Die Ablagerung von Amyloid P im Serum ist ein sensibles und spezifisches Merkmal der membranartigen Glomerulopathie mit maskierten IgG-Kappa-Ablagerungen

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Christopher P. Larsen1, Shree G. Sharma1, Tiffany N. Caza1, Daniel J. Kenan1, Aaron J. Storey2, Ricky D. Edmondson2, Christian Herzog2 und John M. Arthur2

SCHLÜSSELWÖRTER:Glomerulonephritis; maskierte Ablagerungen; Massenspektrometer; membranartige Glomerulopathie; subepitheliale Ablagerungen

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Die membranartige Glomerulopathie mit maskierten IgG-Kappa-Ablagerungen (MGMID) ist ein kürzlich beschriebenes Muster der Glomerulonephritis mit einzigartiger Histopathologie. Das Muster ist durch subepitheliale und/oder mesangiale gekennzeichnetimmunAblagerungen, die "maskiert" sind, auf Immunglobulin-Färbung durch Routine-Immunfluoreszenz, aber nach Protease-Verdau stark auf IgG und Kappa-Leichtkette färben. Patienten mit diesem Muster der Glomerulonephritis sind am häufigsten junge Frauen mit Proteinurie und einer vagen Vorgeschichte von Autoimmunerkrankungen wie antinukleären Antikörpern mit niedrigem Titer. Hier haben wir das Massenspektrometrieprofil von mittels Lasererfassung mikrodissezierten Glomeruli aus neun MGMID-Nierenbiopsien mit acht Biopsien verglichen, die andere Muster der membranösen Glomerulopathie zeigten. Das in MGMID am stärksten erhöhte Protein war Serum-Amyloid P. Die Immunfärbung zeigte Serum-Amyloid P, das mit IgG in den Glomeruli von MGMID kolokalisiert war, aber nicht mit PLA2R-assoziierter membranöser Glomerulopathie. Serum-Amyloid P war in den Glomeruli aller 32 MGMID-Biopsien positiv, aber negativ in Biopsien anderer Arten von membranösen Glomerulopathien, wie denen, die mit PLA2R und THSD7A assoziiert sind. Unter den 173 Biopsien, die die Kriterien für MGMID oder Amyloidose nicht erfüllten, befanden sich vier Biopsien mit glomerulärer Amyloid-P-Färbung im Serum. Alle vier dieser Biopsien mit positiver Serum-Amyloid-P-Färbung wiesen ein membranöses Muster einer Glomerulopathie mit IgG-Kappa-Ablagerungen auf, das sich von MGMID nur durch das Fehlen einer "Maskierung" unterschied. Somit identifiziert eine positive Färbung innerhalb glomerulärer Ablagerungen für Serum-Amyloid-P eine einzigartige Form von Glomerulonephritis, die wahrscheinlich einen gemeinsamen pathophysiologischen Mechanismus der Krankheit teilt.

Die membranartige Glomerulopathie mit maskierten IgG-Kappa-Ablagerungen (MGMID) ist ein histopathologisches Muster der Glomerulonephritis, das 2014 beschrieben wurde, was die erste Beschreibung dessen war, was als maskierte glomeruläre Ablagerungen bezeichnet wurde.1 Die charakteristische Histopathologie dieser Krankheit umfasst das Vorhandensein von mesangialen und subepithelialen Ablagerungen Ablagerungen mit IgG-Kappa-Restriktion. Obwohl die Komplementkomponente 3 (C3)-Färbung oft durch routinemäßige Immunfluoreszenz auf gefrorenem Gewebe offensichtlich ist, maskiert sich die Ig-Färbung merkwürdigerweise oft, was bedeutet, dass sie eine falsch negative Färbung durch routinemäßige Immunfluoreszenz, aber eine positive Färbung zeigt, wenn sie nach Proteaseverdau auf in Paraffin eingebettetem Gewebe wiederholt wird. Sofern der Pathologe keinen hohen Verdacht auf diese Entität aufrechterhält, könnte sie daher als C3-Glomerulopathie fehldiagnostiziert werden. Andere Krankheitsbilder, die dieses Maskierungsphänomen in glomerulären Ablagerungen aufweisen, sind membranoproliferative Glomerulonephritis mit maskierten monotypischen Ig-Ablagerungen und kryoglobulinämische Glomerulonephritis.2,3

Patienten, bei denen MGMID bei der Biopsie festgestellt wurde, sind am häufigsten junge Frauen<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>95 Prozent) waren bei der Serumproteinelektrophorese negativ für monoklonale Igs, und es wurden keine Fälle in Verbindung mit einer zugrunde liegenden hämatologischen Malignität beobachtet.4

Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die gemeinsamen klinisch-pathologischen Befunde bei MGMID-Patienten auf einen gemeinsamen molekularpathophysiologischen Mechanismus hindeuten könnten, der ihre Krankheit antreibt. Mit der erstmaligen Berichterstattung über diese Entität wollten wir eine Kohorte für die weitere Analyse definieren.1 Wir beschreiben hier das Vorhandensein der Protein-Serum-Amyloid-p-Komponente (SAP), die einzigartig in den Ablagerungen von MGMID-Glomeruli gefunden wurde. Die Immunfärbung für SAP in glomerulären Ablagerungen ist eine sensitive und spezifische Technik zur Diagnose von MGMID, die auch pathogenetische Erkenntnisse liefert.

