse mit einer Tumorfläche von mehr als 300 mm2 wurden eingeschläfert. Die Tumoren wurden gesammelt, verdaut und mit Percoll (Sigma) verarbeitet, und dann wurden die T-Zell-Funktion und der Phänotyp mittels Durchflusszytometrie bestimmt.

Analyse der basalen Sauerstoffverbrauchsrate und der extrazellulären Versauerungsrate

Zur Analyse der Stoffwechseleigenschaften wurden OCR und ECAR mit dem Seahorse XF24-Analysegerät (Agilent) bewertet. Kurz gesagt, menschliche T-Zellen, die 12 Tage lang unter verschiedenen Bedingungen kultiviert wurden, wurden mit ungepuffertem XF-Medium (ungepuffertes RPMI 1640 mit 10 mM Glucose, 1 mM Natriumpyruvat und 2 mM Glutamin) vorbehandelt. . Als nächstes wurden menschliche T-Zellen mit 0,5 × 106 Zellen pro Vertiefung in eine XF24-Zellkultur-Mikrotiterplatte ausgesät und in einem Nicht-CO2-Inkubator 1 Stunde lang bei 37 Grad inkubiert. Um die Zellhaftung zu verbessern, wurden die Platten 5 Minuten lang bei Raumtemperatur und 100 g ohne Bremse geschleudert. Der Sauerstoffverbrauch und die extrazelluläre Ansäuerung wurden unter Grundbedingungen und als Reaktion auf 1,25 μM Oligomycin, 50 mM 2-Desoxy-d-Glucose, 1,5 μM FCCP, 0,5 μM Rotenon und 0,5 μM Antimycin A analysiert. SRC wurde durch Subtrahieren berechnet die basale OCR aus der maximalen OCR.

ChIP–qPCR

Die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, die mit dem ChIP-IT-Express-Enzym-Scherkit (Active Motif) geliefert wurden. Kurz gesagt, 15 Millionen menschliche T-Zellen, die unter Kontrollbedingungen oder 10 mM Milchsäurebedingungen kultiviert wurden, wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Formaldehyd fixiert und die Fixierungsreaktion wurde durch die Zugabe von 1 × Glycin gestoppt. Fixierte Zellen wurden mit PMSF und Proteinhemmungscocktail pelletiert und vor der Zelllyse bei –80 Grad gelagert. Anschließend wurde das aufgetaute Pellet 30 Minuten lang in 1 ml eiskaltem Lysepuffer mit PMSF und Proteinhemmungscocktail auf Eis resuspendiert, um Kernmaterial zu erhalten. Das Kernpellet wurde dann resuspendiert und mit einem Enzymcocktail verdaut, um das Chromatin 15 Minuten lang bei 37 Grad zu scheren. Geschertes Chromatin wurde mit Protein-G-Magnetkügelchen mit Anti-c-MYC (CST, Kat.-Nr. 18583, 1:100 für ChIP) und Anti-IgG (CST, Kat.-Nr. 2729, 1:100 für ChIP) inkubiert 4 Grad über Nacht. Anschließend wurden die Magnetkügelchen viermal mit ChIP-Puffer gewaschen und mit 50 μl Elutionspuffer eluiert. Die eluierte DNA wurde 2,5 Stunden lang bei 65 Grad rückvernetzt und dann durch Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt. Die gereinigte DNA wurde zur Durchführung einer ChIP-qPCR verwendet, um die Anreicherung von MYC an den Promotoren der Zielgene nachzuweisen. Die für ChIP-qPCR verwendeten Primer finden Sie in der Ergänzungstabelle 2.

Analyse der mitochondrialen Masse und des Membranpotentials

Mitochondriale Masse und Membranpotential wurden mit MitoTracker Green und Tetramethyrhodaminmethylester (TMRM) analysiert. Die Zellen wurden vor der Zelloberflächenfärbung 1 Stunde lang mit 250 nM MitoTracker Green (Thermo Fisher) oder 50 nM TMRM (Thermo Fisher) in einem Inkubator bei 37 Grad (5 % CO2) gefärbt. Die Zellen wurden dreimal mit FACS-Puffer gewaschen und anschließend mit Oberflächenmarkern zur weiteren FACS-Analyse gefärbt.

statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism Version 8.0 durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Der zweiseitige Student-T-Test wurde verwendet, um Behandlungen mit Kontrollgruppen zu vergleichen. Für mehrere Vergleiche wurde eine zweifaktorielle ANOVA mit dem Tukey-Sidak- oder Dunnett-Mehrfachvergleichstest angewendet. P < 0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

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