Während es nicht den Anschein hat, dass der Prozentsatz an TEX mit der Schwere der Erkrankung zunimmt (ergänzende Abbildung 6C) oder mit zunehmendem Alter der zu Lupus neigenden Tiere (6), nimmt die Gesamtzahl der infiltrierenden T-Zellen in diesen Modellen und bei menschlichen Patienten mit der Schwere der Erkrankung zu. Daher kann es einen Punkt geben, ab dem die Erschöpfung eintrittdie Krankheit nicht mehr unter Kontrolle haben. Frühere Arbeiten deuteten darauf hin, dass bei Patienten mit einer CD8-plus-TEX-Signatur im peripheren Blut die Wahrscheinlichkeit eines Krankheitsschubs geringer war als bei Patienten ohne diese Signatur (52). Was jedoch auf der Ebene des Zielorgans geschieht, bleibt eine offene Frage, und es wird in zukünftigen Arbeiten interessant sein, festzustellen, ob der Anteil erschöpfter Zellen in einer Biopsie mit dem Krankheitsverlauf korreliert werden kann.

Relevanten Studien zufolge ist Cistanche ein traditionelles chinesisches Kraut, das seit Jahrhunderten zur Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt wird. Es ist wissenschaftlich erwiesen, dass es entzündungshemmende, Anti-Aging- und antioxidative Eigenschaften besitzt. Studien haben gezeigt, dass Cistanche für Patienten mit Nierenerkrankungen von Vorteil ist. Es ist bekannt, dass die Wirkstoffe der Cistanche Entzündungen reduzieren, die Nierenfunktion verbessern und geschädigte Nierenzellen wiederherstellen. Daher kann die Integration von Cistanche in einen Behandlungsplan für Nierenerkrankungen große Vorteile für Patienten bei der Bewältigung ihrer Erkrankung bieten. Cistanche hilft, Proteinurie zu reduzieren, senkt den Harnstoff- und Kreatininspiegel und verringert das Risiko weiterer Nierenschäden. Darüber hinaus trägt Cistanche auch dazu bei, den Cholesterin- und Triglyceridspiegel zu senken, was für Patienten mit Nierenerkrankungen gefährlich sein kann.

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Es wird wichtig sein, die Mechanismen zu identifizieren, durch die jeder dieser potenziell schädlichen Zelltypen und Ereignisse von der Niere gehemmt wird, und wie bestehende und neuartige Therapien sie beeinflussen können. Wir hoffen, dass diese Arbeit es uns und anderen ermöglichen wird, diese unterschiedlichen T-Zellpopulationen gezielter anzusprechen und so neue therapeutische Wege zu eröffnen.

Methoden

Tiere. C57BL/6-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory gekauft. MRL/lpr-Mäuse wurden ursprünglich vom Jackson Laboratory bezogen und in unserem Labor gehalten. Fc R2B–/–.Yaa-Mäuse wurden von Silvia Bolland (National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH, Rockville, Maryland, USA) erhalten und in unserem Labor gehalten. Die Mäuse wurden gealtert und die Proteinurie wurde vor der Tötung gemessen, wie in der Ergänzungstabelle 2 dokumentiert.

Isolierung von T-Zellen aus Niere und Milz. T-Zellen wurden wie zuvor beschrieben isoliert (6). Kurz gesagt, nach der Tötung wurde die Milz entfernt und den Tieren wurden 4 0 ml HBSS perfundiert, bis Leber und Niere vollständig blanchiert waren. KITs wurden unter Verwendung des Octodissoziators (Miltenyi Biotec) in Gegenwart von 1600 Kunitz-Einheiten/ml Kollagenase D (Roche Diagnostics) und 0,2 mg/ml DNAse IV (MilliporeSigma) für 30 Minuten bei 37 Grad isoliert. Es wurde eine RBC-Lyse durchgeführt und die Zellen wurden durch ein Zellsieb (100 μM Nylon; Falcon, Corning) filtriert. Splenozyten wurden durch mechanische Dissoziation zwischen zwei Milchglasobjektträgern isoliert und nach der RBC-Lyse durch einen 70-μm-Maschenfilter filtriert.

Die Zellen wurden wie zuvor beschrieben (6) mit dem folgenden Panel gefärbt: Anti-CD8 (Lyt-2/TIB-105, Pac-Blue, selbst hergestellt), Anti-CD4 (GK{{9 }}.5, in PE, gekauft von BioLegend) und Anti-CD90.2 (Thy1.2/30H12, Al488, selbst hergestellt) für MRL/lpr-Mäuse oder Anti-CD90.2 (Thy1.2/30H12 , Al647, selbst hergestellt) für Fc R2B–/–. Yaa Ghost BV510 (Tonbo) wurde verwendet, um tote Zellen auszuschließen. Für alle „hausinternen“ Antikörper sind Hybridomklone im Handel erhältlich und die Antikörper wurden wie beschrieben gereinigt (6).