Abbildung 1|Die Serum-Amyloid-P-Komponente (SAP) ist in mikrodissezierten Glomeruli von Patienten mit membranartiger Glomerulopathie mit maskierten IgG-Kappa-Ablagerungen signifikant angereichert. Für die statistische Analyse wurden normalisierte intensitätsbasierte absolute Quantifizierungswerte von MaxQuant (Max-Planck-Institut für Biochemie, Planegg, Deutschland) verwendet. Gestrichelte Linien zeigen heuristische Cutoffs für Fold Change und P-Wert. (a) Ein Vulkanplot, der 3 Phospholipase-A2-Rezeptor (PLA2R)-positive membranöse Fälle mit anderen vergleicht, identifiziert 2 Proteine, die klare Ausreißer im oberen rechten Quadranten sind. (b) Volcano-Plot, der 2 Thrombospondin-Typ-1-Domänen enthaltende 7A (THSD7A)-positive membranöse Fälle mit anderen vergleicht, identifiziert 2 Proteine, die klare Ausreißer sind, wobei THSD7A die größte Faltungsänderung zeigt. (c) Ein Vulkandiagramm, das Proben von membranöser Glomerulopathie mit maskierten IgG-Kappa-Ablagerungen mit allen anderen Arten von membranösen Fällen vergleicht, identifiziert 6 Proteine, die klare Ausreißer im oberen rechten Quadranten sind. C6, Komplementkomponente 6; C7, Komplementkomponente 7; CFHR1, Komplementfaktor-H-verwandtes Protein 1; HP1BP3, Heterochromatin-Protein 1-bindendes Protein 3; HPRT1, Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase 1; IGHG3, Ig schweres konstantes Gamma 3.

ERGEBNISSE

Massenspektrometrie von per Laser erfassten mikrodissezierten Glomeruli

Die massenspektrometrische Analyse von mittels Lasererfassung mikrodissezierten Glomeruli aus 9 Fällen von MGMID wurde mit 8 Fällen von membranöser Glomerulopathie (MG) verglichen, darunter 3 Fälle von Phospholipase-A2-Rezeptor (PLA2R)-positivem MG, 2 Fälle von Thrombospondin-Typ-1-Domäne-enthaltendem 7A ( THSD7A)-positives MG und 3 Fälle von Lupus MG. Bei dieser Analyse wurden insgesamt 1695 Proteine ​​identifiziert. Eine Proof-of-Principle-Analyse wurde durchgeführt, um zu testen, ob Proteine, die an der Krankheitspathogenese von MG beteiligt sind, durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden können. Für jeden bekannten Membrantyp wurde die unterschiedliche Proteinhäufigkeit mit den übrigen Gruppen unter Verwendung normalisierter intensitätsbasierter absoluter Quantifizierungswerte (iBAQ) verglichen. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung des t-Tests von Welch durchgeführt, und die Ergebnisse wurden auf einem Vulkanplot visualisiert. PLA2R war in Fällen von PLA2R-assoziierter MG signifikant häufiger und zeigte die stärkste Faltungsänderung (Abbildung 1a). THSD7A zeigte die stärksten Fold Changes in THSD7A-assoziiertem MG, wenn auch mit einem größeren P-Wert aufgrund der geringen Stichprobengröße in dieser Gruppe (n=2; Abbildung 1b). Insgesamt demonstrierte diese Proof-of-Principle-Analyse, dass die Massenspektrometrie von per Laser erfassten mikrodissezierten Glomeruli Proteine ​​identifizieren kann, die für die Pathogenese der Krankheit bei membranöser Glomerulopathie von Bedeutung sind.

Als nächstes versuchten wir unter Verwendung dieses Ansatzes, Proteine ​​zu identifizieren, die möglicherweise an der MGMID-Pathogenese beteiligt sind. Insgesamt 6 Proteine ​​waren in den MGMID-Proben im Vergleich zu den anderen Gruppen signifikant häufiger (Tabelle 1). Das Protein mit der höchsten Faltungsänderung war SAP (Abbildung 1c). Die restlichen Proteine ​​bestanden aus IgG Kappa, 3 Komplementproteinen und dem Heterochromatin-Protein 1-bindenden Protein 3 (HP1BP3). SAP wurde als Spitzenkandidat angesehen, da es in allen MGMID-Proben nachgewiesen wurde und den größten Unterschied in der Häufigkeit im Vergleich zu Nicht-MGMID-Proben aufwies. Alle Igs, die durch Massenspektrometrie in mikrodissezierten Glomeruli mit Lasererfassung aus Fällen von membranartiger Glomerulopathie mit IgG-Kappa-Ablagerungen identifiziert wurden, sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt. Spektralzählungen durch Probenentnahme aller Proteine, die eine um $ 1 log2 erhöhte Häufigkeit in MGMID-Proben und einen P-Wert #0.1 zeigten, sind in der Ergänzungstabelle S2 dargestellt.

