Glykoside von Cistanche verbessern das Lernen und Gedächtnis im Rattenmodell der vaskulären Demenz

für weitere Informationen:ali.ma@wecistanche.com

J. CHEN1,2, S.-N. ZHOU1, Y.-M. ZHANG2, Y.-L. FENG2, S. WANG2

1Abteilung für Neurologie, Qilu-Krankenhaus der Shandong-Universität, Jinan, China. & Brain Science Research Institute, Shandong University, Shandong, VR China

2Abteilung für Neurologie, Volkskrankenhaus der Autonomen Region Innere Mongolei, VR China

Jin Chen und Yan-Mei Zhang haben zu gleichen Teilen zu dieser Studie beigetragen

Abstrakt.- ZIELSETZUNG:Glykoside von Cistanche(GC) werden aus Xin Jiang extrahiertCistanche, das als chinesisches Kraut weit verbreitet ist. Diese Studie zielt darauf ab, die Auswirkungen von GC auf vaskuläre Demenz (VD) zu bewerten.

MATERIAL UND METHODEN: Das VD-Modell wurde durch die Ligatur der bilateralen gemeinsamen Halsschlagader bei erwachsenen Wistar-Ratten, die täglich eine ip-Gabe von Kochsalzlösung, GC (10 mg/kg Körpergewicht/d, ip) oder erhielten, etabliert Oxiracetam (450 mg/kg Körpergewicht/d, ip) für 14 Tage. Der Morris Water Maze-Test bewertete die kognitive Leistungsfähigkeit der Ratten. Der Hippocampus wurde präpariert und einer Proteomik und immunhistochemischen Analyse unterzogen. ERGEBNISSE: Die GC-Gruppe zeigte vier und fünf Tage nach der Operation eine signifikant geringere Fluchtlatenz als die VD-Gruppe. Sie zeigten keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zur scheinoperierten Gruppe und der Oxiracetam-Kontrollgruppe. Im Hippocampus zeigten die 21 Proteinspots in der GC-Gruppe im Vergleich zur VD-Gruppe unterschiedliche Expressionsniveaus. Dazu gehörten die vier Proteine, die einen signifikanten Unterschied zeigten: drei hochregulierte Proteine, Thioredoxin-ähnliches Protein 1, mitogenaktivierte Proteinkinase-Kinase 1 mit doppelter Spezifität und Dihydropyridinnase-verwandtes Protein 2 (CRMP-2) und eines herunterregulierte Protein-Glutathion-Synthetase. Die immunhistochemische Analyse zeigte, dass der P-Tau-Proteinspiegel in der VD-Modellgruppe signifikant höher war als in der scheinoperierten Gruppe (p < 0,05).="" nach="" der="" gc-behandlung="" zeigte="" der="" p-tau-proteinspiegel="" in="" vd-modellratten="" eine="" signifikante="" abnahme="" im="" vergleich="" zu="" der="" mit="" kochsalzlösung="" behandelten="" vd-gruppe="" (p="">< 0,05).="" schlussfolgerungen:="" der="" gc="" spielt="" eine="" entscheidende="" rolle="" beim="" schutz="" der="" hippocampalen="" neuronen="" im="" vd,="" indem="" er="" die="" p-tau-phosphorylierung="" verringert="" und="" das="" expressionsniveau="" von="" crmp-2="" erhöht.="" die="" pharma-ökologische="" manipulation="" von="" gc="" bietet="" eine="" neue="" möglichkeit="" für="" die="">

Schlüsselwörter:

Vaskuläre Demenz, Cistanche-Glykoside, Proteomik, P-tau, Dihydropyrimidinase-verwandtes Protein 2.

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Einführung

Vaskuläre Demenz (VD) ist die zweithäufigste Altersdemenz und wird hauptsächlich durch ischämische zerebrovaskuläre Erkrankungen verursacht. VD führt zu heterogenen kognitiven Beeinträchtigungen, und es werden neue wirksame Therapeutika benötigt, die das Fortschreiten von VD behandeln oder verhindern1. Es gibt jedoch immer noch kein wirksames chinesisches Kraut zur Verbesserung der durch zerebrale Ischämie induzierten kognitiven Beeinträchtigung.

