Hochauflösende Tandem-Massenspektrometrie identifiziert ein besonderes Gangliosidmuster in der frühen diabetischen Nierenerkrankung von Patienten mit Typ-2-Diabetes mellitus Ⅱ

2.2. Detaillierte Strukturanalyse polysialylierter Spezies im Zusammenhang mit Makroalbuminurie durch HCD MS/MS

Das HR-MS-Screening zeigte, dass das Gangliosid bei Patienten mit Makroalbuminurie durch einen erhöhten Gesamtgehalt an Sialinsäure gekennzeichnet ist. In der A3-Probe wurden nicht weniger als vier Pentasialo-Gangliotetraosen der Klasse GQ1 mit hoher Massengenauigkeit identifiziert. Das nur im Screening-Massenspektrum von A3 detektierte Ion bei m/z 812,7{{10}}68 wurde laut Massenberechnung dem dreifach deprotonierten und sodiierten GQ1(d18:1/18) zugeordnet :0). Um diese mit Makroalbuminurie assoziierte Spezies strukturell im Detail zu charakterisieren, haben wir das Ion bei m/z 812,7068 isoliert und es im negativen Ionenmodus einem HCD-MS/MS bei HR unterzogen. Die Ziele dieses Tandem-MS-Experiments waren: (i) die Untersuchung der Oligosaccharidkettenstruktur; (ii) die Bestätigung der Ceramidzusammensetzung, die unter Berücksichtigung der Masse der gesamten GQ1-Moleküle postuliert wurde; (iii) Sammeln spezifischer Daten zur Lokalisierung der Neu5Ac-Monosaccharide entlang des Oligosaccharid-Rückgrats, was zur Isomerenunterscheidung der fünf häufigsten GQ1(d18:1/18:0)-Strukturen (Abbildung 3) führt, die im Urin von vorhanden sein könnten Patienten mit Makroalbuminurie.

Dargestellt ist das Fragmentierungsspektrum des [M-4H+Na]3−-Vorläuferions, das bei m/z 812,7068 detektiert wurde und durch Kombination der zwei Minuten lang unter variabler Kollisionsenergie in einem Bereich von 30–80 eV erfassten TIC erzeugt wurde in Abbildung 4.

Abbildung 3. Die fünf häufigsten Isomere von GQ1(d18:1/18:0): (A) GQ1a(d18:1/18:{{10}}) iso mer; (B) GQ1b(d18:1/18:{{20}}) Isomer; (C) GQ1c(d18:1/18:0)Isomer; (D) GQ1d(d18:1/18:0)-Isomer; (E) GQ1e(d18:1/18:0)-Isomer.

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Die MS/MS-Daten bestätigen die (d18:1/18:0)-Zusammensetzung des Ceramids durch Y0 bei m/z 564,8704 und Y1 bei m/z 726,5845 entsprechend der Glc-Cer-Sequenz, sowie das interne Spaltungion S bei m/z 325,1828 entsprechend der C18:0-Fettsäure (Abbildung 5). Ebenso wird der Gesamtsialylierungsstatus des Moleküls dokumentiert. Daher entspricht das B1-Ion, das bei m/z 290,0868 nachgewiesen wurde, und sein natriumhaltiges Gegenstück bei m/z 312,0686 der Ablösung eines Neu5Ac-Rests vom Mutterion, zusammen mit dem distalen Element, das bei m/z 581,1807 und m/z 603,1626 nachgewiesen wurde , bestätigen das Auftreten der Neu5Ac-Neu5Ac-Verknüpfung.

Abbildung 5. Schema der Fragmentierung durch HCD-MS/MS des [M-4H++Na+ ] 3−-Vorläufers bei m/z 812,7068 und der für das GQ1d-Strukturisomer diagnostischen Sequenzionen.