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SAP-Färbung bei membranöser Glomerulopathie

Ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen das SAP-Protein (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) zeigte eine stark positive Färbung entlang der glomerulären Basalmembranen von Fällen mit MGMID, das bei konfokaler Analyse mit IgG kolokalisiert war. SAP zeigte keine Kolokalisation mit IgG in den Glomeruli von PLA2R-assoziiertem MG (Abbildung 2). Ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen HP1BP3 wurde in 4 Biopsien mit MGMID getestet und zeigte in allen 4 Fällen eine negative Färbung in den glomerulären Ablagerungen.

SAP-Färbung wurde an insgesamt 211 durchgeführtNiereBiopsienmit Glomerulonephritis (Tabelle 2). Insgesamt 36 Fälle mit Ablagerungen vom Immuntyp wurden positiv für SAP gefärbt. Alle positiv gefärbten Fälle teilten bestimmte histopathologische Merkmale, einschließlich des Vorhandenseins von mesangialen und subepithelialen Ablagerungen mit IgG-kappa-Restriktion und keine endokapillaren oder membranoproliferativen Veränderungen gemäß Lichtmikroskopie. SAP war in allen Fällen negativ, mit maskierten Ablagerungen, die nicht MGMID waren, einschließlich 3 Fällen von kryoglobulinämischer Glomerulonephritis und 3 Fällen von maskierter membranoproliferativer Glomerulonephritis. Es war auch in allen 19 Fällen von proliferativer Glomerulonephritis mit monoklonalen Ig-Ablagerungen (PGNMID) negativ, einschließlich Fällen mit IgG1-kappa (4 Fälle), IgG2-lambda (1 Fall), IgG-3-kappa (8 Fälle) und IgG3-lambda (6 Fälle). ). Alle 30 Fälle von polyklonaler membranöser Glomerulopathie (PLA2R, THSD7A, Lupus und segmental) waren negativ für SAP. Weitere Formen der Glomerulonephritis wurden ebenfalls untersucht und waren negativ. Unter den mit einer Infektion assoziierten Glomerulonephritis waren 7 positiv für IgG-Färbung und 6 mit Hinweisen auf subepitheliale Höckerablagerungen. Wie erwartet zeigten alle 6 Fälle von Amyloidose eine positive Färbung in Amyloidablagerungen. Das verschmierte Ablagerungsmuster stand jedoch in starkem Kontrast zu der körnigen Färbung, die in Fällen von MGMID vorhanden war. Repräsentative Mikrofotografien von Glomeruli auf SAP-Färbung von einer Vielzahl verschiedener Nierenerkrankungen sind in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt.

Alle 32 zuvor als MGMID identifizierten Fälle waren positiv für SAP. Zusätzlich gab es eine positive Färbung für SAP in den Glomeruli von 4 von 25 Fällen von membranöser Glomerulopathie mit monotypischer IgG-Ablagerung, die nicht routinemäßig maskiert wurde

Immunfluoreszenz, einschließlich 4 von 13 Fällen mit IgG1-kappa, 0 von 2 Fällen mit IgG1-lambda, 0 von 5 Fällen mit IgG2-kappa, 0 von 4 Fällen mit IgG3-kappa und {{ 12}} von 1 Fall mit IgG4-kappa. Insgesamt waren 32 von 36 (89 Prozent) der SAP-positiven Glomerulopathie maskiert und fielen in die Kategorie MGMID, während die anderen 4 von 36 (11 Prozent) demaskiert und als MG mit IgG1-Kappa-Ablagerungen diagnostiziert wurden. Patienten mit monotypischer membranöser Glomerulopathie, die nicht maskiert, aber positiv für SAP waren, hatten ein mittleres Alter von 33 Jahren, mit einem Frauen-zu-Männer-Verhältnis von 4:0. Fälle mit monotypischer membranöser Glomerulopathie, die nicht maskiert, aber negativ für SAP waren, hatten ein Durchschnittsalter von 59,3 Jahren mit einem Frauen-zu-Männer-Verhältnis von 15:4.

