Hautaufhellungs- und Anti-Falten-Wirkung von bioaktiven Verbindungen, die durch ultraschallunterstützte Extraktion aus Erdnussschalen isoliert wurden

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Da Hye Gam 1, Ji Woo Hong 1, Jun Hee Kim 1 und Jin Woo Kim 1,2,3,*

Abstrakt:Die Response-Surface-Methodik wurde eingesetzt, um die Bedingungen der ultraschallunterstützten Extraktion (UAE) für die gleichzeitige Optimierung abhängiger Variablen zu optimieren, einschließlich der DPPH-Radikalfangaktivität (RSA), der Tyrosinase-Aktivitätshemmung (TAI) und der Kollagenase-Aktivitätshemmung (CAI) von Erdnussschalenextrakten. Die Auswirkungen der Hauptvariablen einschließlich Extraktionszeit (5.0~55.0 min, X1), Extraktionstemperatur (26.0~94.0 ◦C , X2) und die Ethanolkonzentration (0,0 Prozent ~99,5 Prozent, X3) wurden optimiert. Basierend auf experimentellen Werten von jeder Bedingung wurden quadratische Regressionsmodelle für die Vorhersage optimaler Bedingungen abgeleitet. Das Bestimmtheitsmaß (R2) der unabhängigen Variablen lag im Bereich von 0.89~0.96, was zeigt, dass das Regressionsmodell für die Vorhersage geeignet ist. Bei der Vorhersage optimaler VAE-Bedingungen basierend auf der Überlagerungsmethode wurden eine Extraktionszeit von 31,2 Minuten, eine Extraktionstemperatur von 36,6 °C und eine Ethanolkonzentration von 93,2 Prozent ermittelt. Unter diesen Bedingungen wurden RSA von 74,9 Prozent, TAI von 50,6 Prozent und CAI von 86,8 Prozent vorhergesagt, was eine gute Übereinstimmung mit den experimentellen Werten zeigt. Eine reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion zeigte, dass Erdnussschalenextrakt die mRNA-Spiegel senkteTyrosinase-verwandte Protein-1- und Matrix-Metalloproteinase-3-Gene in B16-F0-Zellen. Daher haben wir die identifiziertHautaufhellungund Anti-Falten-Wirkung von Erdnussschalenextrakten sowohl auf Protein- als auch auf Genexpressionsebene, und die Ergebnisse zeigen, dass Erdnussschale ein wirksames kosmetisches Material für istHautaufhellungundAnti-Falten-Effekte. Basierend auf dieser Studie kann Erdnussschale, die als Nebenprodukt galt, für die Entwicklung gesunder Lebensmittel, Medikamente und Kosmetika verwendet werden.

Schlüsselwörter:Erdnussschale; Optimierung;Hautaufhellung; Anti-Falten; Antioxidans;Tyrosinase; Kollagenase; menschliches Tyrosinase-verwandtes Protein-1 (TRP-1); Matrix-Metalloproteinase (MMP)

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1. Einleitung

Melanin ist ein braun oder schwarz gefärbtes Polymerpigment, das aus den Melanosomen von Melanozyten in der Epidermis synthetisiert wird. Seine Hauptfunktion besteht darin, ultraviolette (UV) Strahlen zu blockieren, um die Haut zu schützen. Alternativ kann seine übermäßige Produktion Pigmentverdunkelungen wie Melasma, Leberflecken und Altersflecken verursachen [1–3]. Tyrosinase ist ein Hauptenzym, das Autooxidations- und Polymerisationsreaktionen katalysiert, durch die Tyrosin über Dihydroxyphenylalanin in Dopachinon umgewandelt wird und Melanin durch Dopachromierung während der Melaninbiosynthese produziert [4]. Daher wird es häufig verwendet, um die Melaninproduktion durch die Hemmung von zu reduzieren oder abzuschwächenTyrosinaseAktivität, um den Whitening-Effekt von Kosmetika zu verstärken [5]. Die rasche Industrialisierung und der verstärkte Einsatz von Fluorchlorkohlenwasserstoffen haben die schützende Ozonschicht der Erde schwer beschädigt, was dazu führte, dass eine größere Menge an UV-Strahlung den Boden erreichte und die Haut freilegte. Diese Zunahme der UV-Strahlung induziert folglich eine aktive Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) im menschlichen Körper, wie Superoxidanionen, Wasserstoffperoxiden und Hydroxylradikalen. Solche Spezies haben die kontinuierliche Oxidation von Tyrosin gefördert, was zu einer erhöhten Produktion von Melanin führt. In dieser Hinsicht werden aktiv Studien zur Hemmung von durchgeführtTyrosinaseAktivität sowie die Entfernung von ROS, um sich zu entwickelnHautaufhellungWirkstoffe [6]. Kollagen ist eine wichtige extrazelluläre Matrix, die 90 Prozent der Dermis umfasst. Kollagen schützt und verleiht der Haut Elastizität und ist an der mechanischen Festigkeit der Haut, dem Widerstand, der Bindung des Bindegewebes sowie der Proliferation und Differenzierung von Zellen beteiligt [7]. Proteine, aus denen die extrazelluläre Matrix besteht, wie Kollagen, werden durch Kollagenase, wie Matrix-Metalloproteinase (MMP), abgebaut, was zu Falten, verminderter Elastizität und Erschlaffung der Haut führt [8]. Verschiedene Arten von MMPs, die von ROS exprimiert werden, hydrolysieren die Kollagenkette, das Bindegewebe der Haut und erzeugen ihre abnormale Vernetzung, um den Kollagenabbau zu erhöhen und die Bildung von Falten zu beschleunigen [9]. Aus diesem Grund stand die Hemmung der Melaninproduktion und des Kollagenabbaus durch Reduzierung der ROS-Bildung im Mittelpunkt der Hautaufhellung und Faltenprävention [10]. Arbutin, Kojisäure und Linolensäure als aufhellende Kosmetika und Retinol, Gallat und Andadenosin als Anti -Faltenkosmetik, sind in den letzten Jahren weit verbreitet. Die Verwendung dieser Materialien ist jedoch aufgrund ihrer Instabilität in Gegenwart von Licht und Wärme sowie aufgrund von Nebenwirkungen, einschließlich Hautreizungen und Kontaktdermatitis, begrenzt [11]. Mit wachsendem Interesse an natürlichen Antioxidantien zur Überwindung der Mängel herkömmlicher Aufhellungs- und Anti-Falten-Inhaltsstoffe wurden pflanzliche Extrakte aktiv verwendet, um bioaktive Verbindungen für hautfreundliche und sichere Produkte zu entwickelnAufhellungund Anti-Falten-Kosmetik [12,13].

