Gastrointestinale epitheliale angeborene Immunität – Regionalisierung und Organoide als neues Modell

Der menschliche Magen-Darm-Trakt steht in ständigem Kontakt mit mikrobiellen Reizen. Seine Barrieren müssen die Koexistenz mit den kommensalen Bakterien gewährleisten und gleichzeitig die Überwachung eindringender Krankheitserreger ermöglichen. Im Zentrum der Interaktion steht die Epithelschicht, die die Grenzen des Körpers markiert. Es ist mit einer Vielzahl verschiedener Sensoren des angeborenen Immunsystems ausgestattet, wie z. B. Toll-like-Rezeptoren, um Entzündungsreaktionen auf Mikroben auszulösen. Eine Funktionsstörung dieses komplexen Systems führt zu entzündungsbedingten Pathologien, beispielsweise einer entzündlichen Darmerkrankung. Die Komplexität der zellulären Interaktionen, ihre molekularen Grundlagen und ihre Entwicklung sind jedoch noch immer kaum verstanden. In den letzten Jahren haben aus Stammzellen gewonnene Organoide als vielversprechende Modelle sowohl für die Entwicklung als auch für ein breites Spektrum von Pathologien, einschließlich Infektionskrankheiten, zunehmend an Aufmerksamkeit gewonnen. Darüber hinaus ermöglichen Organoide die Untersuchung der angeborenen Immunität des Epithels in vitro. In diesem Aufsatz konzentrieren wir uns auf die gastrointestinale Epithelbarriere und ihre regionale Organisation, um die Wahrnehmung und Entwicklung des angeborenen Immunsystems zu diskutieren.

Die Einwirkung mikrobieller Reize kann die Immunität verbessern, da mikrobielle Reize den Körper zur Produktion von Immunzellen und Immunmolekülen anregen und dadurch die Immunantwort des Körpers stimulieren können. Insbesondere kann die Einwirkung mikrobieller Reize Immunzellen wie Makrophagen, dendritische Zellen und natürliche Killerzellen aktivieren, die Proliferation und Differenzierung von Immunzellen beschleunigen und die Vitalität und Krankheitsresistenz von Immunzellen verbessern. Darüber hinaus können mikrobielle Reize auch Entzündungsreaktionen und die Immunregulation fördern und die körpereigene Immunabwehr gegen Krankheitserreger verbessern. Daher kann eine angemessene Exposition gegenüber mikrobiellen Reizen die Verbesserung der menschlichen Immunität fördern. Es ist ersichtlich, dass wir die Immunität verbessern müssen. Cistanche kann die Immunität deutlich verbessern. Fleischasche enthält verschiedene biologisch aktive Inhaltsstoffe, wie Polysaccharide, zwei Pilze, Huang Li usw. Diese Inhaltsstoffe können das Immunsystem verschiedener Fleischsorten stimulieren. Zellen, wodurch ihre Immunlebensfähigkeit erhöht wird.

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Schlüsselwörter

Magen-Darmtrakt. Immunität. Regionalisierung und Organoide.

Einführung

Der Magen-Darm-Trakt (GI) ist für die Verdauung der Nahrung erforderlich und erstreckt sich von der Mundhöhle über die Speiseröhre, den Magen, den Dünndarm und den Dickdarm bis zum Anus. Das Magen-Darm-Lumen wird von einer Vielzahl von Kommensalen, Symbionten und gelegentlich Krankheitserregern besiedelt. Die mikrobielle Besiedlung folgt einem Gradienten von weniger als 103 Mikroben/ml im Magen bis 103–107 Mikroben/ml im Dünndarm und 1011–1012 Mikroben/ml im Dickdarm (Übersicht in [1–3]). Ab dem Drüsenmagen ist der Magen-Darm-Trakt von einer einzigen Schicht säulenförmiger Epithelzellen ausgekleidet. Diese Epithelschicht besteht aus verschiedenen spezialisierten Zellen, die durch Verbindungsproteinkomplexe eng miteinander verbunden sind und so die physikalische Barriere verstärken (Abb. 1).

Die Interaktion zwischen der Darmmikrobiota sowie aufgenommenen Krankheitserregern und Epithelzellen wird durch Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) vermittelt, darunter Toll-like-Rezeptoren (TLRs), Nukleotid-bindende Oligomerisierungsdomänen (NOD)-ähnliche Rezeptoren (NLRs) und andere zytosolische Rezeptoren (Abb. 2, Übersicht in [7, 11]). Diese PRRs spielen eine Schlüsselrolle bei der Erkennung mikrobenassoziierter molekularer Muster (MAMPs) und schadensassoziierter molekularer Muster (DAMPs). Bei der PRR-Aktivierung in Epithelzellen induzieren nachgeschaltete Signalkaskaden die Expression verschiedener Zytokine und Chemokine über Entzündungswege, wie den NF-κB-Weg, um die professionellen Immunzellen zu steuern (Übersicht in [8, 12–16]). Zusätzlich zu den klassischen PRRs wurden kürzlich weitere Sensoren für bakterielle Aktivitäten entdeckt, beispielsweise Alpha-Kinase 1 (ALPK1) [17–19]. Inflammasome, zytoplasmatische Komplexe aus NLR-Proteinen, erkennen zusätzliche molekulare Muster, wie z. B. bakterielle Metaboliten (Übersicht in [7, 9]).

Gastrointestinale angeborene Immunantworten, einschließlich der PRR-Erkennung, müssen das Bedürfnis nach Schutz vor potenziell schädlichen Krankheitserregern mit der Fähigkeit, die Exposition gegenüber dem vielfältigen luminalen Mikrobiom zu tolerieren, in Einklang bringen. Daher ist zu erwarten, dass die Expression und Funktion des PRR-Signals einen großen Einfluss nicht nur auf die Erkennung von Krankheitserregern, sondern auch auf die Gewebehomöostase (Kasten 1) und entzündliche Erkrankungen wie akute Gastroenteritis, Gastritis und entzündliche Darmerkrankungen (IBDs) hat (Übersicht in [ 12, 13, 20, 21]). Obwohl jede dieser Krankheiten völlig unterschiedliche Pathogenese aufweist, haben sie ein entscheidendes Merkmal gemeinsam: Die Schnittstelle zwischen Umwelt und Körper ist erheblich gestört. Es gibt jedoch eine anhaltende Debatte darüber, ob Veränderungen in der Darmepithelschicht, insbesondere solche, die sich auf die angeborene Immunfunktion auswirken, Ursache oder Folge der oben genannten Erkrankungen sind.