Tabelle 1|Proteine ​​signifikant in Glomeruli von Patienten mit erhöhtmembranartige Glomerulopathiemit maskierten IgG-Kappa-Ablagerungen, wie durch Massenspektrometrie gezeigt

Serumreaktivität gegenüber SAP

Seren von 22 Patienten mit MGMID, 12 mit PLA2R-positiver membranöser Glomerulopathie und 6 normalen Kontrollen wurden auf IgG-Reaktivität gegenüber SAP durch ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) getestet. Obwohl zwischen den Patienten in jeder Gruppe eine gewisse Variabilität bestand, gab es keinen signifikanten Unterschied in der IgG-Reaktivität gegenüber SAP zwischen den Gruppen (ergänzende Abbildung S2).

Abbildung 2|Kolokalisation von IgG und Serum-Amyloid-P-Komponente (SAP). (a–c) Immunfluoreszenzexperimente, die an einer Nierenbiopsieprobe eines Patienten durchgeführt wurden, bei dem eine membranartige Glomerulopathie mit maskierten IgG-Kappa-Ablagerungen diagnostiziert wurde, zeigen eine Färbung der granulären glomerulären Basalmembran für (a) SAP und (b) IgG. (c) Es gibt eine starke Kolokalisation von SAP und IgG in den Ablagerungen der glomerulären Basalmembran. (d–f) Immunfluoreszenzexperimente, die an einer Nierenbiopsieprobe eines Patienten mit 3 Phospholipase-A2-Rezeptor-positiven membranösen Glomerulopathien durchgeführt wurden, zeigen (d) eine negative Färbung der glomerulären Basalmembran für SAP und (e) eine positive Färbung der granulären glomerulären Basalmembran für IgG. (f) Bei diesem Patienten mit 3-Phospholipase-A2-Rezeptor-assoziierten membranösen Glomerulopathien fehlt die Kolokalisation. Um die Anzeige dieses Bildes zu optimieren, lesen Sie bitte die Online-Version dieses Artikels in Tabelle 2|Ergebnisse der Serum-Amyloid-p-Komponente (SAP)-Färbung in Nierenbiopsien

AA, Amyloid A; AL, Amyloid-Leichtkette; C3, Komplementkomponente 3; GBM, glomeruläre Basalmembran; MG, membranöse Glomerulopathie; MGMID, membranartige Glomerulopathie mit maskierten IgG-Kappa-Ablagerungen; MPGN, membranoproliferativ; Glomerulonephritis; PGMNID, proliferative Glomerulonephritis mit monoklonalen IgG-kappa-Ablagerungen; PLA2R, Phospholipase-A2-Rezeptor; THSD7A, Thrombospondin-Typ-1-Domäne enthaltendes 7A.

DISKUSSION

MGMID ist ein kürzlich beschriebenes und einzigartiges Muster der Glomerulopathie, das durch subepitheliale und mesangiale Ablagerungen gekennzeichnet ist, die durch Paraffin-IF auf IgG kappa gefärbt werden (Abbildung 3). Patienten mit diesem Muster der Glomerulopathie sind in der Regel junge Frauen (Alter<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">

SAP ist ein 25--kDa-Pentraxin-Protein innerhalb der Pentraxin-Familie, das vom APCS-Gen kodiert wird und reichlich im Serum und als Bestandteil der glomerulären Basalmembran vorkommt.5 Obwohl die genaue Funktion von SAP unklar ist, ist sie bekannt im Plasma mit einer Vielzahl von Proteinen, einschließlich Komplementkomponenten, Apolipoproteinen und Gerinnungs- und Proteolyseregulatoren, zu interagieren.6 Es bildet stabile, kalziumabhängige Wechselwirkungen mit seinen Liganden, einschließlich Proteinen, Lipoproteinen und DNA, und schützt sie vor Abbau. SAP dient als lösliches Mustererkennungsmolekül, das an der angeborenen Immunantwort beteiligt ist und eine Vielzahl von mit Pathogenen und Schäden assoziierten molekularen Mustern erkennt, einschließlich mikrobieller Komponenten und apoptotischer Zelltrümmer.7 Die Wechselwirkung von SAP mit mit Pathogenen oder Schäden assoziierten Molekülen Muster fördert die komplementvermittelte Beseitigung von apoptotischen Zelltrümmern durch direkte Bindung an die Komplementkomponente 1q (C1q) und Aktivierung des klassischen Komplementwegs. Trotz Komplementaktivierung vermittelt SAP bekanntermaßen eine Immunregulation, wodurch die Neutrophilen verringert werdenEntzündunginnerhalb von Geweben durch reduzierte Endothel-Adhäsion8, reduzierte Elastase-Funktion9 und reduziertes Homing zu Geweben.10 SAP ist auch als das wichtigste Bindungsprotein für DNA und Chromatin im Plasma bekannt.11

