Extraktion von Phenylethanoidglykosiden aus Cistanche Tubulosa durch Hochgeschwindigkeits-Scherhomogenisierungsextraktion

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Wenjing Pei und Ruili Guo

Hintergrund:

Cistanche tubulosaist eine bekannte traditionelle chinesische Medizin mit Ursprung in Xinjiang. Es ist in Nordafrika, Indien usw. weit verbreitet. Ziel: Die wichtigste bioaktive Komponente vonC. tubulosasind Phenylethanoidglykoside (PhGs). Echinacosid und Acteosid sind die indikativen Komponenten für die Bestimmung von PhGs und werden hauptsächlich zum Leberschutz, Immunschutz usw. verwendet. Daher ist es sehr wichtig, die PhGs aus C. tubulosa zu extrahieren. Methoden: In dieser Studie wurden die Methoden der ultraschallunterstützten Extraktion (UAE), der mikrowellenunterstützten Extraktion (MAE) und der High-Speed ​​Shearing Homogenization Extraction (HSHE) verglichen. Weiterhin wurden die Extraktionsbedingungen des HSHE-Verfahrens optimiert. Ergebnisse: Die Ergebnisse zeigten, dass die HSHE-Methode besser war als sowohl die UAE- als auch die MAE-Methode, und die optimalen Extraktionsparameter von HSHE waren eine Ethanolkonzentration von 5 0 Prozent, eine Extraktionstemperatur von 70 Grad, eine Rotationsgeschwindigkeit von 16000 U/min, eine Extraktionszeit von 2 min, ein Fest-zu-Flüssig-Verhältnis von 1:9 und ein Extraktionszyklus. Die Ausbeuten an Echinacosid und Acteosid betrugen 1,366 bzw. 0,519 Prozent, und die Übertragungsraten von Echinacosid und Acteosid erreichten 87 bzw. 94 Prozent. Schlussfolgerungen: Es kann der Schluss gezogen werden, dass die HSHE-Methode eine einfache, schnelle und effiziente Technik zur Extraktion von PhGs aus C. tubulosa ist. Highlights: Eine effiziente und umweltfreundliche HSHE-Methode wurde für die Extraktion von PhGs aus C. tubulosa untersucht. Die optimalen Bedingungen des HSHE-Verfahrens für die Extraktion von PhGs aus C. tubulosa wurden erhalten. Diese Forschung liefert ein neues Verfahren zur industriellen Extraktion von PhGs ausC. tubulosa.

Cistanche tubulosa

Cistanche tubulosaist eine weit verbreitete traditionelle chinesische Medizin, die ihren Ursprung in Xinjiang hat. Es ist in Nordafrika, auf der Arabischen Halbinsel, in Pakistan und Indien weit verbreitet und wurde 2010 offiziell in das chinesische Arzneibuch aufgenommen. Der wichtigste bioaktive Bestandteil vonC. tubulosasind Phenylethanoidglykoside (PhGs), eine Klasse wasserlöslicher Naturstoffe, einschließlich Echinacosid, Acteosid, Isoacteosid und 2-Acetylacteosid (1, 2). Die Struktur von PhGs besteht aus Zimtsäure- und Hydroxyphenylethyleinheiten, die beide über Ester- bzw. glykosidische Bindungen an eine -Glucopyranose gebunden sind (3). Pharmakologische Studien haben gezeigt, dass PhGs von C. tubulosa viele medizinische Funktionen haben, wie z. B. antifatigue (4), neuroprotektive (5–7), leberschützende (8–10) und immunprotektive Wirkungen (11). Daher ist die effektive Extraktion von PhGs aus C. tubulosa von großer Bedeutung für die Entwicklung und Nutzung von Naturstoffen.

Die derzeit traditionellen Extraktionsmethoden von PhGs sind Heiß-Reflux-Extraktion, ultraschallunterstützte Extraktion (UAE) und mikrowellenunterstützte Extraktion (MAE; 12–16). Diese Methoden haben verschiedene Nachteile, wie geringe Effizienz, lange Extraktionszeiten und hohe Kosten. Verglichen mit den traditionellen Methoden ist die High-Speed-Shearing-Homogenization-Extraction (HSHE)-Methode eine aufstrebende, neuartige Extraktionsmethode und hat die Vorteile schnellerer Extraktionszeiten, weniger Lösungsmittelabfall, höherer Ausbeuten, einfacherer Vorrichtung und einfacherer Bedienung (17). Das Arbeitsprinzip des HSHE-Verfahrens basiert auf einem rotierenden Innenmesser, das von einem Hochgeschwindigkeitsmotor angetrieben wird. Durch die inneren und äußeren Schneidelemente wird eine starke Scherkraft erzeugt, um die Proben aufzubrechen und zu mischen. Währenddessen verursacht die Schneide mit hoher Drehzahl Druckunterschiede zwischen den inneren und äußeren Hohlräumen der Schneide, was zu einem Stoffaustausch zwischen den Proben und Lösungsmitteln führt. Durch die Kombination aus hoher Scherkraft, Kollisionskraft, Druck und anderen Kräften kann schnell ein lösliches Gleichgewicht zwischen festen Proben und Lösungsmitteln erreicht werden (18). Somit kann der Extraktionsprozess von HSHE in wenigen Minuten und sogar in Dutzenden von Sekunden abgeschlossen werden (19–22).

