Extraktion, physikalisch-chemische Eigenschaften, Anti-Aging- und antioxidative Aktivitäten von Polysacchariden aus industriellen Hanfrückständen Teil 2
Jul 10, 2023
2.8. Anti-Aging-Aktivitätsstudie
2.8.1. Zellengesundheit
In vitro werden Zytotoxizitätsexperimente häufig zur Beurteilung der Toxizität getesteter Proben eingesetzt [37]. Die Auswirkungen von IHRPs auf die Zelllebensfähigkeit von HDF und HEK, den am häufigsten verwendeten epidermalen Zelllinien, sind in Abbildung 5 dargestellt. IHRPs hatten nahezu keine Zytotoxizität für HDF und HEK. Darüber hinaus könnten IHRPs die Zellproliferation zwischen 100 und 800 µg/ml fördern. Um sicherzustellen, dass die Lebensfähigkeit der Zellen nicht durch die Konzentration der Probe beeinträchtigt wird, haben wir für die folgenden Experimente IHRP-Konzentrationen unter 400 µg/ml gewählt.
Glykosid von Cistanche kann auch die SOD-Aktivität im Herz- und Lebergewebe erhöhen und den Gehalt an Lipofuscin und MDA in jedem Gewebe erheblich reduzieren, wodurch verschiedene reaktive Sauerstoffradikale (OH-, H₂O₂ usw.) effektiv abgefangen und vor verursachten DNA-Schäden geschützt werden durch OH-Radikale. Cistanche-Phenylethanoidglykoside haben eine starke Fähigkeit, freie Radikale abzufangen, eine höhere Reduktionsfähigkeit als Vitamin C, verbessern die Aktivität von SOD in der Spermiensuspension, reduzieren den MDA-Gehalt und haben eine gewisse schützende Wirkung auf die Funktion der Spermienmembran. Cistanche-Polysaccharide können die durch D-Galaktose verursachte Aktivität von SOD und GSH-Px in Erythrozyten und Lungengewebe experimentell seneszierender Mäuse steigern, außerdem den Gehalt an MDA und Kollagen in Lunge und Plasma verringern und den Gehalt an Elastin erhöhen eine gute Abfangwirkung auf DPPH, verlängert die Zeit der Hypoxie bei seneszenten Mäusen, verbessert die Aktivität von SOD im Serum und verzögert die physiologische Degeneration der Lunge bei experimentell seneszenten Mäusen. Bei der zellulären morphologischen Degeneration haben Experimente gezeigt, dass Cistanche über eine gute antioxidative Fähigkeit verfügt und hat das Potenzial, ein Medikament zur Vorbeugung und Behandlung von Hautalterungskrankheiten zu sein. Gleichzeitig hat Echinacosid in Cistanche eine erhebliche Fähigkeit, freie DPPH-Radikale abzufangen und kann reaktive Sauerstoffspezies abfangen, den durch freie Radikale verursachten Kollagenabbau verhindern und hat auch eine gute Reparaturwirkung auf Schäden durch Thymin-Radikalanionen.
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2.8.2. Scratch-Assay von HDF-Zellen
Der Scratch-Assay ist eine In-vitro-Methode, die häufig zur Bewertung des Beitrags zellulärer und molekularer Mechanismen zur Zellproliferation und -migration eingesetzt wird [38]. Die Bilder des Heilungszustands von HDF-Kratzern sind in Abbildung 6 dargestellt. IHRPs unterschiedlicher Konzentration wirkten sich im Vergleich zur Kontrolle alle positiv auf die Heilung von Zellkratzern aus. Darüber hinaus konnten IHRPs die Heilung von Zellkratzern erheblich fördern, wenn die Konzentration der IHRPs zwischen 50 und 200 µg/ml lag. Die Heilungsrate von HDF-Kratzern nach 24 Stunden betrug 64,51 ± 3,69 Prozent (p < 0,01), 58,03 ± 3,90 Prozent (p < 0,05) bzw. 66,21 ± 6,60 Prozent (p < 0,01) bei den IHRPs Die Konzentration betrug 50, 100 und 200 µg/ml, wie in Tabelle 6 dargestellt. Außerdem war die heilende Wirkung von IHRPs der der Positivkontrolle TGF- sehr ähnlich (62,29 ± 4,69 Prozent, p < 0,01). Die Ergebnisse des Kratzertests zeigten, dass IHRPs die Heilung von Zellkratzern beschleunigen und die Zellproliferation fördern könnten.