Bei Krankheiten ist SAP am besten dafür bekannt, dass es ein Teil der Ablagerungen von Amyloidose ist. Obwohl weniger gut untersucht, gibt es auch Hinweise darauf, dass es in menschlichen und tierischen Modellen von Autoimmunerkrankungen eine Rolle spielen könnte. SAP-Antikörper wurden bei Patienten mit identifiziertAutoimmunKrankheiten, und eine reduzierte SAP-Expression fördert nachweislichAutoimmunitätbei Mausmodellen. Antikörper gegen SAP werden bei 44 Prozent der Patienten mit systemischem Lupus erythematodes identifiziert, wobei die Antikörpertiter mit der Krankheitsaktivität korrelieren.12 Es wurde festgestellt, dass ein SAP-Mangel zur Entwicklung einer spontanen Autoimmunität bei autoimmunanfälligen C57BL/6-Mäusen und bei nicht-autoimmunen Mäusen führt anfällige 129/Sv-Mäuse bei Kreuzung mit C57BL/6-Mäusen (129/Sv x C57BL/6 F2)13, aber nicht im 129/Sv-Stamm allein, was darauf hindeutet, dass eine zugrunde liegende genetische Anfälligkeit für SAP-Mangel erforderlich sein könnte, um Autoimmunität zu induzieren.14 Die Mäuse zeigen die Produktion von antinukleären Antikörpern, Anti-Einzelstrang-DNA, Anti-Doppelstrang-DNA-Antikörpern und Rheumafaktoren. Sie entwickeln eine proliferativeimmunKomplex-vermittelte Glomerulonephritis, häufiger bei Frauen.13 In einem murinen Lupusnephritis-Modell, bei dem Glomerulonephritis durch Injektion von aktivierter Eigen-DNA in Serum induziert wird, reduzierte die SAP-Gentherapie durch einen Plasmidvektor die Produktion von Anti-Doppelstrang-DNA-Antikörpern , Immunkomplexablagerung und Nierenentzündung und verhinderte das Auftreten von Lupusnephritis.15

Abbildung 3|Nierenbiopsiebefunde bei membranöser Glomerulopathie mit maskierten IgG-Kappa-Ablagerungen. Mikrofotografien aus der in Abbildung 2 gezeigten Biopsie sind hier gezeigt. (a) Segmentale Stacheln sind entlang der glomerulären Basalmembranen vorhanden, durch Jones-Methenamin-Silberfärbung (ursprüngliche Vergrößerung × 400). (b) Elektronenmikroskopie zeigt subepitheliale Ablagerungen, die entlang der glomerulären Basalmembran vorhanden sind (ursprüngliche Vergrößerung × 12, 000). (c) Glomeruli-Färbung negativ für IgG durch routinemäßige Immunfluoreszenz auf frischem Gewebe (direkte Immunfluoreszenz; Originalvergrößerung × 400). (d) Glomeruli aus demselben Fall färben sich nach Proteaseverdau positiv auf in Paraffin eingebettetem Gewebe (direkte Immunfluoreszenz; Originalvergrößerung × 400). (e) Glomeruli zeigen Färbung für Kappa und (f) nicht Lambda auf dem Protease-verdauten Paraffin-eingebetteten Gewebe (direkte Immunfluoreszenz; ursprüngliche Vergrößerung × 400). Um die Anzeige dieses Bildes zu optimieren, lesen Sie bitte die Online-Version dieses Artikels unter www.Niere-international.org.

Trotz der bei der Biopsie beobachteten Leichtketten-Restriktion gibt es derzeit keinen Hinweis darauf, dass diese Entität mit zugrunde liegenden lymphoproliferativen Erkrankungen oder zirkulierenden monoklonalen Igs assoziiert ist.4 Daher sollte MGMID nicht als im Spektrum der monoklonalen Gammopathie mit renaler Bedeutung betrachtet werden Zeit. Die Rolle von SAP-Autoantikörpern ist ebenfalls ungewiss. Im Gegensatz zu anderen Formen der membranösen Glomerulopathie mit einem Protein, das spezifisch in den Immundepots vorhanden ist, wie z. B. der PLA2R-assoziierten Krankheit,16 scheint MGMID nicht von Autoantikörpern angetrieben zu werden, die gegen SAP gerichtet sind, da wir bei MGMID-Patienten keine Serumantikörperreaktivität gegen SAP feststellen konnten . Eine alternative Erklärung ist, dass IgG-kappa als Ergebnis einer normalen Interaktion zwischen diesen beiden Proteinen vorhanden ist und nicht als Ergebnis einer autoimmunen Antigen-Antikörper-Interaktion, da bekannt ist, dass die Ig-kappa-Kette Teil des normalen Interaktoms von Serum-SAP ist.6 Daher gilt: Obwohl für die Gewebediagnostik dieser Entität nützlich, dient das Testen auf SAP-Antikörper im Serum derzeit nicht als nichtinvasive Diagnose, und die zugrunde liegende Ursache dieser Krankheit bleibt ein Rätsel.