Es gibt verschiedene Extraktionsverfahren, die derzeit zur Extraktion von bioaktiven Verbindungen aus Pflanzen verwendet werden. Die Extraktion von bioaktiven Verbindungen aus natürlichen Quellen, insbesondere Pflanzen, wurde jedoch hauptsächlich durch Lösungsmittel-, Heißwasser- und Soxhlet-Extraktionsmethoden durchgeführt, die verschiedene Nachteile gezeigt haben, darunter eine geringe Extraktionseffizienz, Zersetzung von Inhaltsstoffen, geringe Stabilität und hohe Betriebskosten [14]. Daher wurden kürzlich Extraktionsmethoden getestet, darunter ultraschallunterstützte, mikrowellenunterstützte und überkritische Extraktion [15]. Insbesondere Ultraschall ist eine Schallwelle mit einer Frequenz von etwa 20 kHz oder mehr, die zu Kompression, Kavitation und Verdünnung von Flüssigkeit führt, wodurch die Molekularbewegung in kurzer Zeit maximiert wird, um eine hohe Extraktionseffizienz zu erzielen [16]. Darüber hinaus ist Ultraschall vorteilhaft, da seine kurze Extraktionszeit den Abbau von bioaktiven Verbindungen minimiert und als effektive Methode zur Extraktion natürlicher Inhaltsstoffe mit Antioxidantien bewertet wird.Aufhellung, und Anti-Falten-Eigenschaften vieler Pflanzen und Kräuter [17]. Die Optimierung der Extraktionsbedingungen ist unerlässlich, um die Effizienz der ultraschallunterstützten Extraktion (UAE) zu steigern, und der Optimierungsprozess kann entweder durch experimentelle oder statistische Methoden durchgeführt werden. Die traditionelle One-Factor-at-a-Time-Methode, bei der alle Variablen konstant bleiben und sich ändern nur jeweils ein Faktor hat Einschränkungen bei der Bestimmung der interaktiven Effekte, wenn es sich um ein multivariates Experiment handelt. Andererseits bietet RSM statistische Informationen über die Korrelation zwischen Variablen in multivariaten Experimenten, zusammen mit effektiven Experimenten mit einer minimalen Anzahl von Stichproben, sowie wichtige mathematische und statistische Techniken zur Bewertung der Effektivität und Eignung des Regressionsmodells. Verschiedene RSM-Designs, wie zum Beispiel das vollfaktorielle Design, das Box-Behnken-Design und das Central Composite Design (CCD), sind weit verbreitet. Unter anderem ist CCD sehr effizient und liefert daher viele Informationen über die Auswirkungen von Experimentvariablen und den gesamten experimentellen Fehler bei einer minimalen Anzahl erforderlicher Durchläufe [18]. Daher wurde CCD in vielen bestehenden Studien häufig verwendet, um den Prozess zu entwickeln, zu verbessern und zu optimieren Bedingungen für die Extraktion verschiedener Antioxidantien und anderer Metaboliten aus Naturprodukten.

Erdnuss (Arachis hypogaea) ist eine einjährige Pflanze aus der Familie der Hülsenfrüchte. Es wird in mehr als 50 Ländern auf der ganzen Welt angebaut, darunter Südkorea, Indien, China und die Vereinigten Staaten [19]. Erdnüsse sind reich an Proteinen (25 Prozent), Lipiden (47 Prozent) und Kohlenhydraten (16 Prozent) sowie Mineralien, Vitaminen, Niacin, ungesättigten Fettsäuren und Andolsäuren [20]. Sie werden entweder als unverarbeitete oder verarbeitete Produkte konsumiert, darunter Nüsse, Butter und Speiseöl. Es wird geschätzt, dass die weltweite jährliche Erdnussproduktion insgesamt 4,1 Millionen Tonnen beträgt und dass die Schale der Erdnuss 35 bis 40 Prozent des Gesamtgewichts der Erdnuss ausmacht [21]. Es wird geschätzt, dass jährlich mehr als 1,5 Millionen Tonnen Erdnussschalen als Nebenprodukte entsorgt werden. Da jedoch nur ein Teil der Erdnussschalen als Tierfutter verwendet wird und die meisten von ihnen verbrannt oder deponiert werden, was Entsorgungskosten und Umweltprobleme verursacht, ist es notwendig, Materialien mit hoher Wertschöpfung aus Erdnussschalen herzustellen, um das Problem der Nebenprodukte zu überwinden [22 ]. Frühere Studien zu Antioxidantien haben gezeigt, dass über entzündungshemmende und fettleibigkeitshemmende Aktivitäten von Erdnusshautextrakten berichtet wurde [23,24]. Bisher gibt es jedoch keine Forschung zur Herstellung funktioneller kosmetischer Materialien zur VerbesserungAufhellungund Anti-Falten-Wirkung durch bioaktive Verbindungen aus Erdnussschalen. Daher extrahierte diese Studie bioaktive Verbindungen aus einer Erdnussschale, indem sie die ultraschallunterstützte Extraktion (UAE) einsetzte, um ihre antioxidativen, aufhellenden und Anti-Falten-Effekte zu bestätigen, und präsentierte ferner einen optimalen UAE-Zustand unter Verwendung der Response-Surface-Methode (RSM) und erhöhte die Funktionalität von Extrakten um die Möglichkeit seiner Verwendung als Lebensmittel, Kosmetika und medizinische Inhaltsstoffe zu bestätigen.