Unter Berücksichtigung der häufigsten Verknüpfungsposition von Neu5Ac-Resten entweder am internen oder externen Gal gibt es fünf mögliche Strukturkandidaten für GQ1(d18:1/18:0), wie in Abbildung 3 dargestellt. Das Ion an m/z 1032,3662, gebildet durch eine Doppelbindung und interne Kreuzringspaltungen und zugeordnet zu Z4 /Y0/ 2,4A2 , zusammen mit dem bei m/z 936,7894 als Y2 / detektierten Ion 3,5A1 unterstützt die Anlagerung aller vier Neu5Ac-Reste an das innere Gal. Obwohl das Auftreten anderer Strukturisomere nicht vollständig ausgeschlossen werden kann, zeigen diese beiden Fragmentionen, dass das Strukturmotiv mit dem (D)-Kandidaten übereinstimmt, der dem d-Isomer von GQ1(d18:1/18:0) entspricht. , ist im A3-Beispiel definitiv vorhanden. Das Schema in Abbildung 5 zeigt den Fragmentierungsweg, den das Vorläuferion entsprechend GQ1d(d18:1/18:0) erfährt.

Der nächste Makroalbuminurie-assoziierte Polysialkandidat für eine detaillierte Strukturanalyse ist das [M-3H+ ] 3−-Ion, das ausschließlich im Screening-Massenspektrum der A3-Probe bei m/z 708,3379 nachgewiesen und zugeordnet wurde: auf Basis der exakten Massenberechnung zu GT1(d18:1/18:0). Dieses Ion wurde isoliert und der Fragmentierungsanalyse mittels Tandem-MS unter Verwendung von HCD unterzogen. Das Produkt-Ionen-Spektrum, das durch Summieren von Scans erzeugt wird, die 2 Minuten lang bei variablen Kollisionsenergien zwischen 30 und 80 eV aufgenommen wurden, ist in Abbildung 6 zusammen mit der chemischen Struktur dieser Spezies und der Zuordnung der Hauptsignale dargestellt. Der Fragmentierungsmechanismus unter den verwendeten MS/MS-Bedingungen ist zusammen mit den diagnostischen Fragmentionen in Abbildung 7 dargestellt. Um die Sichtbarkeit aller zugewiesenen Produktionen zu verbessern, ergänzt Tabelle 3 die Liste der identifizierten Signale im in Abbildung 6 dargestellten Spektrum.

Abbildung 6. Strukturanalyse mittels (−) nanoESI HR HCD MS/MS des in der A3-Probe bei m/z 708,3379 nachgewiesenen [M-3H+ ] 3−-Vorläuferions, das laut entspricht nach Massenberechnung GT1(d18:1/18:0). Erfassungszeit: 2 Min.; variable Kollisionsenergien innerhalb von 30–80 eV. Einschub: die aus den MS/MS-Daten abgeleitete Struktur des GT1b(d18:1/18:0)-Isomers.

Durch die HCD-Fragmentierung entstanden mehrere Sequenzionen, die als Folge glykosidischer Bindungen und Kreuzringspaltungen auftraten. Diese Ionen sind äußerst nützlich für die Zuordnung der gesamten Kohlenhydratsequenz, die Identifizierung von GT1-Positionsisomeren und für die Bestätigung der Ceramid-Aglycon-Zusammensetzung.

Der Ceramidtyp d18:1/18:0 wird durch das Y0-Ion bei m/z 564,5353 erkannt und durch die durch Y1 identifizierte Glc-Cer-Sequenz bei m/z 726,5879 unterstützt. Darüber hinaus beweist die Ionenzuordnung das Vorhandensein einer GT1-Isoform. Das Ion bei m/z 493,1669 mit einer NeuAc-GalNAc-Zusammensetzung kann ausschließlich aus GT1 stammen, das durch die Sialylierung des GalNAc-Rests gekennzeichnet ist. Der Rest der Fragmentionen lässt auf die Existenz des GT1b-Strukturisomers in der A3-Probe schließen. Die Struktur des GT1b wird durch alle Ionen gestützt, die vom nichtreduzierenden Ende des Moleküls ausgehen, dokumentiert durch die Y-Typ-Reihe, begleitet von zwei Z-Ionen, von denen eines in geringerer Häufigkeit vorkommt (Abbildung 6). Das bei m/z 888,6405 als recht häufig vorkommende Y2/B2 weist jedoch auf die Gal-Glc-Cer-Sequenz hin, die möglicherweise entweder vom GT1a- oder GT1b-Isomer nach der entsprechenden Desialylierung durch Neu5Ac- oder Neu5Ac-Neu5Ac-Ablösung stammt das innere Gal oder von einem Isomer, das ein unsubstituiertes inneres Gal enthält, wie etwa GT1d.