Die klinischen Ergebnisse bei MGMID sind äußerst unterschiedlich und reichen von spontaner Remission bis zur Progression bis zum EndstadiumNiereErkrankungmit Rezidiv in der Transplantation. Eine retrospektive Analyse konnte keinen Zusammenhang zwischen der angewendeten Behandlung und dem klinischen Ergebnis zeigen.4 Die Entdeckung einer SAP-Beteiligung an dieser Krankheit hat möglicherweise Auswirkungen auf die Therapie. Behandlungen, die direkt auf SAP abzielen, haben sich bei der Behandlung von Amyloidose als vielversprechend erwiesen.17,18 Darüber hinaus deuten die Ergebnisse der Massenspektrometrie darauf hin, dass Therapien, die auf die Komplementkaskade abzielen, bei der Behandlung dieser Form der Glomerulonephritis von Nutzen sein könnten, da die meisten Proteine ​​erhöht waren in MGMID sind die Glomeruli komplementbezogen. Zusätzliche Studien sind erforderlich, um Aktivitätsbiomarker für diese Krankheit sowie Therapien zu identifizieren.

Der Grund für die Maskierung von Immunablagerungen in MGMID-Biopsien bei routinemäßiger Immunfluoreszenz bleibt ein Rätsel. Das Vorhandensein von SAP in den Ablagerungen wirft neue mögliche Erklärungen für dieses Phänomen in Fällen von MGMID auf. Beispielsweise sind Wechselwirkungen des SAP-Proteins bekanntermaßen stark Ca2þ-abhängig,6 und viele der Transportmedien und Puffer, die bei der Verarbeitung von Nierenbiopsiegewebe für die Immunfluoreszenz verwendet werden, enthalten kein Ca2þ. Dieses in vitro-Fehlen von Ca2þ könnte zu einer Zerstörung von Immunablagerungen führen, so dass sie nicht mehr für den Nachweis durch Immunfluoreszenz auf dem gefrorenen Gewebe verfügbar sind. Die Immunkomplexablagerungen würden jedoch als Ergebnis der durch Formalin induzierten kovalenten chemischen Bindungen zwischen Proteinen im Gewebe für den Nachweis in dem formalinfixierten Gewebe verfügbar bleiben.

Wir beschreiben hier zum ersten Mal die einzigartige Präsenz von SAP in den glomerulären Ablagerungen von MGMID. Zusätzlich zeigen wir diese Färbung vonNiereBiopsienfor SAP identifiziert Fälle mit klinisch-pathologischen Merkmalen ähnlich denen in MGMID, ohne Maskierung, durch routinemäßige Immunfluoreszenz. Angesichts dieser Ergebnisse glauben wir, dass eine positive Färbung innerhalb glomerulärer Ablagerungen für SAP eine einzigartige Form der Glomerulonephritis identifiziert, die einen gemeinsamen pathophysiologischen Krankheitsmechanismus aufweist. Bis zur jüngsten Beschreibung von MGMID wurden diese Fälle in zahlreiche unterschiedliche Kategorien eingeteilt, die von C3-Glomerulopathie über infektionsassoziierte Glomerulonephritis bis hin zu atypischer membranöser Glomerulopathie reichten.1 Die schnelle Entwicklung der diagnostischen Kriterien und unser Verständnis dieser Form der Glomerulonephritis unterstreichen die Macht der Masse Spektrometrie, um pathophysiologische Einblicke in die immunvermittelte Glomerulonephritis zu erhalten.

METHODEN

Verarbeitungstechniken für Nierenbiopsien

Es wurden Standardverarbeitungstechniken für Nierenbiopsien verwendet, einschließlich Licht, Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie.19,20 Alle Lichtmikroskopieproben wurden mit Hämatoxylin und Eosin, Jones-Methenaminsilber, Masson-Trichrom und Periodsäure-Schiff-Reagenz gefärbt. Alle direkten Immunfluoreszenzschnitte wurden bei 4 mm geschnitten und mit flfluoresceinmarkierten polyklonalen Kaninchen-Anti-Mensch-Antikörpern gegen IgG, IgA, IgM, C3, C1q, Fibrinogen und k- und l-Leichtketten (Dako, Carpenteria, CA) umgesetzt. für 1 Stunde und gespült; ein Deckglas wurde unter Verwendung von wässrigen Eindeckmedien aufgetragen. Ausgewählte Fälle wurden auf mit Flfluorescein markierte polyklonale Maus-Anti-Mensch-Antikörper gegen IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) gefärbt. Paraffin-Immunfluoreszenz wurde nach Proteaseverdau wie zuvor beschrieben durchgeführt.2,3 Insgesamt wurden 9 MGMID-Biopsien und 8 Vergleichskontrollbiopsien mit membranöser Glomerulopathie anderer Typen für die massenspektrometrische Analyse ausgewählt. Das Studienprotokoll wurde vom Solutions Institutional Review Board genehmigt und entspricht den Prinzipien der Deklaration von Helsinki.