Kürzlich wurde HSHE bei der Extraktion bioaktiver Komponenten aus verschiedenen Naturprodukten untersucht (23–25). Chenget al. verwendeten HSHE, um fünf Lignane aus der Frucht von Schisandra Chinensis zu extrahieren (26). Die Ergebnisse zeigten, dass die optimalen Bedingungen eine Ethanolkonzentration von 75 Prozent, eine Extraktionszeit von 1 Minute, ein Feststoff-Flüssigkeits-Verhältnis von 1:19, eine Extraktionsspannung von 18 0 V und ein Probenpartikel waren Größe von 120 Maschen. Die Gesamtausbeute der fünf Lignane betrug unter den optimierten Bedingungen 13,89 ± 0,014 mg/g. Tanget al. verwendeten HSHE, um bioaktives Öl aus Perillasamen zu erhalten (27). Die optimalen Bedingungen waren eine Extraktionszeit von 2 min, ein Fest-zu-Flüssig-Verhältnis von 1:10, eine Extraktionsspannung von 150 V und zwei Extraktionszyklen. Die Ausbeute an Perillasamenöl erreichte 59,3 Prozent. Die obigen Ergebnisse zeigen, dass HSHE die Vorteile kurzer Extraktionszeiten, niedriger Kosten und hoher Ausbeuten hat. Es fehlt jedoch an Forschung zur Extraktion von PhGs durch die HSHE.

In der vorliegenden Studie wurde HSHE verwendet, um seine potenzielle Anwendung bei der Extraktion von PhGs aus zu untersuchenC. tubulosa. Die Ausbeute an PhGs wurde durch HPLC bestimmt. Die drei Extraktionsmethoden HSHE, UAE und MAE wurden unter denselben Bedingungen verglichen. Die Auswirkungen der Ethanolkonzentration, der Extraktionstemperatur, der Rotationsgeschwindigkeit, der Extraktionszeit, des Fest-zu-Flüssig-Verhältnisses und der Anzahl der Extraktionszyklen auf die Ausbeute wurden untersucht. Die Vor- und Nachteile dieser Arbeit und der Referenzen werden gegenübergestellt und diskutiert.

Materialen und Methoden

Material und chemische Reagenzien

C. tubulosawurde von Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd (Xinjiang, China) gekauft. Die Standards von Echinacosid (Reinheit größer als oder gleich 98 Prozent) und Acteosid (Reinheit größer als oder gleich 98 Prozent) wurden von Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd (Shanghai, China) bezogen. Acetonitril, Methanol und Essigsäure waren von HPLC-Qualität (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). Das Ethanol in Analysequalität wurde von Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Tianjin, China) bezogen. Während der Experimente wurde deionisiertes Wasser verwendet.

HPLC-Analyse

Eine HPLC-Analyse wurde auf einem Waters e2695-Flüssigkeitschromatographen (Waters, Milford, MA) durchgeführt, der mit einem 2489 UV/Visible Detector und einer Symmetry C18-Säule (Waters), 250 × 4,6 mm, 5 &mgr;m Partikelgröße ausgestattet war. Die Konzentrationen von Echinacosid und Acteosid wurden durch das HPLC-Verfahren analysiert. Die mobile Phase bestand aus (1) Acetonitril und (2) einer 2-prozentigen wässrigen Eisessiglösung. Das Gradientenelutionsprogramm ist in Tabelle 1 dargestellt.

Die detektierte Wellenlänge war 330 nm, die Flussrate war 1 ml/min, das Injektionsvolumen war 10 μl und die Ofentemperatur war auf 30 Grad eingestellt. Der chromatographische Peak des Analyten wurde durch Vergleich seiner Retentionszeit mit der der Standards bestätigt. Die Quantifizierung erfolgte durch Integration des Peaks unter Verwendung eines externen Standardverfahrens.