2. Ergebnisse und Diskussion

2.1. Passend für die RSM-Modelle

In dieser Arbeit wurden Extraktionstemperatur, Extraktionszeit und Ethanolkonzentration als Hauptvariablen von CCD ausgewählt, wobei das vorläufige Ein-Faktor-zu-Zeit-Experiment verwendet wurde, um die signifikanten Variablen zu bestimmen, die die VAE beeinflussen (Tabelle 1).

Dann wurden 17 experimentelle Läufe konstruiert, einschließlich 3 Wiederholungen am Mittelpunkt unter Verwendung von 3--Variablen und 5-Stufen-CCD. Experimentelle Fehler wurden minimiert, indem die experimentelle Reihenfolge randomisiert wurde, um die Auswirkungen unerklärlicher Variabilität zu minimieren. Die experimentellen und vorhergesagten Ergebnisse für die DPPH-Radikalfängeraktivität (RSA),TyrosinaseAktivitätshemmung (TAI) und Kollagenaseaktivitätshemmung (CAI) sind in Tabelle 2 gezeigt.

Um die Korrelation zwischen den 17 Versuchsläufen von CCD-Versuchsbedingungen und den Versuchsergebnissen zu bestimmen, wurden mehrere Regressionsmodelle vorgeschlagen, um die optimalen Niveaus dieser 3 Variablen vorherzusagen. Durch Anwenden einer multiplen Regressionsanalyse auf die experimentellen Daten wurden abhängige Variablen (Y) und getestete Variablen durch die folgenden quadratischen Regressionsgleichungen in Beziehung gesetzt (Tabelle 3).

Varianzanalyse (ANOVA) ist ein statistischer Test zur Analyse experimenteller Daten. Es unterteilt die Gesamtvariation in einem Datensatz in Bestandteile, die bestimmten Variationsquellen zugeordnet sind, um eine Hypothese über die Variablen des Modells zu testen oder Varianzkomponenten zu schätzen [25]. Response-Surface-Analyse und ANOVA wurden eingesetzt, um die Koeffizienten zu bestimmen, die statistische Signifikanz der Modellterme zu bewerten und die mathematischen Modelle der experimentellen Daten anzupassen, die darauf abzielten, die Gesamtregion für Response-Variablen zu optimieren [26]. Wie durch das Modell festgestellt, lagen die Korrelationskoeffizienten (R2), die zur Bestimmung der Beziehung zwischen den experimentellen und vorhergesagten Antworten durch Regressionsmodelle verwendet wurden, im Bereich von 0.8862~0.9622. Dies deutet darauf hin, dass die analysierten Prozessvariablen mehr als 88,6 Prozent der unabhängigen Variablen erklären. Die Design-Expert-Software wurde verwendet, um die Koeffizienten der quadratischen Regressionsgleichungen zu berechnen, und die Eignung des Modells wurde durch ANOVA getestet. Entsprechend dem monomialen Koeffizientenwert der quadratischen Regression sind Gleichungen in Tabelle 4 aufgeführt und die Prioritätsreihenfolge unter den Haupteffekten unabhängiger Variablen ist Ethanolkonzentration (X3) > Extraktionstemperatur (X2) > Extraktionszeit (X1).

2.2. Auswirkung der Extraktionsbedingungen auf RSA

Tabelle 2 zeigt die experimentellen Daten von RSA gemäß unterschiedlichen Bedingungen in den Vereinigten Arabischen Emiraten. RSA von Erdnussschalenextrakt wurde im Bereich von 7,6 % bis 89,9 % bestimmt. Die höchste RSA wurde unter den folgenden Extraktionsbedingungen identifiziert: Extraktionszeit von 55,0 min, Extraktionstemperatur von 60,{{10}} ◦C und Ethanolkonzentration von 5 0.0 Prozent (Lauf Nr. 10). Der niedrigste RSA von 7,6 Prozent bei einer Extraktionszeit von 30,0 Minuten, einer Extraktionstemperatur von 60,0 ◦C und einer Ethanolkonzentration von 0,0 Prozent wurde als experimenteller Wert ermittelt (Lauf Nr. 13). . Durch Anwenden einer multiplen Regressionsanalyse wurden die experimentellen Daten und Antworten durch quadratische Regressionsgleichungen in Beziehung gesetzt (Tabelle 3). Die statistische Analyse ergab, dass R2 des Regressionsmodells 0,9308 (p=0,0027) betrug, was darauf hinweist, dass diese Gleichung 93,0 Prozent der Ergebnisse der experimentellen Bedingungen erklären konnte, was bedeutet, dass das Modell hochsignifikant war und zur genauen Vorhersage verwendet werden konnte die Antwortfunktion.

Die Wirkung einer einzelnen VAE-Variablen bei festen Niveaus anderer Variablen auf RSA wird vorhergesagt und in Abbildung 1a dargestellt. RSA neigt dazu, anzusteigen und dann abzunehmen, wenn alle VAE-Variablen ansteigen. Die Ethanolkonzentration hatte unter den drei UAE-Variablen die größte Auswirkung auf RSA, während die Extraktionszeit und die Extraktionstemperatur die geringste Auswirkung auf RSA hatten. Dieses Ergebnis stimmt mit den ANOVA-Ergebnissen überein, bei denen die Ethanolkonzentration einen signifikanteren Effekt (p=0.0002) auf RSA zeigte, wie in Tabelle 4 gezeigt. Der Interaktionseffekt zwischen unabhängigen Variablen auf RSA wurde unter Verwendung von 3D visualisiert Reaktionsoberflächenkurven. Die Extraktionstemperatur und die Extraktionszeit wurden gleichzeitig auf dem festgelegten Niveau der Ethanolkonzentration geändert (Abbildung 2A). Als die zwei Variablen (Extraktionstemperatur und -zeit) zunahmen, stieg RSA auf das maximale Niveau und nahm dann wieder ab. Die höchste RSA wurde bei einer Extraktionstemperatur von 56,1 ◦C erhalten, was daher darauf hindeutet, dass die Extraktion von bioaktiven Verbindungen mit antioxidativem Potenzial, wie Polyphenolen, mit der Zerstörung von Pflanzenwandbestandteilen, wie Lignin, bei Temperaturen bis zu 56,1 ◦C zunimmt; jedoch wurde RSA bei höheren Temperaturen aufgrund der Zersetzung oder Polymerisation von Antioxidansbestandteilen verringert. Abbildung 2B, C zeigen, dass RSA nicht signifikant von der Extraktionszeit oder -temperatur beeinflusst wurde, wohingegen RSA signifikant von der Ethanolkonzentration beeinflusst wurde, die bei der Ethanolkonzentration von 61,0 Prozent am höchsten war und auch wieder abnahm. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit dem Heißwasser-Extraktionsexperiment von Lespedeza cuneata von Kim et al. in denen RSA stärker von der Ethanolkonzentration als von der Extraktionstemperatur beeinflusst wurde und RSA das Maximum im Ethanolkonzentrationsbereich von 60 bis 70 Prozent war [27]. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Extraktionseffizienz des binären Lösungsmittels (Wasser und Ethanol) für die Einzellösungsmittelextraktion von Erdnussschalen in den Vereinigten Arabischen Emiraten effektiver ist.