Das meiste Wissen über die PRR-Signalübertragung stammt aus der Forschung an hämatopoetischen Zellen. Es war eine Herausforderung, die Funktionen der PRR-Signalübertragung in Epithelzellen von denen der infiltrierenden Immunzellen zu unterscheiden. Zu den größten Hindernissen gehören Schwierigkeiten bei der Isolierung reiner Epithelzellen und der Bildung zuverlässiger Antikörper gegen PRRs. Mit der Weiterentwicklung von Organoiden, die aus intestinalen Epithelstammzellen stammen, steht nun ein reduktionistisches experimentelles Modell zur Verfügung, das Untersuchungen zur angeborenen Immunantwort der primären Epithelzellen ermöglicht. Organoide sind definiert als aus Stammzellen gewonnene 3--dimensionale Zellkulturen, die über die Fähigkeit zur Selbstorganisation verfügen und einige der Funktionen des ursprünglichen Organs beibehalten (z. B. Sekretion, Filtration, Absorption, Kontraktion). Da Organoide entweder aus geweberesidenten adulten Stammzellen (ASCs) oder aus pluripotenten Stammzellen (PSCs) gezüchtet werden können, sind die Zellen nicht transformiert. Zusammen decken die beiden Arten von Organoiden ein umfangreiches Repertoire an Organen ab, die nachgeahmt werden können (Übersicht in [4, 22, 23]). Beide Technologien haben ihre Vorteile (Übersicht in [4, 22, 23]). Beispielsweise haben Kulturen von ASC-abgeleiteten Organoiden ein enormes Expansionspotenzial und sind relativ homogen, und PSC-abgeleitete Organoide sind komplexer in dem Sinne, dass sie Zellen sehr unterschiedlicher Entwicklungsherkunft (z. B. Epithel- und Mesenchymzellen) kombinieren. Von PSC abgeleitete Organoide ermöglichen die Analyse der Entwicklungsschritte, erreichen jedoch möglicherweise nicht den vollständigen Differenzierungsgrad in die Epithelschicht, wie er in vivo vorkommt [24]. Von ASC abgeleitete Organoide, die aus fötalen Geweben erzeugt wurden, könnten auch die Untersuchung der Reifung fetaler Epithelien ermöglichen, da diese in Kultur altern [24, 25].

In diesem Aufsatz werden Erkenntnisse aus Studien mit Organoiden hervorgehoben und das Potenzial dieser Technologie für die Untersuchung der angeborenen Immunität des Epithels erörtert. Unser Fokus liegt auf der regionalen Organisation im Magen-Darm-Trakt.

Regionale Identität und angeborene Immunsignale im Magen-Darm-Trakt

Bei der Betrachtung von Magen-Darm-Erkrankungen ist zu beachten, dass einige von ihnen auf einen bestimmten Abschnitt des Magen-Darm-Trakts beschränkt sind. IBD umfasst Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC), die ein unterschiedliches und krankheitsspezifisches Entzündungsmuster aufweisen: Während UC im Rektum beginnt und sich im Dickdarm befindet, kann CD alle Teile des Gastrointestinaltrakts befallen der Mundhöhle bis zum Anus. Darüber hinaus ist die Zöliakie durch eine segmentale, diskontinuierliche Entzündung im Gastrointestinaltrakt gekennzeichnet, während die UC üblicherweise als eine kontinuierliche Entzündung des Dickdarms beschrieben wird (Übersicht in [26, 27]). In der Speiseröhre, im Magen und im Dickdarm kommt es häufig zu Krebserkrankungen, und Infektionen und Entzündungen können die Entwicklung und das Fortschreiten dieser Krebsarten fördern (Übersicht in [28, 29]). Im Gegensatz dazu ist eine maligne Transformation im Dünndarm sehr selten (Übersicht in [30]). Die scheinbare Segmentspezifität dieser Erkrankungen im Gastrointestinaltrakt bleibt rätselhaft, aber es ist verlockend zu spekulieren, dass ihr regionalspezifischer Ursprung auf regionalspezifischen Störungen des eng ausbalancierten Systems der Epithelbarrierefunktion, der angeborenen Immunität und der Schleimhautregeneration beruht . Daher ist es interessant, Unterschiede in den Segmenten innerhalb des Gastrointestinaltrakts hervorzuheben.

Der Magen-Darm-Trakt besteht aus mehreren anatomisch definierten Segmenten mit sehr unterschiedlichen körperlichen Funktionen (Übersicht in [31]). Die Hauptfunktion des Magens ist die Verdauung der Nahrung und die Beseitigung eingedrungener Krankheitserreger durch die Magensäure. Nährstoffe müssen nicht die Epithelschicht des Magens erreichen; Daher investiert der Körper stark in eine schützende Schleimbarriere, die die Epithelzellen nicht nur vor ihrer Säure, sondern auch vor dem Lumeninhalt schützt (Übersicht in [32, 33]). Im Gegensatz dazu besteht die Hauptaufgabe des Dünndarms nicht nur in der Verdauung, sondern auch in der Aufnahme von Nährstoffen. Dementsprechend verfügt der Dünndarm über eine deutlich vergrößerte Oberfläche, da die Zotten in das Darmlumen hineinragen und die Zelloberflächen dort in engen Kontakt mit den Nährstoffen kommen. Der größte Teil der Verdauung findet im proximalen Dünndarm, Zwölffingerdarm und Jejunum statt, wo die Zotten lang und dünn sind. Das Jejunum weist den höchsten Anteil an Paneth-Zellen auf, die antimikrobielle Peptide absondern [34], die den eher lockeren Schleim verzieren, dadurch die Epithelschicht schützen und die Krypten steril halten (Übersicht in [35]).

Die Zotten werden zum Ileum hin immer kürzer und breiter (Übersicht in [36]), wo wiederum der Schleim einen wichtigen Teil des Schutzes übernimmt: Mit dem höchsten Anteil an Becherzellen weist das Ileum eine dickere und eine niedrigere Schleimschicht auf Verdauungs- und Absorptionsgeschwindigkeit als das Jejunum [34] (Übersicht in [31]). Schließlich absorbiert der Dickdarm wieder Wasser und bildet eine ausgedehnte, dicke und zweischichtige Schleimschicht, um Billionen Kommensalbakterien sicher zu beherbergen. Der Dickdarm hat keine Zotten und die Krypten sind kleiner als die des Dünndarms. Es gibt keine Paneth-Zellen und der Becherzellanteil kann bis zu 25 Prozent der Epithelschicht betragen [37]. Daher verfügen die drei Darmsegmente über unterschiedliche Strategien, um einen sicheren Abstand zwischen den Epithelzellen und der Mikrobiota aufrechtzuerhalten. Die MAMP-Erkennung und Aktivierung von Immunwegen ist eine weitere Ebene dieser Interaktion und daher ist es nur vernünftig, dass sie auch entlang des Gastrointestinaltrakts strukturiert sind (Übersicht in [38]). Es bleibt jedoch ein faszinierendes Rätsel darüber, was genau die Struktur der PRR-Organisation prägt.