2.8.3. qRT-PCR-Analyse der HDF-Genexpression
Es wurden mehrere Studien durchgeführt, um das Anti-Aging-Potenzial verschiedener Pflanzen zu bewerten [39,40]. Die relative Quantifizierung der Anti-Aging-Gene von HDF ist in Abbildung 7 dargestellt. Wie in der Abbildung gezeigt, wurden TGF-, Vc und HA als Positivkontrolle verwendet. Die Reihenfolge der relativen AQP-3-Quantifizierung war HA > TGF- > IHRPs > Vc. Die Reihenfolge der relativen Quantifizierung von COL1A1 war TGF- > Vc > HA > IHRPs. Die Reihenfolge der relativen Quantifizierung von COL3A1 war Vc > TGF- > HA > IHRPs. Die Reihenfolge der relativen ELASTIN-Quantifizierung war TGF- > Vc > HA > IHRPs. Die Reihenfolge der relativen MMP-1-Quantifizierung war IHRPs > HA > Vc > TGF-. Daher hatten IHRPs im Vergleich zur Positivkontrolle nahezu keinen positiven Einfluss auf die Expression von AQP-3, COL1A1, COL3A1 und ELASTIN. Allerdings förderten IHRPs die Expression von MMP-1 erheblich. MMP-1 wird hauptsächlich von Keratinozyten erzeugt und hauptsächlich für den Abbau und die Fragmentierung von Hautkollagenfasern verwendet [41]. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass IHRPs die HDF-Proliferation und die Expression von Anti-Aging-Genen fördern könnten, was auf das Anti-Aging- und Hautreparaturpotenzial von IHRPs hinweist.
3. Materialien und Methoden
3.1. Materialien und Reagenzien
IHR wurde von Yunnan Hempmon Pharmaceuticals Co., Ltd. (Kunming, China) bereitgestellt. Phenol, Naphthol, Schwefelsäure, Carbazol, Coomassie-Blau G-250, Phosphorsäure, Ethanol, Chloroform und Monosaccharidkontrolle wurden von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China) geliefert. Galacturonsäure, Glucuronsäure, Guluronsäure und Arbutin wurden von Sigma-Aldrich Co., Ltd. (St. Louis, MO, USA) gekauft. Menschliche dermale Fibroblasten (HDF), menschliche epidermale Keratinozyten (HEK) und komplettes Zellmedium wurden von Sciencell Co., Ltd. (Carlsbad, CA, USA) gekauft. 12-Well-Platten und 96-Well-Platten wurden von Corning Co., Ltd. (Corning, NY, USA) angeboten. Das CCK-8-Testkit für die Lebensfähigkeit von Zellen wurde von DOJINDO Biology Co., Ltd. (Tokio, Japan) gekauft, und andere Nachweiskits wurden von Takara Co., Ltd. (Takara, Japan) angeboten.
3.2. Optimierung der IHRPs-Extraktion
3.2.1. Vergleich verschiedener Extraktionsmethoden
Perkolationsextraktion: 100 g IHR wurden in 2000 ml entionisiertes Wasser gegeben. Die Extraktion wurde mit einer Flussrate von 150 ± 50 ml/h nach 2 Stunden durchgeführt. Erhitzungsextraktion: 100 g IHR wurden in 2000 ml entionisiertes Wasser gegeben. Die Extraktion wurde 1 Stunde lang bei 98 °C durchgeführt und der Vorgang zweimal wiederholt. Ultraschallunterstützte Extraktion: 100 g IHR wurden in 2000 ml entionisiertem Wasser gelöst. Die Extraktion wurde 0,5 Stunden lang bei 60 °C durchgeführt und der Vorgang zweimal wiederholt.