2.3. Auswirkung der Extraktionsbedingungen auf TAI

Tyrosinaseist ein Enzym, das die Melaninproduktion fördert, indem es Tyrosin in der Grundschicht der Epidermis oxidiert, und die Hemmung dieses Enzyms ist für die Verbesserung von essentiellHautaufhellung [28]. The TAI of peanut shell extracted via UAE, according to 17 extraction conditions, ranged from 0.34% to 51.8% (Table 2). Based on experimental values, the relationship between independent variables (X1, X2, X3) and the dependent variable (TAI) was modeled using quadratic regression equations as shown in Table 3. To evaluate the agreement between the experimental and predicted values derived by the quadratic regression models, the goodness-of-fit of the model was evaluated based on ANOVA. The R2 was 0.9622, which is close to 1 and indicates a high degree of correlation between the experimental and predicted values. p-value is used as a tool to evaluate the significance of each coefficient and interactions between each independent variable. The UAE variables will be more significant if the p-value becomes smaller and significance was confirmed at the level of p < 0.05 [29,30]. In evaluating the effects of independent variables, the significance was determined in the order of ethanol concentration (p < 0.0001) >Extraktionstemperatur (p < {{0}},0598) > Extraktionszeit (p < 0,4329), was bestätigte, dass die Wirkung der Ethanolkonzentration bei TAI am signifikantesten war.

Um die Wirkung der VAE-Bedingungen auf TAI zu vergleichen, wurde das Störungsdiagramm verwendet, um die Wirkung einzelner Variablen auf TAI zu bewerten, indem zwei Variablen am Mittelpunkt fixiert wurden. Wie in Abbildung 1b gezeigt, zeigte TAI im Vergleich zum vorherigen RSA-Experiment ein anderes Muster; sie nahm zu, wenn die Ethanolkonzentration zunahm, während die Extraktionszeit TAI nicht signifikant beeinflusste. Der signifikante proportionale Anstieg von TAI mit der Ethanolkonzentration kann durch die ANOVA-Ergebnisse erklärt werden. TAI wurde durch den primären Term der Ethanolkonzentration (X3) signifikant beeinflusst, und (p < 0.05)="" der="" quadratische="" term="" ist="" statistisch="" nicht="" signifikant,="" was="" eine="" starke="" proportionale="" beziehung="" zwischen="" tai="" und="" ethanolkonzentration="" zeigt.="" die="" 3d-antwortoberflächenkurve="" ist="" die="" grafische="" darstellung="" der="" quadratischen="" regressionsgleichung="" und="" der="" ergebnisse="" von="" tai,="" wie="" sie="" durch="" die="" extraktionstemperatur="" (x1),="" die="" extraktionszeit="" (x2)="" und="" die="" ethanolkonzentration="" (x3)="" beeinflusst="" werden.="" abbildung="" 3a="" visualisiert="" den="" wechselwirkungseffekt="" von="" extraktionszeit="" und="" ethanolkonzentration="" auf="" tai.="" das="" ergebnis="" bestätigte,="" dass="" die="" extraktionszeit="" keine="" signifikante="" wirkung="" auf="" tai="" zeigte,="" während="" die="" ethanolkonzentration="" eine="" starke="" proportionale="" beziehung="" zu="" tai="" aufwies.="" in="" ähnlicher="" weise="" war="" tai,="" wie="" in="" fig.="" 3b="" gezeigt,="" stärker="" von="" der="" ethanolkonzentration="" als="" von="" der="" extraktionstemperatur="" abhängig,="" und="" der="" höchste="" tai="" wurde="" erreicht,="" wenn="" die="" ethanolkonzentration="" auf="" 99,5="" prozent="" anstieg.="" bei="" der="" untersuchung="" der="" vae-bedingungen="" für="" den="" maximalen="" tai="" wurden="" die="" maximalen="" tai-bedingungswerte="" auf="" 3{{2{0}}},0 min,="" 26,3 ◦c="" und="" 99,5 %="" vorhergesagt.="" dieses="" ergebnis="" ähnelt="" dem="" von="" nakamura="" et="" al.="" [31]="" in="" einer="" studie="" zur="" biologischen="" aktivität="" von="" zitronenblättern,="" bei="" der="" 20,0="" bis="" 80,0="" prozent="" ethanol="" als="" extraktionslösungsmittel="" verwendet="" wurden,="" stieg="" tai="" proportional="" zur="" erhöhung="" der="" ethanolkonzentration="" und="" zeigte="" den="" maximalen="" wert="" bei="" der="" extraktion="" mit="" 80="" prozent="" ethanol.="" dies="" deutet="" darauf="" hin,="" dass="" die="" verwendung="" einer="" höheren="" ethanolkonzentration="" beim="" extrahieren="" von="" bioaktiven="" verbindungen="" vorteilhaft="">HautaufhellungWirkung von Erdnussschalen oder anderen Pflanzen.