Während es intuitiv ist, dass Gene, die für regionale Funktionen wie Verdauung und Nährstoffaufnahme wichtig sind, einer räumlichen Kompartimentierung entlang der cephalocaudalen Achse folgen (Übersicht in [39]), wurde eine solche Organisation für die epitheliale angeborene Immunsignalisierung nicht erwartet. Frühere Studien hatten über eine Regulierung der PRR-Signalübertragung als Reaktion auf die Stimulation mit MAMPs berichtet. Beispielsweise nimmt die Reaktionsfähigkeit auf TLR4 nach der Geburt ab, vermutlich aufgrund der Exposition gegenüber LPS während der Entbindung und der anschließenden Besiedlung des Darms [40]. Außerdem führt die Stimulation von TLR9 mit seinem Liganden CpG-DNA zu einer Verringerung der Tlr4-Expression und hemmt die TLR4-Signalübertragung [41]. Daher wurde erwartet, dass der Kontakt mit den Mikroorganismen, ihren Molekülen und Metaboliten im Gastrointestinaltrakt zu einer Unterdrückung der PRR-Expression in Richtung des Darmlumens führen würde (Übersicht in [14]). Widersprüchliche Ergebnisse, die durch technische Schwierigkeiten wie unzuverlässige Antikörper gegen TLRs verursacht wurden, führten jedoch zu Verwirrung auf dem Gebiet und es war unklar, ob ein bestimmtes PRR exprimiert wurde oder nicht (Übersicht in [42]). Frühe Northern Blots für mRNA von Tlr2 und Tlr4 in ex vivo isolierten Epithelzellen zeigten, dass die Expressionsniveaus dieser beiden Tlr-Moleküle segmentspezifisch waren: Tlr2 wurde hauptsächlich im Dickdarm exprimiert, während Tlr4 hauptsächlich im Magen und Dickdarm exprimiert wurde. Die Autoren nannten dies „ „strategische Kompartimentierung“ dieser TLRs [43]. Neuere Studien haben nun herausgefunden, dass dieses Prinzip der segmentspezifischen Expression über diese beiden TLRs hinausgeht, und haben eine hochkomplexe regionale Organisation der PRR-Signalisierung aufgedeckt, die nicht immer der mikrobiellen Belastung folgt [44, 45].

Die erste der beiden Studien stammte von der Barton-Gruppe und deckte mehrere Organisationsebenen der TLR-Expression auf. Die Gruppe erzeugte fünf Stämme von Reportermäusen, die eine Expressionsanalyse von TLR2, 4, 5, 7 bzw. 9 ermöglichten. TLR2 und 5 wurden im Dünndarm und im proximalen Dickdarm exprimiert, TLR4 wurde im Dickdarm exprimiert und TLR7 und 9 wurden nicht exprimiert. Die Reporterexpression in Organoiden dieser Mäuse ahmte die In-vivo-Expression stark nach, was darauf hindeutet, dass die Expression unabhängig vom Kontakt mit der Mikrobiota oder mit Immunzellen ist [45].

Die zweite Studie nutzte eine Biobank frisch erzeugter menschlicher und muriner Organoide, die die verschiedenen Segmente des Gastrointestinaltrakts abdeckten: Korpus, Pylorus, Zwölffingerdarm, Jejunum, Ileum und Dickdarm. Die Transkriptionsanalyse der Organoide bestätigte die von der Barton-Gruppe berichteten Expressionsmuster für die TLRs, zeigte aber darüber hinaus ein großes Ausmaß an unterschiedlicher Expression von TLRs, NLRs, Inflammasom-Komponenten und anderen Genen im Zusammenhang mit der angeborenen Immunität (Abb. 3 und [44]). ]). Beispielsweise wurde Nod2 hauptsächlich im Magen exprimiert, während die Expression mehrerer Komponenten des Inflammasom-Signalwegs wie Nlrp1b, Nlrp6 und Aim2 auf den Darm beschränkt war. Verschiedene Rezeptoren wurden einheitlich exprimiert; Beispielsweise wurde die Tlr3-Expression in jedem Segment des murinen Gastrointestinaltrakts in hohen Mengen nachgewiesen, wohingegen Tlr5 in jedem Segment, jedoch in geringen Mengen, exprimiert wurde [44]. Infolgedessen scheint jedes Segment über sein ganz eigenes, spezifisches Komplement an angeborenen Immunrezeptoren und Signalkomponenten zu verfügen.

Der Vergleich der murinen mit den menschlichen Magen-Darm-Organoiden zeigte, dass bei beiden Arten das Prinzip der komplexen Organisation der PRR-Signalkomponenten gleich war, die einzelnen PRR-Expressionsprofile jedoch unterschiedlich sein konnten. Einige PRRs, wie TLR4 und NLRP6, waren entlang des Gastrointestinaltrakts beider Arten ähnlich verteilt. TLR4 wurde überwiegend im Magen und Dickdarm exprimiert und die NLRP6-Expression war auf die Darmsegmente beschränkt. Andererseits zeigten mehrere PRRs wie TLR1 und TLR2 Muster, die zwischen beiden Arten unterschiedlich waren. Während bei murinen Organoiden die Expression beider entlang des Gastrointestinaltrakts zunahm und im Dickdarm am höchsten war, war die Expression bei menschlichen Organoiden im Magen am höchsten und nahm entlang des Gastrointestinaltrakts ab [44]. Darüber hinaus war die Expression von TLR5 in menschlichen Organoiden höher, wobei die höchsten Werte im Magen beobachtet wurden [44].

Wie oben erwähnt, ermöglichen Organoide auch die Prüfung, ob ein bestimmter Signalweg funktionsfähig ist, indem der Ligand hinzugefügt und anschließend die Expression des nachgeschalteten Zielgens analysiert wird. Ergänzend zur regionsspezifischen Expressionsanalyse stellte die Studie auch fest, dass menschliche und murine Organoide eine regionsspezifische Funktion aufweisen: Der Mäusemagen reagierte auf den TLR4-Liganden LPS, nicht jedoch auf den TLR2-Liganden PAM3CSK4 oder den TLR5-Liganden Flagellin, indem er den NF-Liganden hochregulierte. κB-Zielgen Cxcl2. Maus-Jejunum regulierte Cxcl2 als Reaktion auf PAM3CSK4 und Flagellin hoch, jedoch nicht als Reaktion auf LPS. Darüber hinaus exprimierte der Dickdarm Cxcl2 als Reaktion auf alle dieser drei getesteten Liganden [44]. Im Gegensatz dazu exprimierten menschliche Organoide aus allen Regionen das menschliche Cxcl2-Analogon IL-8 als Reaktion auf Flagellin, jedoch nicht als Reaktion auf LPS und PAM3CSK [44]. Daher ist nicht nur die Expression, sondern auch die Funktion von PRRs im Darm hochgradig organisiert und segmentspezifisch. Diese Experimente wurden durchgeführt, indem der Stimulus dem Organoidmedium zugesetzt wurde und somit nur die Basalseite stimuliert wurde, da die apikale Seite dem verschlossenen Lumen der Organoide zugewandt ist. Andere Experimente zeigten, dass es einen noch höheren Organisationsgrad gibt, da die PRR-Expression innerhalb eines Segments auf bestimmte Zelltypen oder sogar subzelluläre Orte, beispielsweise nur das Basalkompartiment, beschränkt werden kann. Diese werden im Folgenden näher erläutert.

Jede Region des Magen-Darm-Trakts exprimiert ihren spezifischen Satz angeborener Immungene. Obwohl eine Verallgemeinerung schwierig ist, deuten die aktuellen Daten darauf hin, dass TLRs im Magen und Dickdarm am stärksten exprimiert werden, während der Dünndarm durch die Expression von Inflammasomkomponenten gekennzeichnet ist. Derzeit sind der zugrunde liegende molekulare Mechanismus und der evolutionäre Nutzen unklar.