Die Filtrate wurden unter Verwendung eines Vakuumrotationsverdampfers konzentriert. Anschließend wurde die Lösung mit einem Vakuumtrockner getrocknet. Um eine geeignete Methode auszuwählen, wurde der Polysaccharidgehalt bestimmt.
3.2.2. Einfaktorexperimente
Zur Extraktion von IHRPs wurden 100 g IHR zu einer bestimmten Menge entionisiertem Wasser gegeben. Extraktionstemperatur (40, 60, 80 und 98 ± 2 ◦C), Fest-Flüssigkeits-Verhältnis (1:6, 1:8, 1:10 und 1:15), Extraktionszeit (0,5, 1,0, 1,5 und 2 h), pH-Wert (3, 5, 7, 9 und 11) und mehrere aufeinanderfolgende Extraktionen (1, 2, 3, 4) wurden separat untersucht, um den Einfluss einzelner Faktoren auf die IHRP-Extraktion zu bewerten.
3.2.3. Orthogonales experimentelles Design
Die Extraktionsbedingungen wurden durch orthogonales Versuchsdesign weiter optimiert. Wie in Tabelle 7 gezeigt, waren die vier ausgewählten Variablen Extraktionstemperatur (60, 80 und 98 ± 2 ◦C), RS/L (1:6, 1:8 und 1:10) und die Anzahl aufeinanderfolgender Extraktionen (1). , 2 und 3) und pH (4, 7 und 10). Die orthogonalen Experimente wurden in 9 Gruppen unterteilt. Das Gewicht der Polysaccharide wurde als Ziel zur Abschätzung der Extraktionsbedingungen herangezogen.
3.3. Screening der IHRP-Alkohol-Ausfällungsbedingungen
Die Extraktionslösung wurde unter optimalen Bedingungen gemäß 3.2 erhalten und mit 400 ml Ethanol versetzt. Die Experimente wurden basierend auf den unterschiedlichen Geschwindigkeiten der Alkoholzugabe, der Rührmethode und der Abkühlgeschwindigkeit in Tabelle 8 durchgeführt. Der Niederschlag wurde nach Zentrifugation und Trocknung erhalten. Dann wurden das Gewicht und der Polysaccharidgehalt erfasst, um die geeigneten Alkoholfällungsbedingungen zu bestimmen.
3.4. Bestimmung der Polysaccharidausbeute und der chemischen Zusammensetzung von IHRPs
Der Proteingehalt wurde nach der Bradford-Methode berechnet und als Standard wurde Rinderserumalbumin (BSA) verwendet [42]. Der Gesamtzuckergehalt von IHRPs wurde nach der Phenolsulfat-Methode ermittelt und die Glucose als Standard verwendet [43]. Der Uronsäuregehalt wurde durch eine Carbazol-Schwefelsäure-Methode ermittelt [44]. Die Polysaccharidausbeute wurde durch Gleichung (1) ermittelt.
Dabei bezieht sich YP auf die Polysaccharidausbeute, mA auf das Gewicht der IHRPs und mB auf das Gewicht des für die Polysaccharidextraktion verwendeten IHR.
3.5. Reinigung von IHRPs
Zunächst wurden 100 g Roh-IHRPs unter den in den Abschnitten 3.2 und 3.3 ermittelten optimalen Bedingungen hergestellt. Die rohen IHRPs wurden mit verschiedenen Methoden weiter gereinigt.
Aktivkohleadsorption: 10 g rohes IHRP wurden in 200 ml entionisiertes Wasser gegeben. Die Aktivkohle mit einem Gewicht von 1 Prozent, 2 Prozent, 4 Prozent und 8 Prozent IHRPs wurde jeweils mit der Lösung vermischt. Anschließend wurde die Lösung 1 Stunde lang bei 60 °C gerührt und filtriert. Nach dem Waschen mit entionisiertem Wasser wurde das Filtrat eingeengt und getrocknet.