Glykoside von Cistanche (GC) wurden weithin als Kraut mit neuroprotektiven Wirkungen verwendet. Herba Cistanches Extract verstärkt dieLernen und Gedächtnisvon Mäusen durch die Förderung der neuronalen Zelldifferenzierung, des Neuritenwachstums und der Synapsenbildung2. Glykoside von Cistanche können die Apoptose in Kleinhirn-Körnerneuronen verhindern und eine Anti-Apoptose-Wirkung ausüben, indem sie die Aktivierung von Caspase-3 und Caspase-83 hemmen. Echinacosid, ein Hauptwirkstoff von Herba Cistanches, reicht aus, um neuronale Zellen vor Rotenon-Schäden zu schützen, indem es die Trk-Signalgebung aktiviert4. Die Mechanismen, durch die GC die kognitive Beeinträchtigung bei VD verbessert, sind jedoch noch weitgehend unbekannt.

Tau-Protein ist ein mit neuronalen Mikrotubuli assoziiertes Protein, das neuronale Mikrotubuli stabilisiert. Die Phosphorylierung des Tau-Proteins (P-Tau) beeinflusst seine Fähigkeit, mit Mikrotubuli zu interagieren, und beeinflusst die synaptische Übertragung. Die Anhäufung von neurofibrillären Tangles (NFTs) besteht aus P-Tau-Protein und ist eines der Hauptmerkmale der Alzheimer-Krankheit (AD)5. Es ist bekannt, dass VD und AD die beiden häufigsten Demenzerkrankungen sind. Sie haben eine gemeinsame Korrelation mit vaskulären Risikofaktoren wie Bluthochdruck, Diabetes mellitus und Hypercholesterinämie. Daher kann P-tau auch an VD beteiligt sein.

Wir haben die Auswirkungen von GCs auf bewertetLern-Memory-Funktionin einem Rattenmodell von VD und führten proteomische und immunhistochemische Analysen am Hippocampus von VD-Ratten durch, um einen Einblick in die neuroprotektiven Wirkungen von GC zu erhalten. Unsere Ergebnisse zeigten, dass GCverbessertes Lernen und Gedächtnisin VD-Ratten und veränderte die Spiegel von Proteinen wie P-Tau in VD-Ratten.

Materialen und Methoden

Tiere

Sechs Monate alte männliche Wistar-Ratten (Gewicht 230- 270 g) wurden vom Versuchstierzentrum der Provinz Hubei, China, bereitgestellt. Alle experimentellen Tierverfahren wurden gemäß den Tierpflegerichtlinien und den lokalen ethischen Vorschriften des Krankenhauses Nr. 1 in Wuhan, China, durchgeführt. Die Ethik-Zulassungsnummer lautet 00014834. Die Tiere wurden getrennt in Gruppen von 4 pro Käfig bei 25 Grad mit einem Zyklus von 12-Stunden Licht/12-Stunden Dunkelheit und freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. Die Tiere (n=45) wurden zufällig vier Gruppen zugeteilt: Modellgruppe (n=12), scheinoperierte Gruppe (n=11), GC-behandelte Gruppe (n{{14} }) und mit Oxiracetam behandelte Kontrollgruppe (n=10).

Bilaterale Halsschlagaderligatur (2-VO)

Unter tiefer Narkose mit 10 Prozent Chloralhydrat (Tianjin Damao Chemical Reagent Factory Reagenz, Tianjin, China) (350 mg/kg Körpergewicht,

ip) wurden bilaterale Arteria carotis communis (CCA) vorsichtig vom umgebenden Gewebe getrennt und dann fest mit der Naht ligiert. Die Haut wurde anschließend rekonstruiert und die Ratten wurden anschließend bei Raumtemperatur gehalten und bis zur Wiederbelebung in den Heimkäfig zurückgebracht. Scheinoperierte Kontrollratten wurden demselben chirurgischen Verfahren ohne CCA-Ligation unterzogen. VD-Ratten wurden mit GC (10 mg/kg Körpergewicht/d, ip) oder Oxiracetam (450 mg/kg Körpergewicht/d, ip) unmittelbar nach der Operation für 14 aufeinanderfolgende Tage behandelt. Der Modellgruppe wurde das gleiche Volumen normaler Kochsalzlösung injiziert.

Morris-Wasserlabyrinth-Test

Der MWM-Test wurde gemäß einer zuvor beschriebenen Methode7 durchgeführt. Der Testbereich bestand aus einem kreisförmigen Becken, das mit Wasser (25 ± 1 Grad) gefüllt war und mit Milch undurchsichtig gemacht wurde, so dass die Ratten nicht in der Lage waren, die Unterwasserplattform 1 cm unter der Wasseroberfläche zu sehen. Das Becken wurde in vier Quadranten (bezeichnet als Zonen I, II, III und IV) unterteilt und eine Plattform wurde in Zone II untergetaucht. An der Wand des Testraums wurden visuelle Hinweise angebracht. Die Tiere wurden an einem der vier Anfangsquadrantenpunkte ins Wasser gesetzt, der während der Versuche zufällig variiert wurde. Den Ratten wurden 2 min gegeben, um die Plattform zu finden und 15 s darauf zu sitzen. Ratten, die den Ort nicht innerhalb einer bestimmten Zeit fanden, wurden sanft zur Plattform geführt und durften dort 15 Sekunden lang bleiben. Ein automatisches Tracking-System wurde verwendet, um den Schwimmweg, die Latenz, die Schwimmdistanz und die Zeit in jeder Zone aufzuzeichnen. Alle Ratten wurden zwei Wochen nach dem MWM-Test für die anschließende Analyse getötet.