Wir vermuten, dass die physikalischen und chemischen Barrieren, die die Epithelschichten in den verschiedenen Darmsegmenten bedecken, jeweils eine Überwachung auf spezifische Bedrohungen erfordern. Beispielsweise haben sowohl der Magen als auch der Dickdarm eine zweischichtige, dicke Schleimschicht, wobei die innere Schleimschicht fest mit der Epithelschicht verbunden ist, während der Dünndarm von einer dünnen, zähen Schleimschicht bedeckt ist [46]. Die unterschiedliche Beschaffenheit der Schleimschichten ist wiederum wahrscheinlich auf die unterschiedlichen Funktionen der jeweiligen Darmabschnitte zurückzuführen (Verdauung vs. Nährstoffaufnahme vs. Wasserresorption). Es ist denkbar, dass die Schleimdicke die Art der an bestimmten Stellen notwendigen PRRs beeinflusst.

Spezialisierte Zellen mit Immunfunktion im Epithel

Ein seit langem bestehendes Konzept der epithelialen angeborenen Immunität ist die Existenz einer zelltypspezifischen angeborenen Immunerkennung. Prototypen der spezialisierten Epithelzellen mit Abwehrfunktion sind die Mikrofaltenzellen (M-Zellen) und die Paneth-Zellen – kürzlich ergänzt durch eine spezialisierte Becherzelle, die Sentinel-Becherzelle. Die Existenz solcher spezialisierter Zellen verdeutlicht die komplizierten und redundanten Systeme, die das Gleichgewicht der Nährstoffaufnahme, die Koexistenz mit der Mikrobiota und die Überwachung möglicher Eindringlinge gewährleisten. Die gezielte Differenzierung von Organoiden ermöglicht nun auch die Untersuchung dieser Zellen in Zellkultur.

M-Zellen befinden sich im Follikel-assoziierten Epithel, das die Peyer-Plaques bedeckt. Sie haben eine einzigartige Morphologie mit unregelmäßigen Bürstenrändern und reduzierten Mikrovilli-Strukturen. Ihre Aufgabe besteht darin, Antigene im Darmlumen über die Epithelschicht zum darunter liegenden Lymphgewebe zu transportieren, um dort Immunantworten zu regulieren [47]. Es wurde gezeigt, dass M-Zellen selbst sowie das Follikel-assoziierte Epithel mehrere TLRs exprimieren [48] (Übersicht in [14]). Allerdings war es schwierig, M-Zellen zu untersuchen, da es nicht viele davon im Epithelgewebe gibt und sie nur in der Nähe der komplexen Struktur der Peyer-Plaques zu finden sind [47]. Dennoch können M-Zellen in Organoidkulturen durch gezielte Differenzierung erzeugt werden. Hierzu wird dem Medium der Rezeptoraktivator des NF-κB-Liganden (RANKL) zugesetzt, der den für die M-Zell-Differenzierung charakteristischen Transkriptionsfaktor SpiB hochreguliert [49]. Organoide, die aus Mäusen stammen, denen die NF-κB-Untereinheit RelB genetisch fehlt, sind nach Stimulation mit RANKL nicht in der Lage, M-Zellen zu produzieren, was darauf hindeutet, dass die NF-κB-Aktivierung für die Entwicklung von M-Zellen essentiell ist [50]. In menschlichen Organoidkulturen sind neben RANKL auch Lymphotoxin und Retinsäure entscheidend für die Induktion der Differenzierung zu M-Zellen. Diese M-Zellen nehmen spezifisch enterische Viren wie Rotaviren und Reoviren auf, was auf eine korrekte Phänokopie der natürlichen M-Zellfunktion auch in organoiden Kulturen hinweist [51]. Zukünftige Organoidarbeiten müssen weiterhin den Zusammenhang zwischen epithelialer NF-κB-Signalisierung, M-Zell-Entwicklung und Kommunikation mit Immunzellen aufklären.

Paneth-Zellen sind mit den Darmstammzellen an der Basis der Krypta vermischt und gelten seit langem als Wächter des Stammzellkompartiments, da sie antimikrobielle Peptide absondern. Beispielsweise sezernieren Paneth-Zellen Alpha-Defensine, ein Prozess, der nachweislich durch mikrobielle Muster und angeborene Immunmechanismen reguliert wird [52, 53]. Darüber hinaus reguliert NOD2, das erstmals in der Kryptaregion des murinen Dünndarms nachgewiesen wurde [54], die Sekretion mehrerer Alpha-Defensine durch Paneth-Zellen, was wiederum zur Aktivierung der adaptiven Immunität führt. Paneth-Zellen exprimieren auch TLR5 und mit Paneth-Zellen angereicherte Organoide exprimieren besonders hohe Mengen an TLR5. Die RNA-Sequenzierung nach der Stimulation zeigt, dass normale Organoide des Dünndarms als Reaktion auf die Stimulation mit Flagellin, wie z. B. NF-kB-induzierten Zytokinen, nur mäßige Mengen der TLR5-Downstream-Zielgene exprimieren, während Organoide, die darauf ausgerichtet sind, eine große Anzahl von Paneth-Zellen zu enthalten, viel stärker ansteigen Reaktion, was darauf hindeutet, dass Paneth-Zellen im Dünndarm am häufigsten auf Flagellin reagieren [44, 45]. Im Gegensatz zur Zielgenexpression wird die dramatischste Reaktion von Paneth-Zellen (Degranulation, Extrusion und Zelltod) nicht durch Stimulation mit TLR-Liganden ausgelöst, sondern erfordert vielmehr eine Stimulation mit dem professionellen, von Immunzellen abgeleiteten Zytokin Interferon-Gamma [55]. Diese Ergebnisse von Organoiden stimmen mit den Beobachtungen überein, die eine Degranulation und Extrusion von Paneth-Zellen nach Interferon-Gamma-Stimulation in vivo zeigen [55]. Dies unterstreicht elegant das System der Checks and Balances in der Epithelschicht.