Membranfiltration: 10 g rohes IHRP wurden in 500 ml entionisiertes Wasser gegeben. Anschließend wurde die Lösung kontinuierlich durch Membranen mit unterschiedlichen Molekulargewichten (30,000 Da, 10,000 Da, 1000 Da und 500 Da) filtriert. Das Filtrat und das Retentat wurden gesammelt und getrocknet. Schließlich wurden IHRPs mit unterschiedlichen Molekulargewichten erhalten.
Savage-Methode: 1 g rohes IHRP wurde in 100 ml entionisiertes Wasser gegeben. Dann wurde die Lösung mit Sevage-Reagenz (n-Butanol: Chloroform=1: 5 (v/v)) gemischt. Die Mischung wurde 15 Minuten lang gerührt und zur Schichtung in den Scheidetrichter überführt. Der obige Vorgang wurde fünfmal wiederholt. Anschließend wurden sowohl die organische Phase als auch die wässrige Phase getrocknet.
Säulenchromatographie: 10 g schwach basisches Anionenaustauscherharz wurden 2 Stunden lang in entionisiertes Wasser getaucht und dann in eine Glassäule (2 × 30 cm) geladen. 10 g rohes IHRP wurden in 200 ml entionisiertes Wasser gegeben. Anschließend wurde die Lösung langsam durch die Harzschicht geleitet. Die Säule wurde mit 100 ml 30-prozentigem Ethanol gespült. Der Eluent wurde konzentriert und getrocknet.
3.6. Analyse der Monosaccharidzusammensetzung
Der Monosaccharid-Zusammensetzungstest wurde nach der vorherigen Methode mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt [45]; 5 mg IHRPs wurden mit 1 ml Trifluoressigsäure (TFA, 2 M) 6 Stunden lang bei 105 ◦C hydrolysiert. Anschließend wurde die Lösung unter Stickstoffatmosphäre getrocknet. Das getrocknete Hydrolysat wurde zu 5 ml entionisiertem Wasser gegeben, nachdem TFA mit Methanol entfernt worden war. Anschließend werden 0,5 ml 0,3 M NaOH-Lösung und 1 ml 0,5 M 1-Phenyl-3-methyl-5- hinzugefügt. Pyrazolon (PMP)-Methanollösung wurden dem Hydrolysat zugesetzt. Die erhaltene Lösung wurde zur Derivatisierung 2 Stunden lang bei 70 ◦C in einem Wasserbad gehalten. Dann wurden 0,5 ml HCl-Lösung (0,3 M) zur Neutralisierung zugegeben. Die Lösung wurde zur HPLC-Analyse mit 1 ml Chloroform gemischt. Als Referenz wurden mehrere Monosaccharide verwendet. Chromatografische Bedingungen: Mobile Phase A (82 Prozent): 0,1 M KH2PO4-Lösung. Mobile Phase B (18 Prozent): Acetonitril. Säule: C18 (5 µm, 4,6 × 250 mm). Injektionsvolumen: 10 µL. Flussrate: 1,0 ml/min. Detektionswellenlänge: 245 nm. Säulentemperatur: 30 ◦C.
3.7. Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR)
Die Proben für die FT-IR-Analyse wurden durch Mischen von 5 mg IHRPs mit 125 mg KBr hergestellt. Die FT-IR-Spektren von Proben wurden zwischen 4000 und 500 cm−1 aufgenommen.
3.8. Studie zur antioxidativen Aktivität
3.8.1. DPPH-Radikalfängeraktivität
Die DPPH-Radikalfängeraktivität von IHRPs wurde auf der Grundlage einer berichteten Methode mit einigen Modifikationen bewertet [46]. Kurz gesagt, 2 ml Probenlösung (0.2, 0.4, 0.6, 0.8 und 1.0 mg/ ml) wurde mit 2 ml DPPH-Lösung (0,1 mM) gemischt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang im Dunkeln gehalten und dann wurde die Absorption (Abs) bei 517 nm ermittelt. Die DPPH-Abfangrate wurde mit der folgenden Gleichung (Gleichung (2)) geschätzt und die 50-prozentige effektive Konzentration (EC50) gezählt.