Der Präzisionstest wurde durch fünfmaliges Injizieren der gleichen Extraktionsproben durchgeführt. Für den Stabilitätstest wurden dieselben Proben in Intervallen von 0, 1, 2, 4, 12, 24 und 48 h analysiert. Die Wiederfindungstests von Echinacosid und Acteosid wurden durchgeführt, indem die Standards in die Extraktionsproben gegeben wurden. Alle Peakflächen und Retentionszeiten von Echinacosid und Acteosid wurden aufgezeichnet. Die Ergebnisse der Eichkurven für Echinacosid und Acteosid sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Berechnung der Rendite

Echinacosid und Acteosid wurden als indikative Komponenten für die Bestimmung von PhGs verwendet. Die Ausbeute an Echinacosid oder Acteosid wurde mit der folgenden Gleichung berechnet:

Y=CV/W×100 Prozent (1)

wobei Y=Ausbeute an Echinacosid oder Acteosid ( Prozent ); C=Konzentrationen von Echinacosid oder Acteosid (mg/ml); V=Volumen der Extraktionslösung (ml); und W=Gewicht des C. tubulosa-Pulvers (mg).

Extraktionsmethoden von PhGs

Die Stängel von C. tubulosa wurden zunächst mit einer elektrischen Mühle (JC-500g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, China) gemahlen und durch ein Filtersieb (ca. 380 μm) filtriert. Dann wurde das C. tubulosa-Pulver im Ofen bei 70 Grad getrocknet, bis das Gewicht konstant war. Fünf Gramm C. tubulosa-Pulver wurden mit dem Extraktionslösungsmittel gemischt und in eine Extraktionsflasche gegeben. Danach wurde die flüssige Mischung für 5 min in einem Wasserbad mit konstanter Temperatur (DF-101S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, China) vorgewärmt (30–80 Grad).

(a) HSHE-Verfahren. – HSHE wurde mit einem FA25-System (FLUKO Co., Ltd., Shanghai, China) durchgeführt, das aus dem rotierenden Schneider, dem Hochgeschwindigkeitsmotor und der Steuerung bestand. Die Rotationsgeschwindigkeit des Innenschneiders wurde im Bereich von 10.000–28.000 U/min geregelt, und die Extraktionszeiten wurden im Bereich von 2–15 min eingestellt.

(b) UAE-Methode. – Fünf Gramm getrocknete Probe und 300 ml Methanol wurden genau abgewogen und in eine Extraktionsflasche gegeben. Die Extraktionsflasche wurde in ein Ultraschallbad getaucht und 10 min bei einer Ultraschallleistung von 300 W durchgeführt. Die Extraktionstemperatur wurde auf 30 Grad eingestellt.

(c) MAE-Verfahren. – Fünf Gramm getrocknete Probe und 300 ml Methanol wurden genau gewogen und in eine Extraktionsflasche gegeben. Die Extraktionsflasche wurde in den Mikrowellenreaktor gestellt und 10 min bei 180 W durchgeführt. Die Extraktionstemperatur wurde auf 30 Grad eingestellt.

Das HSHE-Verfahren wurde mit den UAE- und MAE-Verfahren mit dem gleichen Extraktionslösungsmittel, der gleichen Extraktionszeit, der gleichen Extraktionstemperatur, dem Fest-Flüssig-Verhältnis und der Anzahl der Extraktionszyklen verglichen. Die Extraktionslösung wurde durch eine 00,22-μm-Membran filtriert und mittels HPLC analysiert, um die Konzentrationen von Echinacosid und Acteosid zu bestimmen. Alle Extraktionsvorgänge wurden dreimal wiederholt

Ermittlung der Übertragungsraten

Basierend auf der Standardmethode im 2015 China Pharmacopoeia wurden die Echinacosid- und Acteosidgehalte in C. tubulosa-Pulver bestimmt (28). Ein Gramm C. tubulosa-Pulver und 50 ml 50-prozentiges Methanol wurden genau abgewogen und in einen braunen 50-ml-Messkolben gegeben. Die flüssige Mischung wurde gewogen und für 30 min eingeweicht. Dann wurde der braune Messkolben in ein Ultraschallbad getaucht und bei einer Ultraschallleistung von 250 W und einer Frequenz von 35 kHz für 40 min durchgeführt. Die flüssige Mischung wurde erneut gewogen und 50 Prozent Methanol wurden zugegeben, um den Lösungsmittelverlust auszugleichen. Die Extraktionslösung wurde durch eine 0,22-μm-Membran filtriert und mittels HPLC analysiert, um die Konzentrationen von Echinacosid und Acteosid zu bestimmen. Die Extraktionsvorgänge wurden dreimal wiederholt.