Becherzellen sind wichtig für die Epithelabwehr, da sie die glykosylierten Muzine produzieren, die für die Bildung einer Schleimbarriere auf der Epithelschicht entscheidend sind (Übersicht in [56]). Bei Mäusen führt ein MUC2-Mangel zu einer spontanen Entzündung und erhöht die Anfälligkeit für Infektionen [57, 58]. Kürzlich wurde eine Untergruppe von Becherzellen namens Sentinel-Becherzellen im Dickdarm von Mäusen beschrieben. Unter Verwendung von Gewebeexplantaten identifizierte die Studie eine Verdickung der Schleimschicht als Reaktion auf die Exposition gegenüber TLR1/2-, 4- und 5-Liganden, nicht jedoch gegenüber TLR9-, NOD1- und NOD2-Liganden [59], was mit einem früheren Bericht über Tlr 2 übereinstimmt ,4 und 5 werden in Becherzellen exprimiert [60]. Die Autoren stellten fest, dass die Reaktion auch vom Vorhandensein des Nlrp6-Inflammasoms abhing und unabhängig von Schleimhautlymphozyten war, indem sie Gewebe aus einer Reihe von Knockout-Mäusen verwendeten [59]. Außerdem zeigte ein früherer Bericht die Bedeutung des NLRP6-Inflammasoms für die Schleimsekretion durch Becherzellen [61]. Die Bildgebung ergab, dass bestimmte Becherzellen, die sich in den apikalen Regionen der Krypta befanden, fluoreszierend markiertes LPS endozytierten [59]. Diese neu benannten Sentinel-Becherzellen durchlaufen nach der Behandlung mit den TLR-Liganden nicht nur eine schnelle Degranulation und Epithelaustreibung, sondern übertragen auch ein Kalziumsignal über interzelluläre zytoplasmatische Brücken, die durch Gap Junctions gebildet werden, an benachbarte Zellen, was wahrscheinlich andere Becherzellen dazu anregt, die Schleimsekretion zu erhöhen [59] . Sowohl Becherzellen als auch Paneth-Zellen gehören zur Sekretionslinie. Organoide ermöglichen eine gezielte Differenzierung in Richtung beider Zellidentitäten und ergeben Organoide, die entweder stark an Becherzellen oder Paneth-Zellen angereichert sind [62]. Der Vergleich der Transkriptome dieser verzerrten Organoide half bei der Identifizierung wichtiger Regulatoren des Differenzierungswegs [63]. Eine weitere Analyse der Omics-Daten sowie eine Funktionsanalyse dieser Organoide werden ein besseres Verständnis der Rolle beider Zelltypen bei der angeborenen Immunabwehr ermöglichen.

Schließlich wurde auch berichtet, dass Stammzellen selbst spezifische PRRs wie TLR4 exprimieren [64, 65], die nicht auf den Dünndarmzotten oder Paneth-Zellen der Maus zu finden sind [66]. Darüber hinaus scheint der Großteil der Nod2-Expression in der Mauskrypta auf Stammzellen beschränkt zu sein [67]. Die Stimulation mit dem NOD2-Liganden erhöhte das Überleben von Stammzellen und die Bildung von Organoiden, was darauf hindeutet, dass die Stimulation von PRRs auch die Regeneration des Darmepithels direkt regulieren könnte.

Ohne Zweifel werden die aktuellen Bemühungen, immer detailliertere Atlanten der Genexpression zu erstellen, die jeden Zelltyp abdecken, bald ein vollständigeres Bild der zellulären Organisation der angeborenen Immunsignale im Darm sowie im gesamten Körper liefern [68–71]. ].

Zellpolarität und seitenspezifische angeborene Immunantworten

Schließlich ist es auch wichtig zu berücksichtigen, dass gastrointestinale Epithelzellen stark polarisiert sind, wobei eine spezialisierte apikale Seite dem Darmlumen mit seinen Mikrobiota zugewandt ist und eine basolaterale Seite dem Gewebe zugewandt ist. Unter Homöostase erreichen MAMPs nur die apikale Seite. Wenn jedoch die Epithelbarriere durchbrochen wird, können Mikroorganismen auch die basolaterale Seite angreifen. Es wurde daher die Hypothese aufgestellt, dass Epithelzellen nur dann selektiv eine entzündungsfördernde Reaktion auslösen können, wenn sie von der basolateralen Seite stimuliert werden, um der Bedrohung durch das Signal gerecht zu werden. Beispielsweise wurde gezeigt, dass TLR9 in Krebszelllinien unterschiedliche Signalwege induziert, wenn es von der apikalen oder basolateralen Seite stimuliert wird (72), und TLR5 induzierte nur das NF-κB-Antwortgen IL-8, wenn es von der basalen Seite stimuliert wurde (73). ].
Während frühere Studien mit Antikörpermarkierung gegen TLRs eine spezifische Expression nur auf einer Seite berichteten (Übersicht in [14, 16]), bestätigte die Analyse von TLR-Reportermäusen mithilfe der Färbung eines HA-Tags dies nicht, sondern zeigte stattdessen TLR2, 4 und 5 Rezeptoren sowohl auf der apikalen als auch auf der basalen Seite des proximalen Dickdarms sowie einige intrazelluläre TLR4 [45]. Diese scheinbaren Unterschiede sind wahrscheinlich auf die unterschiedlichen technischen Ansätze zurückzuführen.

Organoide ermöglichen nun die direkte Funktionsprüfung seitenspezifischer Immunantworten, da die zelluläre Polarisierung in Organoiden erhalten bleibt. Unter Standardbedingungen, wenn Organoide in einer extrazellulären Matrix gezüchtet werden, ist die apikale Seite dem Lumen des Organoids zugewandt und die basale Seite ist der extrazellulären Matrix zugewandt [74–76]. Bei Wachstum außerhalb einer extrazellulären Matrix kann sich die Polarität umkehren [77, 78]. Wenn Zellen aus Organoiden auf Standard-Zellkulturoberflächen wie Kulturschalen oder Transwells ausgesät werden, zeigt die apikale Seite zum Lumen des Wells [44, 79–82].

In mehreren Studien wurden Organoide verwendet, um die allgemeine Funktion bestimmter PRRs zu testen, ohne auf spezifische Unterschiede zwischen apikaler und basaler Stimulation einzugehen. Diese Studien umfassten den Reiz im Medium der Organoide, der unter Standardbedingungen die Basalseite der Zelle stimuliert. Mit dieser Technik wurde die Hochregulierung von NF-κB-Downstream-Zielgenen nach basaler Stimulation mit den Liganden TLR4 im Magen, TLR2 und 3 im Dünndarm und TLR2, 3, 4 und 5 im Dickdarm von Mäusen identifiziert [44, 45, 83] und an die Liganden von TLR2 und 5 im Magen und TLR5 im Dünndarm und Dickdarm des Menschen [44]. Darüber hinaus induzierte die Basalstimulation muriner Dickdarmorganoide mit TLR4-Agonisten die Zelldifferenzierung, insbesondere in Richtung der sekretorischen Linie [64], während NOD2-Agonisten ein erhöhtes Überleben von Stammzellen induzierten [67, 84] und Taurin die NLRP6--abhängige Hochregulation stimulierte des Inflammasom-Downstream-Zielgens IL-18 [85]. In all diesen Studien wurde die apikale Stimulation nicht getestet.

Nur wenige Studien haben sich mit den seitenspezifischen Funktionen von PRRs befasst. Bemerkenswert ist, dass im Gegensatz zu den Studien mit polarisierten Krebszelllinien bisher in keiner der Studien mit Organoiden eine seitenspezifische Aktivierung eines typischen NF-κB-abhängigen proinflammatorischen Gens festgestellt wurde. Von menschlichen Dickdarmorganoiden abgeleitete Transwell-Monoschichten exprimieren ähnliche Mengen des NF-κB-Zielgens IL-6, wenn sie von der apikalen oder basalen Seite mit den Liganden TLR1/2, 3, 4, 5, 7/8 und 9 stimuliert werden [82]. Magenorganoide von Mäusen reagierten in mehreren Tests auch auf eine apikale Stimulation mit dem TLR4-Liganden LPS, einschließlich Transwells und Mikroinjektion von LPS in das Lumen von Organoiden [44]. Epithelzellen des Dünndarms der Maus exprimierten das NF-κB-Zielgen icam1 nicht als Reaktion auf eine Reihe von Liganden, unabhängig davon, ob sie zu intakten Organoiden hinzugefügt wurden und so die Basalseite stimulierten, oder zu einzelnen dissoziierten Zellen hinzugefügt wurden und somit alle stimulierten Seiten [55].