Andererseits belegt Y2, das bei m/z 734,5701 nachgewiesen wurde, die Lokalisierung des Disialo-Neu5AcNeu5Ac-Elements im inneren Gal, eine Konfiguration, die mit dem GT1b-Isomer übereinstimmt. Das Vorhandensein der distalen Gruppe wird auch durch das B2-Ion bei m/z 581,1828 belegt.

Bei der HCD-MS/MS stehen mehrere Signale im Zusammenhang mit der Teilmolekül-Desialylierung, wie z. B. Y4- und/oder Y3-Ionen, die der desialylierten Gg4Cer-Sequenz entsprechen; Diese Ionen können jedoch nicht die Bindungsstellen von Neu5Ac am neutralen Gg4-Glykankern anzeigen. Darüber hinaus ist das Signal bei m/z 364,1243, das der Gal-GalNAc-Sequenz entspricht, die dem internen GT1b-Spaltungs-B3/B1-Ion zugeordnet ist, dem GT1c-Isomer zuzuschreiben, da diese Glykoform ein unsubstituiertes terminales Gal-GalNAc-Disaccharid enthält. Mit Ausnahme von Y2, das mit GT1b assoziiert ist, könnten daher alle Ionen aus anderen Neu5Ac-Positionsisomeren wie GT1a, GT1, GT1c oder sogar dem selten berichteten GT1d stammen. Andererseits könnte Y2 selbst das Ergebnis eines Ereignisses mit geringer Wahrscheinlichkeit sein, das auch das Neu5Ac aus dem mit dem inneren Gal verbundenen Trials-Element eliminierte.

Da die MS/MS-Daten im Zusammenhang mit der Spaltung glykosidischer Bindungen außer der Offenlegung von GT1 nicht in der Lage waren, andere GT1-Isomere in der A3-Mischung eindeutig zuzuordnen, haben wir die Ringspaltungsionen sorgfältiger analysiert, um eine mögliche innere Fragmentierung zu entdecken, die GT1b unterstützt. Wir bemerkten das dreifach geladene Ion niedriger Intensität bei m/z 634,6067, was mit der Art der Kreuzringspaltung 0,2 an einem der terminalen Sialinsäurereste übereinstimmt, die in Im Fall von GT1b-Arten kann es entweder aus 0,2X4 oder 0,2X3 oder beiden vorkommen. Da das GT1b-Isomer im Allgemeinen häufiger vorkommt als GT1, zeigen die Abbildungen 6 und 7 die für GT1b spezifische Ionenzuordnung und das Fragmentierungsschema.

Aufgrund der Gal-GalNAc-Gal-Kettensymmetrie besteht keine Möglichkeit, andere Strukturisomere vollständig auszuschließen. Obwohl die HCD MS/MS-Daten die Existenz von GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) und GT1b(d18:1/18: 0) in der A3-Probe kann das mögliche Vorkommen anderer GQ1- und GT1-Isomere nicht ausgeschlossen werden. Unsere Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass drei Isomere – GQ1d(d18:1/18:0), GT1b(d18:1/18:{{30}}) und GT1 (d18:1 /18:0) sind definitiv in der A3-Probe vorhanden und können als molekulare Marker für Makroalbuminurie weiter untersucht werden.

3. Materialien und Methoden

3.1. Kriterien für die Einschreibung des Fachs

Um die Methode zu entwickeln und zu validieren, wurde eine Screening-Kohorte aus Typ-2-DM-Patienten und gesunden Kontrollpersonen in einer Querschnitts-Pilotstudie untersucht. Insgesamt 30 Typ-2-DM-Patienten, die die Ambulanz für Nephrologie und die Ambulanz für Diabetes und Stoffwechselerkrankungen aufsuchten, wurden entsprechend in 3 Gruppen eingeteiltUrinalbumin/Kreatinin-Verhältnis(UACR) wie folgt: 10 Patienten mit Normoalbuminurie (A1, definiert als UACR < 30 mg/g), 10 mit Mikroalbuminurie (A2, UACR 30–300 mg/g) und 10 mit Makroalbuminurie (A3, UACR > 300 mg/g) G). Zehn alters- und geschlechtsangepasste gesunde Kontrollpersonen (C), die zu Routineuntersuchungen in die Praxis eines Allgemeinarztes kamen, ohne bekannte Nierenerkrankungen in der Vorgeschichte und ohne DM (ausgeschlossen durch einen HbA1c-Wert kleiner oder gleich 5,6 %), wurden ebenfalls in diese Studie aufgenommen Studie