Dabei stellt RSD die Abfangrate freier Radikale dar, Ai bezieht sich auf die Abs des Reaktionssystems (DPPH mit der Probe), Aj ist die Abs des Probenhintergrunds (Lösungsmittel mit der Probe) und A0 ist die Abs der Negativkontrolle (DPPH mit Lösungsmittel).
3.8.2. ABTS-Radikalfängeraktivität
Die ABTS-Fängeraktivität von IHRPs wurde basierend auf einer früheren Methode bewertet [47]. Kurz gesagt, die Kaliumpersulfatlösung (2,45 mM) wurde 12 Stunden lang im Dunkeln mit der ABTS-Lösung (7 mM) gemischt. Die erhaltene ABTS-Lösung wurde 50-fach auf die Abs von 0,70 ± 0,02 bei 734 nm verdünnt. Anschließend wurde 1 ml Probenlösung (0.2, 0.4, 0,6, 0,8 und 1,0 mg/ml) zu 4 ml ABTS-Lösung hinzugefügt. Die Mischung wurde 1 Minute lang schnell geschüttelt und 6 Minuten lang in die Dunkelheit gestellt. Dann wurde der Abs bei 734 nm gemessen und Vc als Positivkontrolle verwendet. Die ABTS-Spülrate wurde mit Gleichung (2) berechnet.
3.9. Anti-Aging-Aktivitätsstudie
3.9.1. Zellkultur
Menschliche dermale Fibroblasten (HDF) und menschliche epidermale Keratinozyten (HEK) wurden von ScienCell Co., Ltd. erworben. Die Zellen wurden mit DMEM-Medium kultiviert, das 10 Prozent FBS enthielt. Die Kulturbedingungen betrugen 37 ◦C mit 5 Prozent CO2.
3.9.2. Zellengesundheit
Der Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-Assay wurde durchgeführt, um die Zytotoxizität von IHRPs gegenüber HDF- und HEK-Zellen zu bestimmen. Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Konzentration von 2 × 104 Zellen/Well 48 Stunden lang kultiviert. Anschließend wurden 100 µL frisches Medium mit Proben zugegeben und die Vertiefungen 24 Stunden lang inkubiert. Dann wurde die CCK-8-Lösung gemäß den Anweisungen der Testkits in die Vertiefungen gegeben und die Platte wurde 2 Stunden lang inkubiert. Zur Berechnung der Zelllebensfähigkeit wurden die Abs bei 450 nm ermittelt.
3.9.3. Scratch-Assay
HDF wurde bei 37 °C und 5 Prozent CO2 kultiviert. Dann wurden die Zellen in einer 12-Well-Platte mit einer Konzentration von 1 × 105 Zellen/Well ausgesät. Nach 48-stündiger Inkubation wurde mit der Spritzennadel der Kratzer auf der HDF-Zellschicht erzeugt. Die Zellfragmente wurden mit PBS gereinigt und die Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen hinzugefügt. Anschließend wurde die Heilung von Kratzern in der Zellschicht nach 24 Stunden beobachtet, um die Wirkung von IHRPs auf die Proliferation von HDF zu bewerten. Die erhaltenen Bilder wurden mit der Image J-Software quantifiziert [48]. Als Positivkontrolle wurde der transformierende Wachstumsfaktor (TGF-) verwendet. Die Heilungsrate wurde gemäß Gleichung (3) berechnet.
wobei A1 den anfänglichen Kratzbereich darstellt und A2 sich auf den endgültigen Kratzbereich bezieht.