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Massenspektrometrie von per Laser erfassten mikrodissezierten Glomeruli

Nierenbiopsiegewebe aus Formalin-fixiertem Paraffin-eingebettetem Gewebe wurde in einer Dicke von 10 mm auf Leica PET-Membranrahmen-Objektträger (Leica, Wetzlar, Deutschland) geschnitten. Diese Objektträger wurden dann mit Hämatoxylin gefärbt. Die Glomeruli wurden unter Verwendung eines Leica DM60{{20}}0B-Mikroskops in Mikrozentrifugenröhrchen mikrodisseziert. Die mikrodissezierten Glomeruli wurden in 2 Prozent Natriumdodecylsulfat und 0,1 M Dithiothreitol bei 99 Grad für 1 Stunde lysiert und durch filterunterstützte Probenvorbereitung (FASP) verarbeitet.21 Das geklärte Lysat wurde auf Vivacon 500-Konzentratoren (MWCO von 30 kDa; Sartorius , Göttingen, Deutschland). Natriumdodecylsulfat wurde durch wiederholtes Waschen mit 8 M Harnstoff in 0,1 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan/Cl, pH 8,5 entfernt; die Proben wurden dann mit 0,05 M Jodacetamid alkyliert. Jodacetamid wurde durch 3 Waschungen mit 8 M Harnstoff/0,1 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan/Cl, pH 8,5, gefolgt von 3 Waschungen mit 0,05 M Ammoniumbicarbonat entfernt. Proteine ​​wurden mit Trypsin (Sequenzqualität, Promega, Madison, WI) bei einem 40:1 w/w-Verhältnis bei 37 Grad für 16 Stunden verdaut. Peptide wurden durch Zentrifugation gesammelt und auf C18--Stufenspitzen (Thermo Scientific, Waltham, MA) entsalzt.

Verdaute Peptide wurden durch NanoLC-Tandem-Massenspektrometrie unter Verwendung eines Massenspektrometers Thermo Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific) analysiert. Die Peptide wurden auf eine Reverse-Phase-Trap-Säule (Integra-frit, New Objective, Woburn, MA) geladen, die 2,5 mm Waters XSelect (Waters Corp., Milford, MA) Hybridharz mit geladener Oberfläche enthielt, das an 15 0 mm gekoppelt war X 0.0 75-mm-Analysensäule, die das gleiche Umkehrphasenharz enthält, das in der Falle verwendet wird. Dann wurde ein nanoAcquity-Ultraperformance-Flüssigkeitschromatographiesystem (Waters Corp.) verwendet, um einen 60--minütigen Gradienten von 98:2 bis 60:40 Puffer A: B-Verhältnis (Puffer A ¼ 0,1 Prozent Ameisensäure) zu erzeugen , 0,5 Prozent Acetonitril, Puffer B=0,1 Prozent Ameisensäure, 99,9 Prozent Acetonitril).

Die Peptide wurden von der Säule mit einer integrierten Sprühspitze (Picofrit, New Objective) eluiert und durch Elektrospray (2,0 kV) ionisiert, gefolgt von einer Tandem-Massenspektrometrie-Analyse unter Verwendung von kollisionsinduzierter Dissoziation bei höherer Energie (HCD). Übersichtsscans von Peptidvorläufern wurden bei einer Auflösung von 240 K (bei 400 m/z) mit einem Target mit einer Ionenzahl von 5 x 10&sup5; durchgeführt. Tandem-Massenspektrometrie wurde durch Isolierung bei 1,6 Th mit dem Quadrupol, HCD-Fragmentierung mit einer normalisierten Kollisionsenergie von 30 und Rapid-Scan-Massenspektrometrie-Analyse in der Ionenfalle durchgeführt. Die erhaltenen Tandem-Massenspektrometriedaten wurden mit der neuesten Uniprot-Humandatenbank abgeglichen, die sowohl die Swiss Prot- als auch die TREMBLE-Einträge enthielt

MaxQuant (Max-Planck-Institut für Biochemie, Planegg, Deutschland). Die Visualisierung der Daten erfolgte mit Scaffold v4.6 (Proteome Software, Portland, OR). Die Falschentdeckungsrate wurde für die Peptid-zu-Spektrum-Übereinstimmungen auf 1 Prozent festgelegt. Zur Quantifizierung wurden normalisierte iBAQ-Werte von MaxQuant verwendet. Die iBAQ-Verteilungen für jede Probe wurden Median-angepasst, um Unterschiede in der Beladung zu kontrollieren. iBAQ-Werte gleich Null wurden aus dem Datensatz entfernt. Für statistische Hypothesentests wurde ein 2- Welch's t-Test für jedes Protein unter Verwendung normalisierter iBAQ-Werte für die 2 Gruppen durchgeführt. Wenn ein Protein nur in einer Gruppe nachgewiesen wurde, wurde ein 1-Stichproben-Welch-t-Test durchgeführt, wobei der kleinste nachgewiesene iBAQ-Wert als Nullhypothese verwendet wurde.