Die Transferraten von Echinacosid bzw. Acteosid wurden nach folgender Gleichung berechnet:

X= M1/M2 × 100 Prozent (2)

wobei X=Übertragungsrate von Echinacosid oder Acteosid ( Prozent ); M1=Qualität von Echinacosid oder Acteosid im Extrakt (mg); und M2 =-Qualität von Echinacosid oder Acteosid in C. tubulosa-Pulver (mg).

Resultate und Diskussion

Validierung der HPLC-Methode

Die HPLC-Profile von Echinacosid und Acteosid aus C. tubulosa unter Verwendung von HSHE sind in Abbildung 1 gezeigt. Die RSD der Peakflächen von Echinacosid und Acteosid betrug 1,89 bzw. 1,4 0 Prozent. Die Ergebnisse zeigten, dass das HPLC-Verfahren eine gute Genauigkeit bei der quantitativen Analyse von Echinacosid und Acteosid aufweist. Zu verschiedenen Zeitpunkten (0–48 h) betrugen die RSDs der Peakflächen von Echinacosid und Acteosid 1,71 bzw. 1,7 0 Prozent, was darauf hinweist, dass die Probe in 48 h stabil war. Die Rückgewinnung von Echinacosid und Acteosid betrug 99,3 bzw. 99,1 Prozent, und ihre RSD betrug 0,70 bzw. 0,67 Prozent, was die Zuverlässigkeit der HPLC-Methode bestätigte.

Vergleich der verschiedenen Extraktionsmethoden

Es wurde ein Vergleich der HSHE-Methode mit den MAE- und UAE-Methoden bezüglich der Ausbeuten an Echinacosid und Acteosid durchgeführt, dessen Ergebnisse in 2 gezeigt sind. Es wurde beobachtet, dass die Ausbeuten an Echinacosid und Acteosid, die durch HSHE erhalten wurden, höher waren als die, die erhalten wurden sowohl von MAE als auch von VAE. Verglichen mit MAE waren die von HSHE erhaltenen Ausbeuten an Echinacosid und Acteosid um 20,5 bzw. 20,8 Prozent höher. Und im Vergleich zu den Vereinigten Arabischen Emiraten waren die von HSHE erzielten Ausbeuten an Echinacosid und Acteosid um 6,6 bzw. 7,4 Prozent höher. Diese Ergebnisse zeigen, dass HSHE die Ausbeuten an PhGs signifikant steigern kann.

Optimierung der HSHE-Methode

Die Extraktionsparameter von PhGs von HSHE umfassen Ethanolkonzentration, Extraktionstemperatur, Rotationsgeschwindigkeit, Extraktionszeit, Fest-Flüssig-Verhältnis und die Anzahl der Extraktionszyklen (26, 29).

Wirkung der Ethanolkonzentration auf die Extraktion von PhGs

Die Ethanolkonzentration ist ein wichtiger Faktor, der die Ausbeuten an PhGs beeinflusst. Wie in Abbildung 3 gezeigt, wurden die Ausbeuten an Echinacosid und Acteosid aus C. tubulosa bei verschiedenen Ethanolkonzentrationen untersucht. Es zeigte sich, dass die Ausbeute an Echinacosid mit zunehmender Ethanolkonzentration von 0 auf 30 Prozent anstieg und dann von 30 auf 90 Prozent abnahm. Die Ausbeute an Acteosid stieg von 0 auf 70 Prozent und nahm dann mit steigenden Ethanolkonzentrationen von 70 auf 90 Prozent ab. Wenn die Ethanolkonzentration 50 Prozent betrug, war die Summe der Echinacosid- und Acteosidausbeuten maximal. Die unterschiedlichen Ethanolkonzentrationen haben unterschiedliche Polaritäten, was zu unterschiedlichen Löslichkeiten von Echinacosid und Acteosid führt. Somit betrug die optimale Ethanolkonzentration 50 Prozent.

Auswirkung der Rotationsgeschwindigkeit auf die Extraktion von PhGs

Abbildung 5 zeigt die Auswirkungen unterschiedlicher Rotationsgeschwindigkeiten auf die Ausbeuten an PhGs. Die Ausbeuten an Echinacosid und Acteosid stiegen mit zunehmender Rotationsgeschwindigkeit. Die Erhöhung der Rotationsgeschwindigkeit kann die Scherkraft des Innen- und Außenmessers erhöhen, wodurch die Ausbeute an PhGs erhöht wird. Die optimale Rotationsgeschwindigkeit betrug 16000 U/min.