3.9.4. Quantitative RT-PCR (qRT-PCR)-Analyse
Anschließend wurden die Zellen in 12-Well-Platten mit einer Konzentration von 1 × 105 Zellen/Well ausgesät. Nach 48-stündiger Inkubation wurden die Proben gemischt und weitere 24 Stunden kultiviert. Die Gesamt-RNA wurde extrahiert und die cDNA synthetisiert. Die qRT-PCR-Analysen für das Aquaporin-Gen (AQP-3), das Kollagen-Gen (COL1A1 und COL3A1), das Elastin-Gen (ELASTIN) und die Matrix-Metalloproteinase (MMP-1) wurden in Echtzeit durchgeführt PCR-System (Applied Biosystems Life Technologies, Inc., ABI StepOnePlus). Die relative Quantifizierung wurde mit der vergleichenden CT-Methode (2-∆∆Ct-Methode) durchgeführt. Als Positivkontrolle wurden Hyaluronsäure (HA), Vc und TGF- eingesetzt.
3.10. Statistische Analyse
Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SD (n {{0}}) angezeigt. Die statistische Signifikanz wurde durch ANOVA ermittelt. Werte von p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
4. Schlussfolgerung
In dieser Arbeit wurde die Polysaccharidextraktion aus IHR durch Einzelfaktorexperimente und orthogonales Versuchsdesign optimiert. Die optimalen Heizextraktionsbedingungen waren eine Extraktionstemperatur von 98 °C, ein Fest-Flüssigkeits-Verhältnis von 1:10, eine Extraktionszeit von 1 Stunde, eine Anzahl aufeinanderfolgender Extraktionen von 2 und ein pH-Wert von 4. Das Extraktionsverhältnis und die Der Polysaccharidgehalt betrug unter diesen Bedingungen 2{{40}},12 Prozent bzw. 12,35 Prozent. Zusätzlich waren die geeigneten Alkoholfällungsbedingungen Pumpen mit 2 l/h, kontinuierliches Rühren und ein Eiswasserbad für 4 Stunden. Die rohen IHRPs wurden durch Säulenchromatographie weiter gereinigt und der Polysaccharid-/Proteingehalt der gereinigten IHRPs betrug 34,44 Prozent bzw. 1,61 Prozent. Die Monosaccharidzusammensetzung von IHRPs war: Fucose (1,33 Prozent), Arabinose (19,60 Prozent), Rhamnose (10,41 Prozent), Galactose (20,87 Prozent), Glucose (27,42 Prozent), Xylose (4,23 Prozent), Ribose (3,12 Prozent), Galacturonsäure Säure (6,22 Prozent), Guluronsäure (0,28 Prozent) und Glucuronsäure (2,37 Prozent). Das FT-IR zeigte das Polysaccharidgerüst von IHRPs. Außerdem betrugen die EC50-Werte der ABTS- und DPPH-Radikale 0,34 und 0,47 mg/ml, was die große antioxidative Aktivität von IHRPs zeigt. IHRPs könnten auch die Zellproliferation von HDF und HEK und die Heilung von Zellkratzern fördern. Darüber hinaus könnten IHRPs die Expression von MMP-1 erheblich fördern. Daher wird angenommen, dass die Polysaccharide aus Industriehanfrückständen als potenzielle Antioxidans- und Anti-Aging-Produkte für Kosmetika oder funktionelle Lebensmittel entwickelt werden könnten.
Autorenbeiträge:TC, QZ und BZ haben die Experimente entworfen. TC und HL (Hang Li) führten die Experimente durch und verfassten den ersten Entwurf. TC, HL (Hang Li), HL (Hongning Lv), XL und ML analysierten die Daten. MT, SH, QZ und BZ haben das Manuskript überarbeitet. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.
Finanzierung: Diese Forschung wurde von Yunnan Hempmon Pharmaceuticals Co., Ltd. finanziert.
Erklärung des Institutional Review Board:Unzutreffend.
Einverständniserklärung:Unzutreffend.
Erklärung zur Datenverfügbarkeit:Unzutreffend.
Interessenskonflikte:Die Autoren haben keine Interessenkonflikte angegeben.
Probenverfügbarkeit:Proben der Verbindungen IHR und IHRPs sind bei den Autoren erhältlich.
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