Proteinextraktion

Unter tiefer Anästhesie mit 10 Prozent Chloralhydrat wurden alle dem MWM-Test unterzogenen Ratten geköpft. Die Hippocampus-Gewebe wurden schnell auf Eis geerntet und dann sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Alle Gewebe wurden unter flüssigem Stickstoff unter Verwendung von Mörser und Pistill homogenisiert und in Lysepuffer (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 2 Prozent CHAPS, 20 mM Tris) gesammelt. Unlösliche Partikel wurden durch Zentrifugation bei 12 000 U/min für 20 min bei 4 Grad entfernt. Kontaminierte Nukleinsäuren in den Proben wurden durch intermittierende Schalloszillation für 5 min aufgeschlossen. Die Überstände wurden nach Zentrifugation unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben gesammelt. Die Proteinkonzentration in den Überständen wurde durch den Bradford-Assay gemessen, und die Überstände wurden bei 80 Grad gelagert.

Zweidimensionale Gelelektrophorese

Die Proteinaliquots (120 µg) wurden mit einem Rehydratisierungspuffer (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4 % CHAPS, 1 % Gew./Vol. DTT, 0,5 % IPG-Puffer und eine Spur Bromphenolblau) in einem Volumen von 350 µL. Die isoelektrische Fokussierung (IEF) wurde in IPG-Streifen (pH 4-7, Größe 22 cm) bei 300 V für 12 min, 700 V für 18 min, 1500 V für 1,5 h, 9900 V für durchgeführt 3 h, 9990 V für 6,5 h und dann 600 V für 20 h auf einem Ettan IPGphor II System (GE ETTAN IPGPHOR3). Nach dem IEF-Programm wurden die Streifen in einem IPG-Äquilibrierungspuffer I (6 M Harnstoff, 2 % SDS, 30 % Glycerol, 0,375 M Tris, pH 8,8, 20 mg/ml DTT und eine Spur Bromphenolblau) äquilibriert und dann 15 min alkyliert (25 mg/ml Jodacetamid anstelle von DTT in einem Äquilibrierungspuffer). 2-DE wurde auf 12,5 % SDS-Polyacrylamidgelen (24 cm × 19,5 cm × 1,0 mm) mit 0,5 % Agarose-Versiegelungskleber unter Verwendung des Ettan DALT Six-Elektrophoresesystems (GE ETTAN DALTsix, PA, USA) durchgeführt. Die Elektrophorese wurde 45 min lang bei 2 W durchgeführt, gefolgt von einer vierstündigen Trennung bei 17 W, bis das Bromphenolblau fast den Boden der Gele erreichte. Die Proteinflecken wurden durch Silberfärbung (Tianjin Damao Chemical Reagent Factory) in analytischen Gelen sichtbar gemacht. 2-DE-Wascher, gebildet in dreifacher Ausfertigung und aus drei unabhängigen Proteinextraktionen für jede Gruppe.

Präparative Gelelektrophorese

Proteinproben (600 µg) von vier Rattengruppen wurden nach dem oben beschriebenen Verfahren einer 2-DE unterzogen. Die Proteinflecken wurden mittels Coomassie-Brillantblau-Färbung (Tianjin Damao Chemical Reagent Factory) in präparativen Gelen sichtbar gemacht.

Bilderfassung und -analyse

Die Gelbilder wurden auf einem {{0}}DE Image Scanning System (UMAX Powerlook1100, VT, USA) aufgenommen und mit der Image Master 2D Platinum 5.0 Software (GE, PA, USA) analysiert. Die Proteinflecken wurden automatisch erkannt und dann manuell bearbeitet, um Schlieren, Sprenkel und Artefakte zu entfernen.

Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS)

Für das Peptidmassen-Fingerprinting und die anschließende Analyse wurden Gele in Scheiben geschnitten und Coomassie-gefärbte Flecken wurden entfärbt und mit 100 mM Ammoniumbicarbonat und Acetonitril gewaschen, mit DTT bei 60 Grad für 40 Minuten reduziert und dann durch IAA alkyliert 30 min im Dunkeln. Das Gel wurde in 50 &mgr;l einer 12 ng/&mgr;l modifizierten Trypsinlösung in 50 mM Ammoniumbicarbonat (pH 8,6) bei 37 Grad über Nacht eingeschlossen. Die Peptide wurden mit 1 % Ameisensäure/2 % Acetonitril aus dem Gelpfropfen extrahiert und mit C-18 Zip-Tips konzentriert. Die Verdaus wurden auf einem MALDI-Target unter Verwendung von a-Cyano-4--hydroxyzimtsäure (2 mg/ml in 50 % Acetonitril, 0,1 % TFA mit 10 mM Ammoniumphosphat) als Matrix gespottet (vier Wiederholungen). Spektren wurden auf einem 4700 MALDI TOF/TOF-Massenspektrometer (Applied Biosystems, NY, USA) aufgenommen und mit der Software GPS Explorer TM (Applied Biosystems) analysiert.

Immunhistochemie

Koronale Hippocampusschnitte wurden in 4 % Paraformaldehyd fixiert, bevor sie in Paraffin eingebettet und dann in 4- µm dicke Schnitte geschnitten wurden. Abgeschlossene koronale Hippocampus-Schnitte wurden verarbeitet, um die endogene Peroxidase-Aktivität unter Verwendung von 3 Prozent H2O2 in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zu quenchen. Unspezifische Immunreaktionen wurden bei Raumtemperatur für 15 min blockiert. Die Schnitte wurden dann mit P-tau-Antikörper und sekundärem Antikörper bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert und wurden nach der Reaktion mit 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (Dako, Tokio, Japan) sichtbar gemacht. Die Bilder wurden mit einem Lichtmikroskop (Olympus, Tokio, Japan) aufgenommen und mit der Photoshop-Software (Version 7.0, Adobe, San Jose, CA, USA) verarbeitet.

Statistische Analyse

Quantitative Daten wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung ausgedrückt. Eine Zweiweg-Varianzanalyse (ANOVA) wurde unter Verwendung der Analysesoftware SPSS 10.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) durchgeführt. p < 0,05="" wurde="" als="" signifikant="">

Ergebnisse

GC fördert Lernen und Gedächtnis bei VD-Ratten

Um die Auswirkungen von GC auf die kognitive Funktion des VD-Rattenmodells zu bewerten, führten wir den MWM-Test durch. Im MWM-Test zeigte die GC-Gruppe 4 und 5 Tage nach der Operation eine signifikant geringere Fluchtlatenz als die VD-Gruppe, zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zur scheinoperierten Gruppe und der Oxiracetam-Kontrollgruppe (Tabelle I). Diese Daten legen nahe, dass GC das Lernen und Gedächtnis bei VD-Ratten fördert. GC ändert proteomische Profile des Hippocampus von VD-Ratten.

Durch proteomische Analyse des Hippocampus der Ratte fanden wir heraus, dass 21 Proteinspots in der GC-Gruppe im Vergleich zur VD-Gruppe unterschiedliche Expressionsniveaus zeigten. Unter ihnen zeigten vier Proteine ​​einen signifikanten Unterschied im Hippocampus der GC-Ratten (Tabelle II): einschließlich drei hochregulierter Proteine, Thioredoxin-ähnliches Protein 1 (TXNL 1), Dual-Spezifitäts-Mitogen-aktivierte Proteinkinase-Kinase 1 (MAPKK 1), und Dihydropyrimidinase-verwandtes Protein 2 (DPYSL2); und eine herunterregulierte Protein-Glutathion-Synthetase (GCL). Die typischen Profile der zweidimensionalen Gelelektrophorese (2-DE) von DPYSL2 sind in Abbildung 1 dargestellt.

GC moduliert den P-tau-Spiegel im Hippocampus von VD-Ratten

Durch immunhistochemische Analyse stellten wir fest, dass der P-Tau-Proteinspiegel in der VD-Modellgruppe signifikant höher war als in der scheinoperierten Gruppe (p < 0.05).="" nach="" der="" gc-behandlung="" zeigte="" der="" p-tau-proteinspiegel="" in="" vd-modellratten="" eine="" signifikante="" abnahme="" im="" vergleich="" zu="" der="" mit="" kochsalzlösung="" behandelten="" vd-gruppe="" (p="">< 0,05),="" zeigte="" jedoch="" keinen="" signifikanten="" unterschied="" im="" vergleich="" zur="" oxiracetam-kontrollgruppe="" (="" 2="">