T-Zellen wurden mit einem FACSAria (BD Biosciences) sortiert. Nach dem Sortieren wurden die Zellen zweimal mit 2 Prozent BSA in PBS gewaschen. Dann wurden jeder der sortierten Proben Anti-CD45-HTO-Reagenzien in einer Verdünnung von 1:50 zugesetzt. Anti-CD45 TotalSeq-A0096 30-F11 (BioLegend) wurde für die Main-Seq-Kohorte verwendet, und TotalSeq-C0096 30-F11 (BioLegend) wurde für beide TCR-Seq-Kohorten verwendet. Nach der HTO-Färbung wurden die Zellen zweimal in 2 Prozent BSA in PBS gewaschen.

Bibliotheksvorbereitung und RNA-Seq von T-Zellen. Die Zellen wurden gezählt und gemäß den Anweisungen des Herstellers in das 10x Genomics Chromium-System geladen. Genexpressions-, TCR- und Antikörper-Hashtag-/Feature-Barcode-Bibliotheken wurden generiert, ihre Qualität wurde mit dem Agilent TapeStation High Sensitivity D5000 Screentape bewertet und ihre Mengen wurden mit dem KAPA Library Quantification Kit für Illumina-Plattformen quantifiziert. Für die Main-Seq-Kohorte wurde die 3PrimeV2-Bibliothek verwendet; Die Feature-Barcode-Bibliothek wurde gemäß dem Protokoll des New York Genome Center generiert (56). Für die TCR-Seq-Kohorten wurden die 5PrimeV1-Bibliotheken von 10x Genomics bezogen. Beim Hashtagging haben wir uns an die „Feature-Barcode“-Anweisungen des Herstellers gehalten. Bibliotheken wurden gepoolt und auf einem NovaSeq (Illumina Biosciences) sequenziert. FASTQ-Dateien wurden generiert und mit Cell Ranger 5.0.0 (10x Genomics) an das Maus-Referenzgenom mm10 angepasst, um die Gen-Zell- und Zell-Antikörper-Zählmatrix zu erstellen.

scRNA-Seq-Datenverarbeitung. Die 10x-Rohdaten jeder Probe wurden demultiplext und FASTQ-Dateien wurden mithilfe der „schnellen“ Cell Ranger-Pipeline (v5.0.0, 10 generiert. x Genomik). Die „Zählung“ von Cell Ranger wurde verwendet, um die Lesevorgänge mit dem mm10-Referenzgenom abzugleichen, und es wurden mRNA-Transkripte und HTO-Quantifizierungstabellen für eindeutige molekulare Identifikatoren (UMI) erstellt. Die aus der Cell Ranger-Pipeline generierten Rohcode-Matrixdateien wurden weiter für die nachgelagerte Analyse mithilfe des Seurat-Pakets (v4.0.0) (12) in R (v3.4.3) verwendet.

Erste Qualitätskontrolle und Verarbeitung. Zellen, die weniger als 200 Gene exprimierten oder bei denen mehr als 10 Prozent der UMIs auf mitochondriale DNA abgebildet waren, wurden herausgefiltert. Die HTO-Tabellen wurden dem Datensatz hinzugefügt und mithilfe der Funktion „NormalizeData“ mithilfe einer Centered-Log-Ratio-Methode normalisiert. Die normalisierte HTO-Zahl wurde verwendet, um mithilfe der Seurat-Funktion „MULTIseqDemux“ und der manuellen Inspektion von Zellen zu bestimmen, ob jede Gelkügelchen-in-Emulsion eine einzelne Zelle enthielt. Dabei wurde eine Zelle als Singulett betrachtet, wenn die Expression eines einzelnen HTO mehr ausmachte als 70 Prozent der gesamten HTO-Expression in dieser Zelle; andernfalls wurde die Zelle als Dublett betrachtet und entfernt. Die Genexpressionswerte für jede Zelle wurden mit der Funktion „NormalizeData“ log2 -normalisiert, wobei die Expression eines Gens auf die Gesamtexpression aller Gene in dieser Zelle normalisiert und um den Faktor 10 skaliert wurde,{{8 }}. Die Werte für UMI, Mitochondriengehalt sowie Hämoglobin-Gen- und Ribosom-Gengehalt wurden mithilfe der „ScaleData“-Funktion von Seurat „herausgerechnet“.