Über die NF-κB-Reaktion hinausgehend identifizierte eine aktuelle Studie jedoch eine seitenspezifische Funktion von TLR3 und seine Bedeutung bei Virusinfektionen [82]. Ergebnisse von Experimenten mit aus Organoiden des menschlichen Dickdarms gewonnenen Monoschichten zeigten, dass die Expression der kritischen Virusabwehrgene Interferon Typ I und Typ III nach basaler Stimulation mit TLR3-Agonisten hochreguliert war, nicht jedoch nach Stimulation mit anderen TLR-Agonisten. Bei einer Infektion mit einem Virus war die Interferonreaktion der Organoide bei einer Infektion von der basalen Seite ebenfalls viel stärker als bei einer Infektion von der apikalen Seite. Dies war sowohl in von Organoiden abgeleiteten Monoschichten als auch in mit dem Virus mikroinjizierten Organoiden sichtbar. Die Studie identifizierte außerdem den Clathrin-Sortieradapter AP-1B als das Molekül, das für die polarisierte Expression von TLR3 verantwortlich ist. Dementsprechend zeigten Mäuse mit Ap-1b-Mangel nach einer Virusinfektion verstärkte Immunreaktionen [82]. Dies bestätigt die polarisierte Funktion von PRRs und unterstreicht die Bedeutung dieser Regulierungsebene für die weitere Modulation der Erkennung und Abwehr von Krankheitserregern.

Bisher gibt es keine allgemeingültige Antwort auf die Polaritätsfrage, und die Lösung der ortsspezifischen Natur der PRR-Signalisierung bleibt eine technisch anspruchsvolle Aufgabe für die Zukunft.

Toleranz als Reaktion auf die Kolonialisierung und als Standardentwicklungsprogramm

Die Mechanismen, die zur Organisation der epithelialen angeborenen Immunität beitragen, sind noch unklar. Das Hauptkonzept in diesem Zusammenhang war die Induktion von Toleranz nach der Besiedlung des sterilen Darms während der Geburt, dem sogenannten Zeitfenster (Übersicht in [86–88]). Dieses Konzept postuliert eine Vorbereitungsphase des angeborenen und adaptiven Immunsystems nach der Geburt, die die Voraussetzungen für die Immunhomöostase und die anschließenden Interaktionen zwischen Wirt und Mikroben schafft.

Das neonatale Immunsystem und die epitheliale angeborene Immunität sind in einzigartiger Weise dafür gerüstet, diesen Übergang von der Sterilität zur Koexistenz mit der Mikrobiota zu meistern. Bei der Geburt ist der menschliche Darm eines Neugeborenen vollständig ausgereift und weist Darmzotten und Krypten auf, die Paneth-Zellen enthalten. Die neonatale Darmepithelschicht der Maus ist unreifer und erfährt eine dramatische Veränderung, die auf der Transkriptomebene im Vergleich verschiedener Entwicklungsstadien messbar ist [89] und in der Gewebearchitektur und Zelldifferenzierung sichtbar ist: Die Krypta-Zotten-Achse ist noch nicht gebildet und die Zellproliferation schon niedriger, ohne Zellmigration oder Abblätterung. Es enthält keine reifen Paneth-Zellen; Enterozyten produzieren jedoch das Cathelicidin-ähnliche antimikrobielle Peptid (CRAMP) [90]. Paneth-Zellen erscheinen, wenn sich zwei Wochen nach der Geburt Krypten bilden [91]. Zum Zeitpunkt der Entwöhnung ist das Epithel vollständig mit Krypten und Zotten, Enterozyten, Becherzellen und enteroendokrinen Zellen ausgebildet; Paneth-Zellen haben die antimikrobielle Peptidproduktion übernommen; und Becherzellen haben die Produktion von Muzinen erhöht, um die Schleimschicht zu bilden (Übersicht in [92]).

Dieser altersbedingte Übergang des Epithels geht mit einer allmählichen Abnahme der TLR5-Expression im Dünndarmepithel einher. Gleichzeitig nimmt die Expression von TLR3 während der Neugeborenenperiode zu. Andere PRRs wie TLR2, 4 und 9 werden bei neugeborenen und erwachsenen Mäusen in ähnlichen Mengen exprimiert (45, 93).

Die Mechanismen, die zur Regulierung der PRR-Expression und -Funktion nach der Geburt führen, bleiben unklar. Wie oben erwähnt, haben mehrere Studien einen Beitrag der Umwelt, insbesondere der mikrobiellen Besiedlung, zur Regulierung der PRR-Expression nach der Geburt vorgeschlagen [40, 41] (Übersicht in [14]). Allerdings zeigten keimfreie und spezifisch pathogenfreie Mäuse weder im Dünndarm noch im Dickdarm Unterschiede in der TLR-Expression, was darauf hindeutet, dass weder die Hochregulierung von TLR3 noch die Herunterregulierung von TLR5 in dieser frühen Phase von der Mikrobiota abhängt [45, 93]. Auch in Organoiden wurde die Expression vieler, aber nicht aller PRR-Signalkomponenten bereits in Organoiden aus Geweben definiert, die noch nie mit mikrobiellen Produkten in Kontakt gekommen waren [44]. Dies weist darauf hin, dass ein großer Teil der Organisation der angeborenen Immunsignalwege unabhängig vom Kontakt mit der Mikrobiota definiert wird und offenbar durch standardmäßige Entwicklungsprozesse wie die oben beschriebenen bestimmt wird, die die allgemeine Gewebeidentität entlang des Gastrointestinaltrakts prägen . Dies schließt eine weitere Feinabstimmung der PRR-Expression durch Umweltfaktoren im Erwachsenenalter nicht aus.

Die Bedeutung der rechtzeitigen Regulierung epithelialer mikrobieller Interaktionen wird deutlich, wenn das unreife Epithel vorzeitig mit einer mikrobiellen Besiedlung konfrontiert wird: Frühgeborene sind anfällig für die Entwicklung einer nekrotisierenden Enterokolitis (NEC), die durch Darmnekrose, systemische Sepsis und multiple Organinfektion gekennzeichnet ist Versagen. Obwohl die Pathogenese als multifaktoriell angesehen wird, deuten mehrere Studien darauf hin, dass sie sich als Reaktion auf ein Ungleichgewicht zwischen proinflammatorischen Signalen und Reparaturmechanismen im Frühdarm entwickelt (Übersicht in [94]), und es wurde eine Beteiligung von PRRs vermutet [41, 65, 95]. –97]. In mehreren Studien wurden menschliche fötale Organoide [24, 98, 99], normale murine Organoide, die Bakterien und Hypoxie ausgesetzt waren, als Modell für NEC verwendet [100] oder Organoide aus einem murinen NEC-Modell sowie von NEC-Patienten [101]. Zukünftige Studien werden diese etablierten und neuen Organoidmodelle verwenden, um den Beitrag des Epithels in NEC weiter zu definieren.