Diskussion

VD ist auf die Beeinträchtigung des Gedächtnisses und der kognitiven Funktion zurückzuführen, die hauptsächlich durch zerebrovaskuläre Erkrankungen verursacht wird8,9,10,11. Das Zwei-Gefäß-Okklusionsmodell (2VO) ist einfach und stabil und als Standardmodell der zerebralen Ischämie anerkannt. In dieser Studie haben wir das 2VO-Modell verwendet, um das VD-Tiermodell zu etablieren. Durch den MWM-Test stellten wir fest, dass die VD-Gruppe im Vergleich zur scheinoperierten Gruppe eine verringerte kognitive Leistungsfähigkeit aufwies, was bestätigt, dass wir das VD-Modell erfolgreich etabliert haben. Basierend auf diesem Modell stellten wir fest, dass die GC-Behandlung die räumlichen kognitiven Fähigkeiten der VD-Ratten in ähnlichem Maße wie Oxiracetam, eine Positivkontrolle, verbesserte. Diese Daten weisen darauf hin, dass GC räumliches Lernen und Gedächtnisstörungen bei VD fördern könnte.

Um den Mechanismus zu untersuchen, durch den GC neuroprotektive Wirkungen auf VD ausübt, verwendeten wir einen proteomischen Ansatz zum Screenen von differentiell exprimierten Proteinen im Hippocampus von VD-Ratten. Wir fanden heraus, dass mehrere Proteine ​​im Zusammenhang mit dem Energiestoffwechsel, der Proteinfaltung, dem Signalweg und dem Zytoskelett im Hippocampus der mit GC behandelten VD-Ratten im Vergleich zu denen, die mit Kochsalzlösung als Kontrolle behandelt wurden, unterschiedliche Expressionen aufwiesen.

Eines der differentiell exprimierten Proteine ​​ist DPYSL2, auch bekannt als Collapsin-Response-Mediator-Protein-2 (CRMP-2), das im distalen Teil wachsender Axone in primären Neuronen des Hippocampus angereichert ist und für die Axondifferenzierung entscheidend ist und neuronales Wachstum12,13. Darüber hinaus fördert CRMP-2 die Mikrotubuli-Montage und vermittelt die Ras-Signalgebung, um die Multiple-Axon-Bildung und die neuronale Polarität zu verbessern14,15. In dieser Studie war das Proteinexpressionsniveau von CRMP-2 in der GC-Gruppe im Vergleich zur VD-Gruppe um das 2,28-fache erhöht, was auf eine wichtige Rolle von CRMP-2 bei potenziellen Reparaturmechanismen der Bildung neuraler Netzwerke hindeutet Aufrechterhaltung der neuronalen Polarität in VD.

Darüber hinaus fanden wir in der vorliegenden Studie eine höhere P-Tau-Expression in der VD-Modellgruppe, aber eine niedrigere P-Tau-Expression nach GC-Behandlung. Das Tau-Protein spielt eine Schlüsselrolle bei der Morphogenese von Neuronen. In bestimmten pathologischen Situationen kann das P-Tau-Protein aberrante Aggregate erzeugen, die für Neuronen toxisch sind, indem es die Mitochondrienfunktion beeinflusst15. Frühere Studien deuten darauf hin, dass GC den mitochondrialen Energiestoffwechsel mit Antioxidationsfunktion verbessern kann16,17,18. Interessanterweise wurde die CRMP-2-Phosphorylierung auch als Bestandteil von neurofibrillären Tangles bei AD charakterisiert.

Schlussfolgerungen

CRMP2 wird üblicherweise von Cyclin-abhängiger Proteinkinase-5 (Cdk5) und Glykogensynthasekinase-3 (GSK3) im Gehirn von AD-Patienten phosphoryliert, dieselben Kinasen, die Tau-Protein phosphorylieren, um NFTs zu erzeugen19,20. Weitere Studien sind erforderlich, um zu untersuchen, ob GC das Expressionsniveau von P-tau und CRMP2 in VD reguliert, indem es die Cdk5- und GSK3-Aktivität reguliert21,22,23. Zusammenfassend legen unsere Daten nahe, dass GC eine entscheidende Rolle beim Schutz von Hippocampus-Neuronen vor VD spielt, indem es die P-Tau-Phosphorylierung verringert und das Expressionsniveau von CRMP-2 erhöht. Die pharmakologische Manipulation von GC bietet eine neue Möglichkeit für die Entwicklung einer Therapie gegen VD.

Danksagungen

Diese Studie wurde von der Special Foundation for Taishan Scholars and National Natural Science Fund (30960520) unterstützt.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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