Alle in die Studie einbezogenen Patienten hatten eine DM-Dauer von mindestens 5-Jahren, eine stabile Nierenfunktion für mindestens 2 Jahre und eine gute Blutdruckkontrolle (<130/80 mmHg), negative urinary sediment, and a negative urine culture. The exclusion criteria were represented by other causes of proteinuria (other glomerular diseases, neoplasia, or autoimmune diseases), hematuria, poor control of DM (HbA1c > 10%), liver diseases, and pregnant or lactating women. The patients had no indication for Nierenbiopsie(Fehlen von Hämaturie und anderen Ursachen für Proteinurie, kein schneller Rückgang der GFR).

3.2. Ethikerklärung

Die Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und das Protokoll wurde von der Ethikkommission für Forschung der Institution (Board of Human Studies – „Victor Babes“ Universität für Medizin und Pharmazie Timisoara, Nr. 15/12.09.2016) genehmigt ; County Emergency Hospital, Nr. 100/23.11.2016). Alle Patienten und Kontrollpersonen stimmten der Teilnahme an der Studie zu, indem sie eine Einverständniserklärung unterzeichneten.

3.3. Laborbewertungen

Das Urin-Gangliosid von 30 Typ-2-DM-Patienten wurde in einer Querschnitts-Pilotstudie durch einen Vergleichstest mit 10 gesunden Kontrollpersonen untersucht. Biochemische Parameter bezogen sich auf Serumharnstoff und Kreatinin, 24-Stunden-Proteinurie, UACR, Urinsediment und Urinkultur. Alle Patienten waren negativ auf Harnwegsinfektionen. Die Zusammensetzung nativer Gangliosidmischungen wurde aus 24 Stunden gesammelten Urinproben ermittelt. Die Urinproben von Patienten und Kontrollpersonen wurden kurzzeitig bei –20 °C gelagert und vor dem Test aufgetaut.CKDwurde gemäß der KDIGO-Richtlinie für die Bewertung definiert undManagement chronischer Nierenerkrankungen. Die eGFR wurde mit berechnetchronisches NierenleidenGleichungsformel für epidemiologische Zusammenarbeit (CKD-EPI-Kreatinin-Gleichung 2009) [16].

3.4. Ganglioside-Extraktion und -Reinigung

Die Gangliosidextraktion folgte der von Svennerholm und Fredman [17] entwickelten und von Vukeli´c et al. modifizierten Methode. [18]. Wir haben dieses Protokoll zuvor für die Extraktion und Reinigung von Gangliosiden aus Körperflüssigkeiten angepasst und auf Ganglioside der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) angewendet. Die Methode wird ausführlich in unserer vorherigen Studie zur Profilierung und Fragmentierungsanalyse von CSF-Gangliosiden mittels Massenspektrometrie beschrieben [19]. Kurz gesagt, Lipide wurden zweimal mit einer Mischung aus Chloroform (C)/Methanol (M)/Wasser (W) bis zu einem Gesamtvolumenverhältnis von 1:2:0.75 C/M/W extrahiert, wobei „W“ entsprechend war zum Urin; Daher enthielt die Mischung 4 ml C, 8 ml M und 3 ml Urinprobe. Chloroform und Methanol in Analysequalität wurden von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet. Nach vollständiger Trennung der Phasen wurde gemäß den in [19] beschriebenen Verfahren die obere Phase, die polare Glykosphingolipide enthielt, gesammelt.

Die Reinigung der gesammelten rohen Ganglioside erfolgte in mehreren Schritten [19]: Entfernung der ausgefällten Protein-Salz-Komplexe, gefolgt von Zentrifugation und Gelfiltration auf einer Sephadex G-25-Säule (Sigma-Aldrich, Burlington, MA, USA). ), um niedermolekulare Verunreinigungen zu entfernen, und schließlich eine Dialyse über Nacht bei 4 ◦C gegen Wasser. Die Ganglioside wurden unter identischen Bedingungen aus allen Urinaliquoten extrahiert, was die Mischungen A1 (Normoalbuminurie), A2 (Mikroalbuminurie), A3 (Makroalbuminurie) und C (Kontrolle) ergab.