SAP-Färbung

Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Schnitte, geschnitten bei 3 mm, wurden entparaffiniert, und die Antigen-Gewinnung wurde bei 99 Grad durchgeführt. Die Schnitte wurden mit polyklonalem Kaninchen-anti-SAP-polyklonalem Antikörper (1:400; ThermoFisher, Waltham, MA) umgesetzt, gefolgt von einem Rhodaminrot-X-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärprodukt, das festphasenadsorbiert wurde, um eine minimale Kreuzreaktion mit dem Menschen sicherzustellen IgG (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Jeder Fall wurde mit positiven und negativen Kontrollen durchgeführt. Die Färbung wurde durch Standard-Immunfluoreszenzmikroskopie bewertet. Es wurde als positiv beurteilt, wenn eine positive Färbung der granulären Kapillarschleife in den Glomeruli vorlag, und als negativ, wenn keine Kapillarschleife vorhanden war

Färbung in den Glomeruli. Die Kolokalisation von IgG und SAP in den glomerulären Basalmembranen wurde durch konfokale Mikroskopie unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops Zeiss LSM 880 (Zeiss Microscopy, Jena, Deutschland) untersucht. Für diese Analyse wurde polyklonales (Fluorescein-Isothiocyanat-konjugiertes) Kaninchen-Anti-Human-IgG (1:40; Agilent, Santa Clara, CA) mit dem wärmebehandelten Gewebe nach der Färbung für SAP wie oben beschrieben umgesetzt. Es wurden Negativkontrollen durchgeführt, um die Antikörperspezifität sicherzustellen, indem primäre Antikörper weggelassen wurden. Vier Fälle von MGMID wurden durch Immunoperoxidase-Färbung auf das Vorhandensein von HP1BP3 (1:100; Thermo Fisher, Waltham, MA) getestet.

Test auf Serum-Antikörper gegen SAP

SAP-Protein (R & D Systems, Minneapolis, MN; {{0}}SAB-050) wurde auf 3 ng/ml in Carbonat-Bicarbonat-Puffer (pH 9,6) verdünnt und auf eine {{ 6}} Well Immulon H2-Platte (Thermo Scientific) über Nacht bei 4 Grad. Die Platten wurden dreimal mit 200 ml Waschpuffer (1 × Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung und 0,05 % Tween) gewaschen und für 2 Stunden mit Blockierungspuffer (1 × Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, 0,05 %) blockiert Tween, 1 Prozent Fischgelatine). Die Platten wurden dann dreimal mit 200 ml Waschpuffer gewaschen. Zwanzig Mikroliter verdünntes Serum (1:100 in Waschpuffer) wurden pro Vertiefung zugegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden 7× mit 200 ml Waschpuffer gewaschen, gefolgt von der Zugabe des Detektionsantikörpers, Anti-Human-IgG-HRP (Jackson ImmunoResearchLaboratories; 309-035-003). Die Platten wurden 7x mit 200 ml Waschpuffer gewaschen. Als nächstes wurden 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin-Peroxidase-Substrat und Peroxidase-Substrat Sol B in einem Verhältnis von 1:1 gemischt, und 100 ml wurden zu der Platte gegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 ml 2 M H 2 SO 4 gestoppt und 20 Minuten lang auf dem Labortisch belassen, bevor bei 450 nm abgelesen wurde. Zur Kontrolle, um sicherzustellen, dass das SAP-Protein an die Platte gebunden ist, verwendeten wir Kaninchen-Anti-SAP (Invitrogen, Carlsbad, CA; PA1-28361) in einer Reihenverdünnung, gefolgt von Anti-Kaninchen-IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories ; 111-035-144). Die Kontrolle zeigte eine gute Korrelation zwischen der Antikörperverdünnung und der Extinktion mit einem mittleren R-Quadrat-Wert von 0,95.

Cistanche für die VerbesserungNiereFunktion

OFFENLEGUNG

Alle Autoren erklärten keine konkurrierenden Interessen.

ERGÄNZEND

MATERIAL Ergänzende Datei (PDF)

Abbildung S1. Repräsentative Bilder der glomerulären SAP-Färbung bei einer Vielzahl von Nierenerkrankungen.

Abbildung S2. Anti-SAP-Seroreaktivitätsstudien durch enzymgebundenen Immunosorbent-Assay.

Tabelle S1. Alle Igs, die durch Massenspektrometrie in mikrodissezierten Glomeruli mit Lasererfassung aus Fällen von membranartiger Glomerulopathie mit IgG-Kappa-Ablagerungen identifiziert wurden.

Tabelle S2. Spektralzählungen durch eine Stichprobe aller Proteine ​​zeigten eine um $1 log2 erhöhte Häufigkeit in MGMID-Proben und einen P-Wert # 0,1.

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