Modellierung epithelabhängiger Aspekte von IBD mit Organoiden

Der Verlust der Integrität der Darmepithelbarriere ist ein bestimmendes Merkmal von IBD, d. h. CD und UC, und scheint durch ein multifaktorielles Zusammenspiel von genetischer Veranlagung, Umweltfaktoren, Veränderungen der Darmmikrobiota und Veränderungen der lokalen und systemischen Immunantwort verursacht zu werden (Übersicht). in [27]). Aktuelle Therapeutika zielen überwiegend auf die (abweichenden) Immunantworten bei IBD ab, die mit einer hohen Rate an Non-Respondern und Nebenwirkungen verbunden sind (Übersicht in [27]). Ein besseres Verständnis des epithelspezifischen Beitrags zur Pathophysiologie von IBD ist erforderlich, um neue therapeutische Ziele zu identifizieren, die möglicherweise auch einen direkten Einfluss auf die Wiederherstellung der intestinalen Epithelbarriere und damit auf die Schleimhautheilung haben können.

Um Einblicke in die Epithelpathologie zu gewinnen, haben mehrere Gruppen lebende Biobanken eingerichtet, die aus Organoiden einzelner Patienten mit UC oder CD bestehen. Obwohl dieser Ansatz offensichtlich ist, haben bisher nur wenige Studien über Ergebnisse von Organoiden berichtet, die aus dieser Patientengruppe stammen [102–104]. Dies kann durch die Beobachtung erklärt werden, dass Organoide von Patienten mit IBD schwieriger zu erzeugen sind. Unsere eigene Erfahrung zeigt, dass von CD-Patienten erzeugte Organoide während der ersten Passagen langsamer wachsen und einige Proben verloren gingen – was mit einer höheren Rate bakterieller Kontamination in den Kulturen verbunden war [105].

Die Charakterisierung von Organoiden von Patienten mit IBD ergab einen Phänotyp mit verringerter Größe und Knospungskapazität, erhöhter Zelltodrate, luminalen Ablagerungen und teilweise umgekehrter Polarisation von Epithelzellen [106]. Ein globaler Vergleich von Organoiden von UC- oder CD-Patienten und gesunden Kontrollpersonen zeigte, dass die im Darmepithel beobachteten Transkriptions- und Methylierungsunterschiede in vitro erhalten blieben [102, 103, 107]. Auch eine frühere Studie mit Organoiden von Patienten mit Zöliakie deutete auf dauerhafte Veränderungen der Darmstammzellen bei IBD hin. Dies basierte auf der Beobachtung, dass aus aktiven CD-Läsionen erzeugte Organoide ein hohes Expressionsniveau von Darmepithel-Stammzellmarkern aufrechterhielten [108]. Dies wurde bis zu einem gewissen Grad in einer kürzlich durchgeführten Studie bestätigt, in der Dickdarmorganoide von pädiatrischen IBD-Patienten ein verlängertes Expressionsmuster antigenpräsentierender Gene zeigten [109].

Mit Fokus auf Veränderungen in der Barrierefunktion des Darmepithels, einschließlich des Verlusts von Tight Junctions und Desmosomen, die normalerweise bei IBD zu finden sind [110], wurde gezeigt, dass Organoide von CD-Patienten diesen Phänotyp von Verbindungsveränderungen unter Kulturbedingungen beibehalten [105]. Dies war insbesondere dann der Fall, wenn Organoide aus stark entzündeten Stellen erzeugt wurden [105]. Auch in Organoiden von gesunden Spendern könnte durch die Anwendung der proinflammatorischen Zytokine TNF- und/oder IFN- eine Abnahme der Verbindungsproteine ​​induziert werden [106, 111]. Das feste Muster der Veränderungen von Verbindungsproteinen in Organoiden von Patienten mit IBD wurde jedoch nur auf Proteinebene, nicht jedoch auf mRNA-Ebene beobachtet [105].

Diese Beobachtungen legen nahe, dass in Organoiden von IBD-Patienten mehrere Veränderungen festgestellt werden. Die Beobachtung, dass einige, aber nicht alle, dauerhaften Veränderungen nur auf Protein-, nicht aber auf RNA-Ebene sichtbar sind, legt nahe, dass es in Organoiden von IBD-Patienten dauerhafte Veränderungen bei posttranskriptionellen Modifikationen oder Proteinabbau gibt. Dies muss jedoch noch im Detail untersucht werden.

Was genau die dauerhaften Veränderungen in den Expressionsmustern des entzündeten Epithels hervorruft, ist unklar. Eine Wirkung der Mikrobiota wurde lange vermutet; Eine aktuelle Studie hat jedoch gezeigt, dass die Wirkung der Mikrobiota auf das Epithel mit der Zeit verloren geht [112]. Die Studie verglich mehrere Mauseinrichtungen, da in vivo-Studien die unterschiedliche Mikrobiomzusammensetzung von Mauskolonien als Störfaktoren identifiziert wurde. Um diesen Effekt zu klären, wurden in der Studie Epithelisolate und Organoidkulturen von keimfreien Mäusen und zwei separaten, spezifisch pathogenfreien Mauskolonien mit unterschiedlichen Mikrobiota verglichen. Während das frisch isolierte Epithel einen Abdruck der Mikrobiota-Exposition auf RNA- und Proteinebene zeigte, ging dieser Effekt nach mehreren Wochen der Kultur von Dünndarmorganoiden verloren [112]. Außerdem zeigte ein globaler Vergleich der Genexpression von Organoiden, die aus entzündeten oder nicht entzündeten Regionen derselben IBD-Patienten erzeugt wurden, dass die IBD-Organoide der entzündeten Regionen bereits nach einigen Wochen in Kultur die entzündliche Genexpression verloren. Die Transkriptome der Organoide wurden dann pro Patient geclustert; Somit blieben die dauerhaften Unterschiede zwischen IBD und gesunden Kontrollpersonen bestehen. Der entzündliche Phänotyp in den IBD-Organoiden könnte dann durch die Zugabe eines Zytokin-Cocktails erneut induziert werden [107]. Insgesamt deutet dies darauf hin, dass dauerhafte Veränderungen, die in Organoiden von IBD-Patienten beobachtet werden, unabhängig vom Kontakt mit Mikrobiota oder Zytokinen sind.

Obwohl die Vermutung berechtigt ist, dass einige der dauerhaften Veränderungen in den Darmepithelzellen von Patienten mit IBD durch Veränderungen in der Signalübertragung des angeborenen Immunsystems verursacht werden könnten, gibt es hierfür derzeit kaum Belege. Darüber hinaus bleiben nicht alle in den entzündeten Regionen im Darm beobachteten Epithelveränderungen dauerhaft im gereinigten Epithel erhalten, was auf wichtige Beiträge der lokalen Umgebung hinweist. Zukünftig sollten neue Studien mit komplexeren Organoidmodellen, die auch Immunzellen, die Stimulation entzündlicher Zytokine und Kokulturen mit Mikroorganismen einbeziehen, dazu beitragen, diese Hypothese detaillierter zu untersuchen.

Schlussfolgerungen, Zukunftsperspektiven und Ausblick

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass viele Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts zwar noch immer nicht vollständig verstanden sind, doch zunehmende Belege deuten darauf hin, dass das Magen-Darm-Epithel eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese vieler von ihnen spielt – auch wenn seine spezifische Rolle weiterhin unklar ist.