Dimensionsreduktion und Clustering. Variable Gene wurden mithilfe der Methode „mean.var.plot“ in der Funktion „FindVariableFeatures“ mit Standard-Cutoff erkannt, der die mittlere Expression und Streuung (log[variance/mean]) pro Gen berechnet und anschließend die Daten in 20 Bins gruppiert basierend auf ihrem gemeinen Ausdruck. Anschließend wurden variable Gene basierend auf der Z-Score-Dispersion innerhalb jedes Bins ausgewählt. Diese variablen Gene wurden zur Dimensionsreduktion basierend auf der Hauptkomponentenanalyse (PCA) unter Verwendung der Funktion „RunPCA“ verwendet. „ElbowPlot“ wurde verwendet, um die ersten 50 Hauptkomponenten zu bewerten, und die Hauptkomponenten, die für die größte Variabilität in den Daten verantwortlich waren, wurden für die weitere UMAP-Dimensionsreduktion und Clustering-Analyse ausgewählt.

Um verschiedene Gruppen von Zellen zu identifizieren, wurde unbeaufsichtigtes Clustering mit der Funktion „FindClusters“ durchgeführt, die die k-nächsten Nachbarn entsprechend der variablen Genexpression in allen Zellen berechnet und so mithilfe des Louvain-Algorithmus ein gemeinsames Nächste-Nachbarn-Diagramm erstellt. Um eine Überclusterung zu vermeiden, haben wir verschiedene Auflösungsparameter („res“) getestet, die von 0.1 bis 2 in Schritten von 0.1 reichten, und der Clustering-Fortschritt wurde mithilfe von „Cluster“ bewertet und visualisiert " (v 0.4.3) (57). Die optimale Auflösung wurde auf der Grundlage einer fortgesetzten Trennung vor der „Überclusterung“ ermittelt, die durch die zunehmende Überkreuzung zwischen Clustern beobachtet wird. Clustering mit niedriger Auflösung wurde dann als die Analyse aller Zellen innerhalb einer gesamten Kohorte definiert, während Clustering mit hoher Auflösung als Clustering auf einer vorab ausgewählten Subpopulation definiert wurde, d. h. CD4 plus-, CD8 plus- oder Treg-Zellen, die zuvor in unserer niedrigen Auflösung definiert wurden Analyse. Basierend auf diesen Beobachtungen wählten wir die Auflösungen 0.9, 1.4, {{20}}.6 bzw. 0.9 für Main-Seq, CD4 plus, CD4 plus Treg sub und CD8 plus aus Kohorte 1 und Auflösung 0,7 für fusionierte Kohorten-CD8 plus T-Zellen. Zellcluster wurden mithilfe von UMAP-Dimensionsreduktionsdiagrammen visualisiert.

Die Funktion „FindAllMarkers“ mit Standardeinstellungen wurde verwendet, um DEGs in jedem Cluster im Vergleich zu allen anderen Clustern zu finden, wobei der Wilcoxon-Rangsummentest verwendet wurde, wobei Gene in mindestens 10 Prozent der Zellen erkannt wurden von 0,25 durchschnittlicher logarithmischer Faltungsänderung und einem Bonferroni-bereinigten P-Wert von mindestens 0,01.

Harmonieanalyse. Für die kombinierte UMAP in Abbildung 8 wurden die drei unabhängig durchgeführten Kohorten mithilfe von Harmony (58) mit Standardparametereinstellungen zusammengeführt.

Bewertung des Zellzyklus. Die „CellCycleScoring“-Funktion in Seurat wurde verwendet, um den G1-, G2/M- und S-Phasenmarker-Expressions-Score in jeder Zelle unter Verwendung der zuvor beschriebenen Scoring-Strategie zu berechnen (59). Die Anzahl der Zellen, von denen festgestellt wurde, dass sie sich in der G1-, G2/M- oder S-Phase befinden, wurde pro Cluster berechnet und die Abweichung von der Gesamtverteilung wurde durch χ2-Analyse bewertet.

GSEA und Ausdruckszuordnung. Die P-Werte für GSEA wurden unter Verwendung des Wilcoxon-Tests für veröffentlichte Gensatzsignaturen gemäß der Definition in der Ergänzungstabelle 1 bestimmt. Unter Verwendung von „ggplot2“ in Seurat wurden –log10-P-Werte auf die UMAPs aufgetragen.

Zusätzliche Analysen. Balkendiagramme, Punktdiagramme und PCA-Diagramme wurden mit ggplot2 in R erstellt. Heatmaps wurden mit der Funktion „Heatmap“ in R generiert.