2.4. Auswirkung der Extraktionsbedingungen auf CAI

Collagen is the most abundant protein in mammals and the main structural component of the extracellular matrix with gly-pro-hyp repeating units longer than 1400 amino acids. Collagenase is an enzyme that breaks down peptide bonds of collagen that form skin, bones, tendons, and ligaments. The collagen present in the dermis is decomposed by collagenase, which causes skin wrinkles and reduces skin elasticity; therefore, it is necessary to reduce the activity of collagenase to prevent skin wrinkles [32,33]. The optimization of the UAE condition was performed to maximize the CAI of peanut shell extract. A total of 17 runs were needed for optimizing the three individual variables and the experimental data of CAI obtained under experimental sets were 25.2%~92.3% (Table 2). Based on the 17 experimental runs, by applying multiple regression analysis on the experimental data, response and independent variables were related by the following quadratic regression equation in terms of the coded parameters given in Table 3. Then, ANOVA was applied to determine the regression coefficients, statistical significance, and to fit the mathematical models. The mean-square values were calculated by dividing the sum of the squares of each variation source by their degrees of freedom, and a 95% confidence level (α = 0.05) was applied to determine the statistical significance in the analysis of the quadratic model. The ANOVA results confirmed that R2 of the quadratic regression equation was 0.8862 and that the p-value was 0.0134, which is less than the significance level (p < 0.05), thus indicating a good model of fit and statistical significance for predicting CAI values. In the primary term, the X2 and X3 showed significant effects and the interaction effect terms were significant in the X1X2 and X2X3 (p < 0.05). The effect of UAE conditions on CAI production was confirmed to be in the order of: extraction temperature (p = 0.0236) >Ethanolkonzentration (p=0 0,0240) > Extraktionszeit (p=0 0,8505), was darauf hindeutet, dass die Wirkung der Extraktionstemperatur und der Ethanolkonzentration signifikant auf CAI war.

Abbildung 1c zeigt ein Störungsdiagramm, in dem zwei Variablen festgelegt sind, und visualisiert die Wirkung einer einzelnen Variablen auf den CAI. Es wurde gezeigt, dass die Wirkungen aller drei Variablen auf den CAI ähnlich waren, und die drei Variablen zeigten signifikante Wirkungen und erhöhten und nachfolgend verringerten CAI, wenn jede unabhängige Variable zunahm. In unserer Studie wurden 3D-Oberflächenreaktionskurven entwickelt, um die Wechselwirkung zweier unabhängiger Variablen in CAI mithilfe von quadratischen Regressionsgleichungen zu visualisieren (Abbildung 4). Wenn die Ethanolkonzentration auf den Mittelpunkt festgelegt wurde, wurde die Wirkung der Extraktionszeit und -temperatur auf CAI in Fig. 4A bewertet. Da sich die beiden Variablen gleichzeitig änderten, stieg der CAI auf 33,4 min und 76,8 °C und fiel nach einem maximalen CAI von 92,8 Prozent wieder ab. Wie in Abbildung 4B, C gezeigt, hatte CAI den höchsten Wert bei der Ethanolkonzentration von 64,3 Prozent und zeigte danach eine allmählich abnehmende Tendenz, was darauf hindeutet, dass ein binäres Lösungsmittel, das aus 64,3 Prozent Ethanol besteht, besser als Extraktionslösungsmittel geeignet ist. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Untersuchungen überein, die berichteten, dass ein binäres Lösungsmittel aus Wasser und Ethanol bei der Extraktion von bioaktiven Verbindungen aus Orostachys japonica einen höheren CAI als Wasser zeigte, was darauf hindeutet, dass 50 Prozent Ethanol beim Extrahieren vorteilhafter wärenHautaufhellungInhaltsstoffe [34]. Der durch das quadratische Regressionsmodell vorhergesagte maximale CAI des Erdnussschalenextrakts betrug 94,5 Prozent, was unter den Bedingungen einer Extraktionszeit von 45,1 min, einer Extraktionstemperatur von 93,6 °C und einer Ethanolkonzentration von 42,3 Prozent erhalten wurde. Der in unserer Studie erhaltene CAI betrug 94,5 Prozent, was mehr als das Doppelte der Wirkungen von 39,4 Prozent und 40,3 Prozent der von Oh et al. [35].

2.5. Optimale Extraktionsbedingungen

Antioxidans,Hautaufhellungund Anti-Falten-Effekte sind allesamt wichtige Funktionen für Kosmetika, und es ist notwendig, Bedingungen abzuleiten, die diese drei Funktionen gleichzeitig bei der Optimierung der VAE-Bedingungen maximieren können. Fig. 5 zeigt eine Optimierungsprozedur, die gleichzeitig RSA (Y1), TAI (Y2) und CAI (Y3) maximieren kann, indem jede optimale Bedingung eines durch eine quadratische Regressionsgleichung abgeleiteten Konturdiagramms überlappt wird. Die Bereiche der unabhängigen Variablen für die Optimierung von drei Variablen wurden auf die Extraktionszeit von 5,0~55,0 min, die Extraktionstemperatur von 26,{{10}}~94 begrenzt .0 ◦C und eine Ethanolkonzentration von 0,0 Prozent ~99,5 Prozent (Tabelle 5). Gemäß den individuellen optimalen Extraktionsbedingungen waren die optimalen UAE-Bedingungen 31,2 Minuten Extraktionszeit, 36,6 °C Extraktionstemperatur, 93,2 Prozent Ethanolkonzentration und unter den obigen Bedingungen RSA von 74,9 Prozent, TAI von 50,6 Prozent und CAI von 860,8 Prozent wurden vorhergesagt. Wenn die vorhergesagten RSA-, TAI- und CAI-Werte mit denen verglichen wurden, die aus dem Experiment zur Validierung erhalten wurden, waren die Werte aus dem Validierungstest ähnlich denen der vorhergesagten Werte, wobei die Werte 78,2 Prozent, 52,3 Prozent bzw. 87,7 Prozent betrugen.