3.5. Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie

Die gereinigten A1-, A2-, A3- und C-Gangliosidextrakte wurden in einem SpeedVac Concentrator SPD 111 V-System (Savant, Düsseldorf, Deutschland), gekoppelt mit einer Vakuumpumpe, bis zur vollständigen Trockenheit eingedampft. Für das MS-Screening wurde jeder Trockenextrakt in reinem Methanol gelöst, um die Stammlösung zu erzeugen, und bei –20 °C gelagert. Vor der MS-Analyse wurden die Stammlösungen in einer Sigma 2–16-Modellzentrifuge (Sartorius AG, Göttingen, Deutschland) zentrifugiert. Für die Orbitrap-MS-Infusion wurden Arbeitsproben mit einer Konzentration von 5 pmol·µL −1 in reinem Methanol durch Verdünnen von Aliquots aus der Stammlösung erhalten. Die Gangliosidkonzentration in der infundierten Lösung wurde für ein durchschnittliches Molekulargewicht von 2000 g mol−1 berechnet.

3.6. Orbitrap-Massenspektrometrie mit nanoESI

Die MS-Experimente wurden auf einem LTQ Orbitrap Velos Pro™-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Deutschland) durchgeführt, das mit einer Offline-NanoES-Quelle ES 259 ​​(Thermo Fisher, Bremen, Deutschland) ausgestattet war.

Das Instrument ist ein Hybrid-Massenspektrometer, das zwei verschiedene Arten von Massenanalysatoren kombiniert und eine Vielzahl von Vorteilen bietet: hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit, gute Datenqualität und Analysegeschwindigkeit, die Möglichkeit zur Erkennung kleinerer Komponenten in komplexen Mischungen, geringer Probenverbrauch, und Vermeidung von Kreuzverhören und Verschleppung von Probe zu Probe.

Der erste Analysator ist eine lineare Quadrupol-Ionenfalle mit doppeltem Druck, die in der Lage ist, ein Ion mit einem spezifischen Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) zu isolieren und es zu aktivieren, indem kinetische Energie in das Ion mit dem spezifischen m/z der Reihe nach eingebracht wird um eine kollisionsbedingte Dissoziation zu verursachen. Der zweite Analysator ist der Orbitrap, der aus einer zylindrischen Außenelektrode und einer zylinderförmigen Innenelektrode besteht und die Ionen in kreisförmigen Bahnen um die Innenelektrode einfängt. Es verfügt über ein ausgezeichnetes Auflösungsvermögen und bietet die Möglichkeit, komplexe ionische Spezies in mehrstufigen MS (MSn)-Experimenten durch effiziente Fragmentierungstechniken zu sequenzieren.

Borosilikatkapillaren (10 cm lang) wurden mit einem Sutter p-97-Mikropipettenzieher gezogen, um Elektrospraykapillaren mit Spitzengrößen von 10 µm und Konuslängen von 4 mm herzustellen. Ein Volumen von 10 µL der Lösung mit einer Konzentration von 5 pmol·µL −1 in Methanol wurde in die Rückseite des Emitters eingeführt und ein 0,25 mm dicker Platindraht in die Lösung eingeführt. Die an den Platindraht und den Konus angelegten Potentialwerte wurden permanent angepasst, um eine effiziente Ionisierung der Komponenten zu erreichen. Der nanoESI-Prozess wurde durch Einstellen der Instrumentenparameter wie folgt eingeleitet: nanoESI-Spannung, 0,80 kV; Kegelspannung, 40–60 V; Desolvatisierungstemperatur: 80 °C; RF-Pegel des S-Objektivs: 60 %. Diese Werte der MS-Parameter verbesserten die Ionisierung und einen gleichmäßigen Sprühnebel und minimierten gleichzeitig die In-Source-Fragmentierung des labilen Neu5Ac-Rests, der an den Oligosaccharidkern des Gangliosidmoleküls gebunden ist.

Alle Massenspektren (MS und Tandem-MS) wurden im HR-Modus, der Detektion im Negativionenmodus und im Bereich von 200–2000 m/z aufgenommen. MS-Scans wurden mit einer Auflösung von 60.000 erfasst. Das Massenspektrometer wurde mit LTQ Tune Plus v2.7 (Thermo Scientific, Bremen, Deutschland) betrieben und gesteuert, und die MS-Datenerfassung und -verarbeitung erfolgte mit der Software Xcalibur 3.0.63 (Thermo Scientific, Bremen, Deutschland).