Das begrenzte Wissen über die angeborene Immunfunktion des Magen-Darm-Epithels wurde auf das Fehlen geeigneter experimenteller Modelle zurückgeführt. Mit der Implementierung der Organoid-Technologie wurde ein wichtiger Schritt zur Überwindung dieses Problems getan. Organoide, die aus jeder Region des Magen-Darm-Trakts erzeugt werden, werden das vorhandene Wissen erheblich erweitern. Wie aus früheren Studien hervorgeht, bietet die Erzeugung von Organoiden den entscheidenden Vorteil, dass sie die Reaktionen primärer Magen-Darm-Zellen beobachten kann, im Gegensatz zu transformierten Zelllinien, die meist aus bösartigen Magen-Darm-Tumoren entstehen. Eines der faszinierendsten Merkmale von Organoiden ist, dass sie im Rahmen ihrer Zellidentität im Erwachsenenalter spezifische Merkmale des Abschnitts des Magen-Darm-Trakts beibehalten, aus dem sie erzeugt wurden. Aktuellen experimentellen Studien zufolge ist die regionale Identität in den gastrointestinalen Stammzellen fixiert. In diesem Zusammenhang wird es weiterhin darum gehen, genau zu bestimmen, wie und wann diese intrinsische Programmierung während der Entwicklung erfolgt.

Bei der Betrachtung spezifischer Konzepte, wie das Epithel auf die Umgebung reagieren oder mit ihr interagieren kann, hat die Organoid-Technologie nun die Aufklärung der unterschiedlichen und segmentspezifischen Expression und Funktion von PRRs innerhalb des Magen-Darm-Epithels ermöglicht. Die gesamten funktionellen Konsequenzen für die komplexen Regulationssysteme im gesamten Magen-Darm-Trakt sind noch unklar und müssen in Zukunft angegangen werden. Hierzu wird es auch wichtig sein, Organoide mit Immunzellen (Übersicht in [113]), Zellen des enterischen Nervensystems [114] und luminalen Faktoren wie bakteriellen Kokulturen (Übersicht in [115]) zu kokultivieren (Abb . 4).

Ein weiterer wichtiger Aspekt besteht darin, dass Organoide, die aus Patientengewebe gewonnen werden, das von Magen-Darm-Erkrankungen wie IBD betroffen ist, einige der Eigenschaften beibehalten, die in den entsprechenden Gewebeproben, aus denen sie gewonnen wurden, beobachtet wurden. Dies bietet die einzigartige Möglichkeit, den epithel- und krankheitsspezifischen Beitrag zur Pathogenese von Magen-Darm-Erkrankungen weiter zu entschlüsseln – nicht nur bei solchen mit entzündungsbedingten Veränderungen, sondern auch bei Veränderungen bei bösartigen Erkrankungen. Bei beiden könnte sich herausstellen, dass sie einen spezifischen Beitrag der vom Epithel abgeleiteten angeborenen Immunität beinhalten. Dafür wäre der systematische Aufbau „lebender Biobanken“ ein wichtiger Schritt. Als Zukunftsvision könnten solche lebenden Biobanken an bereits bestehende Biobanken angegliedert werden, die derzeit ausschließlich „tote“ Biomaterialien bereitstellen. Dies wäre ein weiterer wichtiger Schritt nicht nur für die Forschung, sondern auch für die Erleichterung einer individualisierten Diagnostik und Therapie für Patienten.

Kasten 1. Angeborene Immunität und Epithelzellen im Magen-Darm-Trakt. Es ist unklar, ob die beobachtete Auswirkung auf die angeborene Immunsignalisierung in Epithelzellen oder auf professionelle Immunzellen zurückzuführen ist.

Um das Zusammenspiel von professionellen Immunzellen und Epithelzellen zu entwirren, wurden in mehreren Studien epithelspezifische Knockouts oder in jüngerer Zeit epitheliale Organoide eingesetzt. In Mausmodellen führt keine der epithelspezifischen PRR-Deletionen zu einer spontanen Entzündung. Mäuse mit epithelspezifischem Knockout von MyD88 sind jedoch anfälliger für experimentelle Kolitis und zeigen schwere Barrierestörungen, beeinträchtigte Becher- und Paneth-Zellreaktionen (121) sowie eine verringerte Produktion von Mucin und antimikrobiellen Peptiden (121, 122). Dünndarm-Organoide lösen keine Entzündungsreaktion auf mehrere gereinigte PRR-Liganden aus [55], obwohl dies nicht verallgemeinert werden kann und von der Art, dem Ort und dem Alter des Gewebes abhängt, aus dem die Organoide erzeugt werden [44, 45].

Das Fehlen eines spontanen Entzündungsphänotyps in epithelzellspezifischen PRR-Knockout-Modellen stützt die Hypothese, dass andere Faktoren als eine allgemeine Entzündungsreaktion des Epithels einen Einfluss auf die epitheliale Homöostase haben. Beispielsweise erhöhte die Stimulation mit dem NOD2-Agonisten Muramyldipeptid (MDP) die Anzahl der aus isolierten Stammzellen wachsenden Organoide, was darauf hindeutet, dass die angeborene Immunsignalisierung das Überleben der Stammzellen unterstützte [67, 84]. Darüber hinaus unterstreichen Daten von Mäusen die Bedeutung der antiapoptotischen Wirkung der NF-κB-Signalübertragung als Reaktion auf andere Reize, wie z. B. TNF- [123]. Interessanterweise sind beim Menschen Polymorphismen in angeborenen Immungenen, einschließlich NOD2 und TLR4, mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung von IBD verbunden [124] und die Blockade von TNF- ist derzeit bei einigen Patienten die wirksamste Behandlung für IBD (Übersicht in [125]).

Es ergibt sich ein Bild, bei dem ein geringes Maß an angeborener Immunstimulation für die Schleimsekretion, die Barriereintegrität und das Überleben der Epithelzellen wichtig ist. Seine Beeinträchtigung kann die Verlagerung von Darmbakterien aus dem Lumen in das subepitheliale Gewebe ermöglichen, was zu einer Entzündung führt.

Danksagungen

Wir danken Ömer Kaya für die Hilfe bei den Illustrationen und Rike Zietlow für die Bearbeitung.

Autorenbeitrag

Idee: SB Erstes Konzept: SB und Ö.K.; Literatursuche: Ö.K., NS und SB; Erster Entwurf: Ö.K. Überarbeiten, Umschreiben, Hinzufügen von Abschnitten: NS, SB Alle Autoren haben das endgültige Manuskript kritisch überarbeitet.

Finanzierung

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL. Diese Arbeit wurde gefördert von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG GRK 2157; 3D-Gewebemodelle zur Untersuchung mikrobieller Infektionen durch menschliche Krankheitserreger, Projekt 10, bis SB), dem Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung (IZKF; www.med.uni-wuerzburg.de/izkf). /startseite) in Würzburg (Grant AD-427 an NS und SB) und das DFG SPP1982 SCHL1962/5-2 an NS.

Erklärungen

Interessenkonflikt

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Offener Zugang

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