TCR-Datenanalyse. TCR-Daten wurden mit Cell Ranger vdj mit der Referenz {{0}} refdata-cellranger-vdj-GRCm38-alts-ensembl-3.1.0 verarbeitet, um TCR und Ketten zusammenzusetzen und Klonotypen zu bestimmen . Zellen mit 1 produktiven TCR ( und ) wurden zur weiteren Analyse aufbewahrt, während nichtproduktive TCR-Ketten ausgeschlossen wurden. Klonale T-Zellen wurden als Zellen definiert, die gemeinsame TCR- und -Rezeptoren mit identischen CDR3-Sequenzen auf Nukleotidebene exprimieren.

Pseudozeit-Trajektorienanalyse. Die Trajektorienanalyse unter Verwendung der Seurat-verarbeiteten Genzahlen wurde mit Monocle 3 (Version 0.1.3) durchgeführt, um die Differenzierung von CD4 plus T-Zellen zu modellieren. Um die Dimensionalität zu reduzieren, wurde die umgekehrte Graph-Einbettungsmethode DDRTree verwendet, Zellen wurden mit der Funktion „orderCells“ entlang einer Trajektorie geordnet und die Trajektorie wurde im reduzierten Dimensionsraum visualisiert.

Um die Differenzierung von CD8 plus T-Zellen zu modellieren, verwendeten wir Slingshot mit der Einstellung „start.clubs“ als B6/naiver Cluster. Die Zellen wurden nach Slingshot-Pseudozeit geordnet und als Seurat-Cluster gruppiert, um die Flugbahn des Clusters zu projizieren. Das Ergebnis der Slingshot-Trajektorie-Abstammung wurde auf dem CD8-Plus-Zellen-Seurat-UMAP aufgezeichnet.

Analyse des regulatorischen TF-Netzwerks. Der SCENIC v.1.1.2-Workflow wurde in R verwendet, um Regulons mithilfe der von Seurat verarbeiteten Anzahl und Cluster gemäß einer früheren Studie zu identifizieren (60). Anschließend wurden wie oben beschrieben Heatmaps erstellt.

Histologische Bewertung. Die Vorbereitung und Bewertung der Nierenhistologie erfolgte wie zuvor definiert (61).

Daten- und Materialverfügbarkeit. Alle Analysen und Visualisierungen wurden in R durchgeführt. Spezifische Methoden und Analysen mit veröffentlichten Seurat-Programmen werden im Abschnitt „Methoden“ detailliert beschrieben. Die Daten, Metadaten und Analyseergebnisse wie die Clusteridentifizierung werden im Gene Expression Omnibus (GSE197339) des National Center for Biotechnology Information hinterlegt.

Statistiken. Die Statistiken wurden in R wie in den analysespezifischen Abschnitten angegeben oder in GraphPad Prism durch 1-Weg-ANOVA mit Tukey-Test für mehrere Vergleiche, 2-Weg-ANOVA mit wiederholten Messungen oder χ2-Analyse wie in den Abbildungslegenden definiert berechnet. mit P-Werten dargestellt als *P < 0.05, **P < 0.{{10}}1, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Studiengenehmigung. Alle Arbeiten wurden entweder vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pittsburgh oder der Yale University genehmigt.

Autorenbeiträge

JST und MJS haben die Studie konzipiert. SS, MC, JST und MJS haben eine Methodik entwickelt. JST und SS wurden untersucht. JST- und SS-visualisierte Daten. JST und MJS haben Fördermittel eingeworben. JST und MJS übernahmen die Projektverwaltung. JST und MJS sorgten für die Aufsicht. JST und MJS haben den ursprünglichen Entwurf geschrieben. JST, MJS, SS und MC haben den Entwurf überprüft und bearbeitet.

Danksagungen

Wir möchten Minjung Kim für ihren unermüdlichen Einsatz im Labor danken, der die Verwirklichung dieser Arbeit ermöglicht hat, und danken Kevin Nickerson, Rachael Gordon und Peter Lipsky für kritische Einblicke in das Projekt sowie Fadi Lakkis und Warren für die kritische Rezension dieser Arbeit Schlomtschik. Darüber hinaus möchten wir dem Single Cell Core der University of Pittsburgh und insbesondere Tracy Tabib danken, die uns bei der Fertigstellung der Bibliotheksvorbereitung und der 10x-Genomics-Technologie unterstützt haben.

Die Finanzierung erfolgte durch die Lupus Research Alliance, Novel Research Grant (an JST); NIH/National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases gewähren K08AR075056 (an JST); und NIH/National Institute of Allergy and Infectious Diseases gewähren R01 AI137132 (an MJS).

Korrespondenz adressieren an:Jeremy S. Tilstra, 3500 Terrace Street, BST S705A, Pittsburgh, Pennsylvania 15261, USA. Telefon: 412.383.8861; Oder an Mark J. Shlomchik, W1052 Biomedical Science Tower, 200 Lothrop Street, Pittsburgh, Pennsylvania 15261, USA. Telefon: 412.648.8771.

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