Wirkung der Extraktionszeit auf die Extraktion von PhGs

Die Ausbeuten an Echinacosid und Acteosid bei unterschiedlichen Extraktionszeiten sind in Abbildung 6 dargestellt. Die Ausbeuten an Echinacosid und Acteosid waren mit zunehmender Extraktionsdauer stabil. Daraus kann geschlossen werden, dass PhGs in 2 min vollständig aus C. tubulosa extrahiert werden können und die optimale Extraktionszeit 2 min betrug.

Auswirkung des Fest-zu-Flüssig-Verhältnisses auf die Extraktion von PhGs

Wie in Abbildung 7 gezeigt, wurden die Ausbeuten an Echinacosid und Acteosid bei den unterschiedlichen Fest-zu-Flüssig-Verhältnissen diskutiert. Die Ausbeuten an Echinacosid und Acteosid stiegen von 1:3 auf 1:9 und stabilisierten sich von 1:9 auf 1:24. Da eine kleine Menge Extraktionslösungsmittel Echinacosid und Acteosid nicht vollständig auflösen kann, waren die Massentransferraten reduziert. Die übermäßige Extraktion von Lösungsmitteln verursachte unnötigen Abfall. Daher war das optimale Verhältnis von Feststoff zu Flüssigkeit 1:9.

Auswirkung der Anzahl der Extraktionszyklen auf die Extraktion von PhGs

Abbildung 8 zeigt die Auswirkungen einer Reihe von Extraktionszyklen auf die Ausbeuten an PhGs. Die Ausbeuten an Echinacosid und Acteosid stiegen mit zunehmender Zahl der Extraktionszyklen. Allerdings verlängerten sich die Extraktionszeiten mit zunehmenden Extraktionszyklen deutlich, und es wurde mehr Energie verbraucht. Die optimale Anzahl von Extraktionszyklen war eins.

Vergleich der HSHE-Methode mit anderen Extraktionsmethoden zur Extraktion von PhGs

Die Ergebnisse des HSHE-Verfahrens im Vergleich zu anderen Extraktionsverfahren zur Extraktion von PhGs aus C. tubulosa sind in Tabelle 3 aufgeführt. HSHE ist einfacher und leichter als die Kopplungsverfahren wie die ultraschallunterstützte wässrige Zweiphasenextraktion und die Ultraschall-Mikrowellen-Extraktionstechnologie Methoden. Darüber hinaus ist der Extraktionsdruck von HSHE niedriger als beim Extraktionsverfahren mit unter Druck stehender Flüssigkeit, und die Betriebsbedingungen des ersteren sind sicherer. Noch wichtiger ist, dass aus Tabelle 3 ersichtlich ist, dass HSHE die kürzeste Extraktionszeit und den geringsten Lösungsmittelverbrauch unter allen Extraktionsverfahren aufweist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das HSHE-Verfahren viele Vorteile hat, wie z. B. hohe Effizienz, milde Betriebsbedingungen, niedrige Verbrauchswerte, einfache Ausrüstung und einfache Bedienung für die Gewinnung von Naturprodukten.

Schlussfolgerungen

In dieser Studie wurde eine effiziente und umweltfreundliche HSHE-Methode zur Extraktion von PhGs aus C. tubulosa untersucht. Im Vergleich zu den UAE- und MAE-Verfahren liefert das neuartige HSHE-Verfahren unter gleichen Bedingungen eine höhere Ausbeute an PhGs. Verglichen mit der MAE-Methode wurden die Ausbeuten an Echinacosid und Acteosid um 20,5 bzw. 20,8 Prozent gesteigert. Und im Vergleich zu den Vereinigten Arabischen Emiraten wurden die Ausbeuten an Echinacosid und Acteosid um 6,6 bzw. 7,4 Prozent erhöht. Die Extraktionsparameter von HSHE von PhGs aus C. tubulosa wurden optimiert. Unter den optimierten Parametern erreichten die Ausbeuten an Echinacosid und Acteosid 1,366 bzw. 0,519 Prozent und die Übertragungsraten von Echinacosid und Acteosid 87 bzw. 94 Prozent. Das HSHE-Verfahren hat die Vorteile hoher Effizienz, milder Betriebsbedingungen, niedriger Verbrauchswerte, einfacher Ausstattung, einfacher Bedienung und niedriger Kosten. Diese Forschung stellt eine neue Methode für die industrielle Extraktion von PhGs aus C. tubulosa bereit.