2.6. Vergleich von SE und VAE

Um die Extraktionswirksamkeit von UAE zu bestätigen, vergleichen wir RSA, TAI und CAI von Erdnussschalenextrakt, der mit UAE- und Soxhlet-Extraktionstechniken (SE) hergestellt wurde. Als die SE unter allgemeinen SE-Bedingungen unter Verwendung von 99,5 % Ethanol bei 7 0 ◦ C für eine 4-stündige Extraktionszeit durchgeführt wurde, wurden RSA, TAI und CAI zu 75,5 %, 60,2 % und 74,4 % gefunden, was nicht der Fall war sehr unterschiedlich von den unter optimalen VAE-Bedingungen erhaltenen Ergebnissen. Wenn jedoch die SE-Bedingungen gleich den optimalen VAE-Bedingungen von 31,2 min und 93,2 Prozent Ethanol eingestellt wurden, nahmen RSA, TAI und CAI um 62,0, 28,3 bzw. 45,6 Prozent ab. im Vergleich zu den VAE unter optimalen Bedingungen. Der Vorteil von Ultraschall bei der Herstellung von nützlichen Materialien aus Erdnussschalen wurde als ein Verfahren bewertet, das aufgrund des geringen Lösungsmittelverbrauchs und der kurzen Extraktionszeit für eine hohe Produktivität und Industrialisierung geeignet ist.

2.7. mRNA-Expression von MMP-3 und TRP-1

In Melanozyten von Säugetieren werden Melanogenese und Kollagenhydrolyse durch TRP- bzw. MMP-Gene gesteuert, und TRP{{0}} und MMP-3 sind als Hauptgene für die Regulation von Melanogenese und Kollagenhydrolyse bekannt; Daher wurde eine RT-PCR-Analyse an Ganzzelllysaten von B16-F0-Zellen durchgeführt und die Wirkung von Erdnussschalenextrakt, der aus den Vereinigten Arabischen Emiraten unter optimalen Bedingungen hergestellt wurde (31,2 min, 36,6 Grad, 93,2 Prozent) auf mRNA-Expression von MMP-3 und TRP-1 untersucht. Wie Abbildung 6 zeigt, regulierte Erdnussschalenextrakt die Expression von MMP-3 und TRP-1 in B16-F0-Zellen signifikant herunter, wenn die Genexpressionsexperimente mit einer Erdnuss durchgeführt wurden Schalenextrakt-Konzentrationsbereich von 0~1 mg/ml. Der Erdnussschalenextrakt reduzierte die MMP-3- und TRP-1-Expression signifikant um das 6,1--Fache bzw. 8,7--Fache bei 1,0 mg /ml. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Erdnussschalenextrakt den Kollagenabbau in B16F0-Zellen durch Inaktivierung von MMP 3 bis zur Inaktivierung von MMP-1 hemmt und die Zusammenarbeit von MMP-9 stört [36]. Bestehende Studien haben gezeigt, dass die Behandlung mit Pflanzenextrakten die Expression des Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktors (MITF) durch Phosphorylierung der extrazellulären signalregulierten Proteinkinase (ERK) hemmt. Somit wird die hemmende Wirkung der Melaninproduktion durch Erdnussschalenextrakt auf die Hemmung von zugeschriebenTyrosinaseAktivität durch Expressionshemmung von ERK und MITF [37]. Daher reduzierten Erdnussschalenextrakte die mRNA-Expressionsniveaus von TRP-1 und MMP-3, was darauf hindeutet, dass Erdnussschalenextrakt starke hemmende Wirkungen auf die Kollagenolyse und Melanogenese besitzt, was es zu einem ausgezeichneten kosmetischen Material machtHautaufhellungund Anti-Falten-Wirkung.

3. Materialien und Methoden

3.1. Materialien und Reagenzien

Erdnussschalen wurden am 2. März 0 19 vom Nonghyup-Markt (Gochang, Jeonbuk, Korea) gekauft und die Schalen wurden bei 60 ◦C in einem Trockenofen (FC 49, Lab House, Seoul, Korea) 24 Stunden lang getrocknet, bis die Das Trockengewicht blieb konstant. Getrocknete Erdnussschalen wurden unter Verwendung einer Küchenmaschine (Hanil HMF-3800, Seoul, Korea) pulverisiert und dann durch ein 600-&mgr;m-Sieb passiert. Ethanol wurde von Samchun Chemical (95,0 Prozent v/v, Seoul, Korea) gekauft. Folin-Ciocalteu-Reagenz, Gallussäure (97 Prozent) und Quercetin wurden von Merck (Kenilworth, NJ, USA) bezogen. 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), Ascorbinsäure und 3,4-dihydroxy-L-phenylalanin (L-DOPA) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Alle anderen in diesem Experiment verwendeten Chemikalien waren von analytischer Qualität und wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Alle Stammlösungen wurden durch gereinigtes entionisiertes Wasser unter Verwendung eines Milli-Q-Reinigungssystems (Millipore, Burlington, VT, USA) hergestellt.

3.2. Ultraschallunterstützte Extraktion und Soxhlet-Extraktion

Pulverisierte Erdnussschale (1 g) wurde in ein Extraktionsgefäß mit jeweils 1 0 ml Lösungsmittel gegeben und unter Verwendung eines Vortex-Mischers (VM-10, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Korea) gemischt 1 Minute. Die Extraktion wurde durch Umwälzen von Wasser im Ultraschallextraktor (250 W, SD-D250H, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Korea) unter Verwendung eines externen gekühlten Badzirkulators (CDRC8, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Korea) durchgeführt ) mit digitaler Zeitschaltuhr und Temperaturregler. Die Extraktion wurde mit einem Ultraschallgerät durchgeführt, das mit einem digitalen Timer und einem Temperaturregler ausgestattet war. Die Probe wurde für verschiedene Versuchsdauern und Temperaturen bei einer Arbeitsfrequenz von 40 kHz beschallt. Dann wurde der Extrakt bei 10,000 U/min für 10 min zentrifugiert (236R, Labogene, Seoul, Korea). Nach der Zentrifugation wurden die Probenvolumina auf 5 ml aufgefüllt und vor der Analyse durch einen 0,2-um-Membranfilter filtriert. Für die Soxhlet-Extraktion wurde die pulverisierte Erdnussschale (5 g) kontinuierlich mit 100 ml unter Verwendung von 99,5-prozentigem Ethanol für 4 h (8 Zyklen) bei einer maximalen Temperatur von 70 °C in einer Soxhlet-Apparatur extrahiert. Die ultraschallunterstützte Extraktionstechnik hat sich bei der Extraktion von Öl aus Traubenkernen als sehr effizient erwiesen, wobei der Vorteil des Ultraschalls im Vergleich zu den herkömmlichen Extraktionsmethoden sowohl für Öl als auch für Polyphenole ähnlich war, da die Öl/Polyphenol-Ausbeute mit einem geringeren Lösungsmittelverbrauch und einer kürzeren Zeit erzielt wurde Extraktionszeit.