MS/MS-Experimente wurden im LTQ von CID in der Kollisionszelle unter Verwendung von Helium 5.0 Reinheit bei einem Druck von 50 psi als Kollisionsgas durchgeführt. Die MS/MS-Scans wurden mit einer Auflösung von 20 000 erfasst. Die Ionenauswahl und Fragmentierung wurde manuell durchgeführt. Die Vorläuferionen wurden innerhalb einer Isolationsbreite von 1 m/z-Einheit ausgewählt und durch HCD unter Verwendung variabler Kollisionsenergien im Bereich von 30–80 eV fragmentiert, um die Abdeckung der Fragmentionen zu verbessern.

Die durch Kombination der akkumulierten Scans abgeleiteten TICs und Massenspektren wurden mit der Software Xcalibur 2.1 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) verarbeitet, die die Extraktion der Spektren sowie deren Glättung und Subtraktion ermöglicht.

Vor den Experimenten wurde die m/z-Skala extern unter Verwendung der speziellen Referenz kalibriert, die kommerziell als Pierce® ESI Negative Ion Solution von Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) bekannt ist. Im Negativionenmodus lieferte dieser Standard ein Spektrum mit einer angemessenen Ionenabdeckung des m/z-Bereichs, der sowohl in MS- als auch in Tandem-MS-Experimenten gescannt wurde.

Zur Optimierung der nanoESI MS- und MS/MS-Bedingungen im Negativionenmodus, Vergleich und Datenauswertung wurden die folgenden kommerziell erhältlichen Standardgangliosidfraktionen gemessen: GM1 (Rinderhirn); GD1a, GD1b, GT1b und GQ1b (Schweinehirn); und GM3 und GD3 (Rindermilch) von Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL, USA) sowie der gesamte Gangliosidextrakt aus Rinderhirn, kommerziell bekannt als Cronassial-Mischung, aus Abano Terme (Padua, Italien).

3.7. Abkürzung für Ganglioside

Für die Gangliosidzuordnung wurde das 1980 von Svennerholm [20] eingeführte Abkürzungssystem zusammen mit den Empfehlungen der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature aus dem Jahr 1998 [21] wie folgt angewendet:

LacCer-Gal 4Glc 1Cer; GM3-II3 - -Neu5Ac-LacCer; GD3-II3 - -(Neu5Ac)2-LacCer; GT3-II3 - -(Neu5Ac)3-LacCer; GM2-II3 - -Neu5Ac-Gg3Cer; GD2-II3 - -(Neu5Ac)2-Gg3Cer; GM1a oder GM1-II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GalNAc-GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg5Cer; GD1a-IV3 - -Neu5Ac, II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GD1b-II3 - -(Neu5Ac)2- Gg4Cer; GT1b-IV3 - -Neu5Ac, II3 - -(Neu5Ac)2-Gg4Cer; GQ1b-IV3 - -(Neu5Ac)2, II3 - - (Neu5Ac)2-Gg4Cer; nLM1 oder 30 -nLM1-IV3 - -Neu5Ac-nLc4Cer; LM1 oder 30 -isoLM1-IV3 - - Neu5Ac-Lc4Cer; nLD1-disialo-nLc4Cer.

3.8. MS-Dateninterpretation

Da bislang keine dedizierte Computersoftware, Datenbanken oder andere IT-Dienste zur Unterstützung der Interpretation des Gangliosid-Screenings und der Tandem-Massenspektren verfügbar sind, wurden in dieser Studie die detektierten Molekülionen durch genaue Massenberechnung und auf dieser Grundlage den Gangliosidspezies zugeordnet der Informationen, die wir zuvor über diese Art von Glykosphingolipid und die bekannten Biosynthesewege gewonnen hatten. Bei der Interpretation der MS- und MS/MS-Daten und Massenberechnungen wurden wir durch den großen Bestand an Gangliosid-Molekül- und Fragmentionen unterstützt, die wir bisher mithilfe fortschrittlicher MS-Ansätze in verschiedenen menschlichen Geweben und Flüssigkeiten identifiziert und charakterisiert haben. Diese Strukturen stellen unsere ursprünglichen Datenbanken dar, die in unseren zuvor veröffentlichten Studien enthalten waren [12,19,22–31]. Die in dieser Arbeit beschriebenen neuen Arten vervollständigen unseren derzeit bestehenden Gangliosid-Rekord.