3.3. Experimentelles Design

Das experimentelle Design wurde unter Verwendung von CCD durchgeführt, einer Art von RSM, um die Anzahl der experimentellen Durchläufe zu minimieren und die Wechselwirkung zwischen den Faktoren zu untersuchen. Die Design-Expert®-Software 8.0 (State-Ease, City, MN, USA) wurde für die Versuchsplanung, Datenanalyse und Optimierung der Extraktionsbedingungen zur Maximierung der Extraktion von bioaktiven Verbindungen mit Antioxidantien verwendet.Hautaufhellung, und Anti-Falten-Effekte aus der Erdnussschale. Die Experimente wurden gemäß CCD entworfen, die dargestellten Bereichs- und Mittelpunktswerte von drei unabhängigen Variablen basierten auf den Ergebnissen von vorläufigen Experimenten (Tabelle 1). Die CCD wurde angewendet, um die optimalen VAE-Bedingungen für die Maximierung von Reaktionen einschließlich RSA, TAI und CAI aus Erdnussschalen vorherzusagen. Als unabhängige Variablen waren die drei gewählten Variablen Extraktionszeit (X1), Extraktionstemperatur (X2) und Ethanolkonzentration (X3). Zur Abschätzung der Reproduzierbarkeit wurden insgesamt 17 Versuchsläufe mit drei Wiederholungen an den zentralen Punkten erstellt. Das quadratische Regressionsmodell wurde verwendet, um die experimentellen Daten anzupassen, und angewendet, um die Antwortvariablen vorherzusagen, wie in Gleichung (1) gezeigt:

Y= 0 plus 1X1 plus 2X2 plus 3X3 plus 11X12 plus 22X22 plus 33X32 plus 12X1X2 plus 13X1X3 plus 23X2X3 (1)

wobei Y die vorhergesagte Antwort ist; 0 ist die Konstante (Abschnitt); 1, 2 und 3 sind die Regressionskoeffizienten für die linearen Effektterme; 11, 22 und 33 sind die quadratischen Effektterme; und 12, 13 und 23 sind die Interaktionseffektterme. Eine Response-Surface-Analyse und die ANOVA wurden verwendet, um die Regressionskoeffizienten und die statistische Signifikanz der Modellterme zu bestimmen und die mathematischen Modelle des Experiments anzupassen [38].

3.4. DPPH-Radikalfänger-Aktivität (RSA)

RSA des Erdnussschalenextrakts wurde wie von Pereira-Caro et al. [39]. Eine Lösung von 0.0 1 mM DPPH in Methanol (95 Prozent) wurde hergestellt und 1,25 ml wurden zu 0,25 ml verdünntem Extrakt gegeben. RSA wurde bestimmt, um die Extinktion bei 517 nm unter Verwendung eines UV-Visspektrophotometers (UV1650PC, Shimadzu, Kyoto, Japan) nach 20-minütiger Inkubation zu messen. Die Blindprobe wurde unter Verwendung von destilliertem Wasser hergestellt und die RSA wurde wie folgt berechnet (Gleichung (2)):

RSA ( Prozent )={1 −Abs (Probe) /Abs (Kontrolle) }× 100 (2)

3.5. Hemmung der Tyrosinase-Aktivität (TAI)

TAI wurde gemäß dem modifizierten Verfahren unter Verwendung von L-DOPA als Substrat von Jo et al. [40]. Die Proben wurden mit 200 &mgr;l L-DOPA und 200 &mgr;l Kaliumphosphatpuffer (pH 6,8) und 200 &mgr;l vonTyrosinase(125 U/mL) wurde in das Reagenzglas gegeben und 20 min bei 37 ◦C inkubiert. Die Probenabsorption wurde bei 475 nm unter Verwendung eines UV-Vis-Spektrophotometers gemessen und die Ergebnisse wurden mit der Kontrolle verglichen. Für jede Konzentration wurde die Enzymaktivität als Prozentsatz im Vergleich zu derjenigen des Assays unter Verwendung eines Puffers ohne jeglichen Inhibitor berechnet, und TAI wurde basierend auf der folgenden Formel berechnet. (Gleichung (3)):

TAI ( Prozent )={1 −Abs (Kontrolle) − Abs (Probe) /Abs (Kontrolle)}× 100 (3)

wobei Abs (Kontrolle) die Absorption von Puffer plus Kollagenase ist; Abs (Probe) ist die Extinktion von Puffer plus Kollagenase plus Probe/Standard.

3.6. Hemmung der Kollagenaseaktivität (CAI)

Die Messung des CAI von Extrakten erfolgte in Abwandlung der Methoden von Wünsch und Heindrich [41]. Das Substrat, 4-Phenylazobezyloxylcarbonyl-Pro-Leu-Gly Pro-Arg (FALGPA), wurde in 10 ml Puffer auf 1,2 mg/ml gelöst und dann wurden 125 µl der Lösung zugegeben und 60 min lang inkubiert bei 37 ◦C. Collagenase wurde in dem Puffer auf 0,4 mg/ml gelöst, und 75 &mgr;l Enzymlösung wurden zu Pufferlösung gegeben. Das Enzym-Substrat-Gemisch wurde in einem Wasserbad bei 37°C für 30 min inkubiert und die Reaktion wurde durch Zugabe von 75 &mgr;l 20-prozentiger Citronensäure (w/v) gestoppt. Nach Zugabe von 1,5 ml Ethylacetat wurde die Ethylacetatschicht abgetrennt und die Extinktion bei 320 nm gemessen. Der Prozentsatz der Hemmung wurde gemäß der folgenden Formel berechnet.

CAI ( Prozent )={1 − [Abs (Kontrolle) − Abs (Probe)] /Abs (Kontrolle)}× 100 (4)

wobei Abs (Kontrolle) die Absorption von Puffer plus Kollagenase ist; Abs (Probe) ist die Extinktion von Puffer plus Kollagenase plus Probe/Standard.