Die Zuordnung der im HCD MS/MS erzeugten Oligosaccharid-Rückgratsequenz-Ionen folgte der allgemein anerkannten Nomenklatur [24,25].

4. Schlussfolgerung

In dieser Studie haben wir einen auf HR-MS und Tandem-MS basierenden Ansatz zur Bestimmung von Gangliosiden bei DKD durch einen vergleichenden Test von Urinextrakten von Normo-, Mikro- und Makroalbuminurie-Patienten sowie gesunden Kontrollpersonen entwickelt, der unter identischer Lösung durchgeführt wurde und instrumentelle Bedingungen. Das endgültige Ziel unserer Studie bestand darin, die Veränderungen zu bestimmen, die in der Zusammensetzung und Struktur der Nierenganglioside auftreten, die bei DKD im Vergleich zu Kontrollen und in verschiedenen Stadien der Krankheit exprimiert werden.

Dank der hohen Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit, Auflösung und Massengenauigkeit der für diesen Zweck optimierten MS-Plattform konnten wir feststellen, dass der Sialylierungsgrad der exprimierten Spezies offenbar eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Krankheit spielt und einen Marker für DKD darstellt , sogar im Normoalbuminurie-Stadium von Typ-2-DM-Patienten. Darüber hinaus zeigen die beobachteten Veränderungen in der Zusammensetzung von Cer, dass neben der Glykanstruktur auch die Lipideinheit als molekularer Fingerabdruck für DKD-Stadien angesehen werden kann.

In der fortgeschritteneren Phase der Forschung wurde MS/MS von HCD für die Strukturanalyse der Arten mit einer möglichen Rolle als Biomarker eingesetzt. Im Fall der A3-Probe wurden die Molekülionen, die laut Massenberechnung GQ1(d18:1/18:0) und GT1(d18:1/18:{{1 0}}) wurden isoliert und in der Kollisionszelle des Instruments einer Fragmentierung unterzogen. Ziel dieser Experimente war es, Informationen über die detaillierte Strukturkonfiguration des Moleküls zu sammeln. Die optimierten Sequenzierungsbedingungen, insbesondere der Kollisionsenergiebereich und der Kollisionsgasdruck, induzierten spezifische Spaltungen der glykosidischen Bindungen, was zur Bildung von Fragmentionen führte, die als relevante Signale in den Tandem-Massenspektren nachgewiesen wurden. Mehrere Ionen erwiesen sich als diagnostisch für bestimmte Isomere, die mit der Lokalisierung der Neu5Ac-Einheiten in der Kohlenhydratkette des Gangliosidmoleküls zusammenhängen. Basierend auf diesen strukturell informativen Sequenzionen haben wir entdeckt, dass GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) und GT1b(d18:1/18: 0)-Isomere sind in der A3-Probe vorhanden und stehen im Zusammenhang mit Makroalbuminurie.

Die erhaltenen Ergebnisse erfordern eine weitere Validierung einiger Hypothesen in Längsschnittstudien, die an größeren Kohorten durchgeführt wurden, um einen Kausalzusammenhang zwischen der Komplexität der im Urin nachgewiesenen Ganglioside nachzuweisenDKD-Patientenund die sehr frühe Nierenbeteiligung im Verlauf von Typ-2-DM, sogar im Normoalbuminurie-Stadium. Wir sind jedoch der Ansicht, dass die vorliegenden Ergebnisse eine Forschungsrichtung zur Untersuchung der Rolle der Sialylierung, O-Acetylierung und O-Fucosylierung von Gangliosiden sowie ihrer Modifikationen durch O-GalNAc und CH3COO− beim Krankheitsverlauf eröffnen. Ein weiterer vorteilhafter Aspekt dieser Ergebnisse ist die mögliche Entwicklung von Verfahren zur frühen DKD-Diagnose auf der Grundlage von Gangliosidprofilen mithilfe fortschrittlicher Massenspektrometrie.

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