3.7. Pflege und Kultivierung von Zelllinien

Melanin-produzierende B16-F0-Melanomzellen wurden von der Korea Cell Line Bank (KCLB, Chongno, Seoul, Korea) erhalten und in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ergänzt mit fötalem Rinderserum (FBS, 10 Prozent, Welgene, Gyeongsan, Korea) und antibiotischer Penicillin-Streptomycin-Lösung (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Trypsin-EDTA (Gibco, Grand Island, NY, USA) wurde zur Trypsinisierung von Zellen verwendet. Alle verwendeten Materialien waren von Zellkulturqualität.

3.8. Reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)

RT-PCR wurde durchgeführt, um die damit verbundenen Veränderungen der MMP-3- und TRP-1-Genexpressionsniveaus zu messenAufhellungund Anti-Falten-Wirkung wurden B16-F0-Zellen in einer 24-Well-Platte kultiviert, die mit verschiedenen Konzentrationen von Erdnussschalenextrakt in serumfreiem DMEM behandelt und 24 Stunden lang inkubiert wurde. Die unbehandelte Zellkontrolle wurde während des Experiments unter den gleichen Bedingungen wie die getestete Gruppe gehalten. Die RNA-Isolierung aus Zellen wurde unter Verwendung des AccuPrep® Universal RNA Extraction Kit (Bioneer, Daejeon, Korea) durchgeführt. Komplementäre DNA wurde unter Verwendung des AmfiRiert Platinum cDNA-Synthese-MasterMix (GenDEPOT, Barker, TX, USA) synthetisiert. Die RT-PCR-Analyse wurde unter Verwendung des CFX 96-Touch-PCR-Systems (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) durchgeführt, um die mRNA-Spiegel zu bestimmen. Die verwendeten Primer waren wie folgt: MMP-3 Sense, {{10}}AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-30 und Antisense, 50-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-30; und TRP-1 Sense, 50-GCTGCAGGAGCCTTCTTTCTC 30 und Antisense, 50-AAGACGCTGCACTGCTGGTCT-30. Ein geeigneter, oben erwähnter Primersatz wurde verwendet, um die jeweiligen Gene unter Verwendung der folgenden Zyklusbedingungen zu amplifizieren: 94 ◦C für 5 min, gefolgt von 25 Zyklen bei 95 ◦C für 5 s, 60 ◦C für 30 s (für MMP-3) , und 60 ◦C für 30 s (für TRP-1) und 72 ◦C für 30 s Verlängerung. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1-prozentigen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, mit Ethidiumbromid gefärbt und unter Verwendung von Gel Doc TM XR plus System und Quantity One Software 2.0 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) sichtbar gemacht. Als Ladekontrolle wurde ein Haushaltsprotein, -Actin, verwendet, wobei angenommen wurde, dass die Expressionsniveaus dieser Proteine ​​konstant bleiben.

4. Schlussfolgerung

In dieser Studie wurde der komplementäre Ansatz für die Rückgewinnung und Verwendung von bioaktiven Substanzen aus landwirtschaftlichen Nebenprodukten von Erdnussschalen verwendet, um Mehrwert-Inhaltsstoffe mit Mehrfachverwendung zu entwickeln. Zunächst haben wir versucht, die Extraktionseffizienz von bioaktiven Verbindungen mit antioxidativer, hautaufhellender und Anti-Falten-Wirkung zu erhöhen, indem wir den UAE-Prozess optimiert haben. Daher wurden in dieser Studie die VAE zur effizienten Produktion von bioaktiven Verbindungen mit eingesetztHautaufhellungund Anti-Falten-Effekte von Erdnussschalen und angewandte statistisch basierte Optimierung zur gleichzeitigen Maximierung von RSA, TAI und CAI. Die VAE-Bedingungen wurden mit CCD optimiert und es wurde bestätigt, dass die Wahl des Lösungsmittels und der Konzentration bei der Extraktion von bioaktiven Verbindungen aus Erdnussschalen berücksichtigt werden sollte. Durch Überlappen der Reaktionsflächen wurden Kurven dreier abhängiger Variablen, eine Extraktionszeit von 31,2 min, eine Extraktionstemperatur von 36,6 °C und eine Ethanolkonzentration von 93,2 Prozent als optimale Bedingungen für die VAE bestimmt. Es wurde bestätigt, dass der RSA von Erdnussschalenextrakten sehr hoch ist und eine Erhöhung der TAI und CAI, die Indikatoren dafür sind, zu erwarten istHautaufhellungbzw. Anti-Falten-Effekte. Die Optimierung der VAE-Bedingungen bestätigte eine Steigerung der Produktion von bioaktiven Substanzen in Erdnussschalen sowie aufhellende und Anti-Falten-Aktivitäten des ErdnussschalenextraktsTyrosinaseund Herabregulierung der Kollagenase-Aktivität. Auf dieser Grundlage wurde die Wirkung von Erdnussschalen auf die Expressionsniveaus von MMP und TRP bewertet, um zu beurteilen, ob sie auf der Ebene der Genexpression aufhellende und Anti-Falten-Wirkungen haben mRNA-Expression sowie Hemmung der Proteinexpression von MMP-3 und TRP-1. Daher hat sich Erdnussschalenextrakt als wirksam erwiesenAufhellungund Faltenverbesserung auf Proteinexpressions- und Genebene. Erdnussschalenextrakt unter Verwendung von UAE hat eine hohe antioxidative Aktivität und hervorragende hautaufhellende und Anti-Falten-Wirkungen, was der Erdnussschale ein großes Potenzial als natürlicher Kosmetik- und Lebensmittelbestandteil verleiht. Darüber hinaus wird angenommen, dass die Herstellung von bioaktiven Verbindungen unter Verwendung von UAE angesichts der höheren Produktionsausbeute und der geringeren Verarbeitungskosten im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren auf das Kommerzialisierungsverfahren für die Herstellung von Kosmetika, Lebensmitteln und pharmazeutischen Materialien angewendet werden kann.