Abstrakt

Hintergrund:Es mangelt an Bildgebungs- und Bildverarbeitungstechniken zur genauen Unterscheidung und Quantifizierung der dermalen extrazellulären Matrix (ECM), vor allem Kollagen. Ziel dieser Studie war die Entwicklung und Demonstration eines ganzheitlichen Bildgebungs- und Bildverarbeitungsansatzes zur Visualisierung und Quantifizierung des Kollagenumbaus im Makro-, Mikro- und Nanobereich mithilfe histochemischer Bildgebung, konfokaler Reflexionsmikroskopie (RCM) und Rasterkraftmikroskopie (AFM). , jeweils.

Glykosid von Cistanche kann auch die SOD-Aktivität im Herz- und Lebergewebe erhöhen und den Gehalt an Lipofuscin und MDA in jedem Gewebe erheblich reduzieren, wodurch verschiedene reaktive Sauerstoffradikale (OH-, H₂O₂ usw.) effektiv abgefangen und vor verursachten DNA-Schäden geschützt werden durch OH-Radikale. Cistanche-Phenylethanoidglykoside haben eine starke Fähigkeit, freie Radikale abzufangen, eine höhere Reduktionsfähigkeit als Vitamin C, verbessern die Aktivität von SOD in der Spermiensuspension, reduzieren den MDA-Gehalt und haben eine gewisse schützende Wirkung auf die Funktion der Spermienmembran. Cistanche-Polysaccharide können die durch D-Galaktose verursachte Aktivität von SOD und GSH-Px in Erythrozyten und Lungengewebe experimentell seneszierender Mäuse steigern, außerdem den Gehalt an MDA und Kollagen in Lunge und Plasma verringern und den Gehalt an Elastin erhöhen eine gute Abfangwirkung auf DPPH, verlängert die Zeit der Hypoxie bei seneszenten Mäusen, verbessert die Aktivität von SOD im Serum und verzögert die physiologische Degeneration der Lunge bei experimentell seneszenten Mäusen. Bei der zellulären morphologischen Degeneration haben Experimente gezeigt, dass Cistanche über eine gute antioxidative Fähigkeit verfügt und hat das Potenzial, ein Medikament zur Vorbeugung und Behandlung von Hautalterungskrankheiten zu sein. Gleichzeitig hat Echinacosid in Cistanche eine erhebliche Fähigkeit, freie DPPH-Radikale abzufangen, reaktive Sauerstoffspezies abzufangen und den durch freie Radikale verursachten Kollagenabbau zu verhindern, und hat auch eine gute Reparaturwirkung auf Schäden durch freie Thymin-Radikalanionen.

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Material und Methoden:Zum Proof-of-Concept wurde ein kommerzielles Anti-Aging-Produkt, von dem bekannt ist, dass es die Kollagen-Neusynthese und -Reorganisation induziert, ex vivo an menschlichen Hautbiopsien von zwei alten Frauen getestet.

Ergebnisse:Im Vergleich zu unbehandelter Haut waren Kollagenfasern (RCM) und Fibrillen (AFM) nach der Behandlung länger und ausgerichtet. Der Gehalt an Kollagen und Elastin (histochemische Bildgebung und ELISA) verbesserte sich statistisch gesehen nach der Behandlung.

Abschluss:Basierend auf unseren Erkenntnissen können wir schlussfolgern: (1) AFM, RCM und histochemische Bildgebung können Kollagen genau von anderen ECM-Komponenten in der Haut unterscheiden und (2) die Bildverarbeitungsmethoden können eine Quantifizierung ermöglichen und somit kleine Verbesserungen bei der anschließenden Kollagenumgestaltung erfassen Behandlung (kommerzielles Kosmetikprodukt mit Collagen-Organizer-Technologie als Proof-of-Concept). Der berichtete ganzheitliche Bildgebungsansatz hat direkte klinische Auswirkungen für Wissenschaftler und Dermatologen, um schnelle, Echtzeit- und genaue Entscheidungen in der Hautforschung und -diagnostik zu treffen.

SCHLÜSSELWÖRTER

Anti-Aging, Rasterkraftmikroskopie, Kollagenreorganisation, Hautremodellierung, extrazelluläre Matrix, konfokale Reflexionsmikroskopie (Vivascope)

1. EINLEITUNG

Der kontrollierte Umbau der dermalen extrazellulären Matrix (ECM) ist für die normale Entwicklung und Homöostase der Haut und anderer Organe unerlässlich. Der ECM-Umbau ist das Kennzeichen der Pathophysiologie der Hautalterung,1 der Wundheilung und einiger tödlicher Krankheiten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Krebs und Fibrose.2 Es gibt zahlreiche ästhetische und medizinische Optionen zur Behandlung dieser Hauterkrankungen, bildgebende Verfahren sind jedoch rar Echtzeit-Visualisierung der ECM-Remodellierung, vor allem von Kollagen, dem häufigsten Strukturbestandteil der dermalen ECM. Einige der neuartigen nicht-invasiven klinischen Echtzeit-Bildgebungstechniken zur Visualisierung von Kollagen und seiner Organisation befinden sich noch in der Entwicklung: Multi-Photonen-Mikroskopie mit Erzeugung der zweiten Harmonischen (MPM-SHG),3 konfokale Reflexionsmikroskopie (RCM) und4 optische Kohärenztomographie (OCT),5,6 Lindfield Confocal Optical Coherence Tomography (LC-OCT) basierend auf der Kombination der Modalitäten von RCM und OCT,7 Magnetresonanztomographie (MRT)8 und Ultraschallbildgebung.9 Davon RCM, MPM und LC-OCT sind CE-zertifizierte Hautbildgebungsgeräte. Unter allen ist jedoch die RCM-Technik (Vivascope® 1500 und 3000 von Lucid, Inc. USA) die einzige von der FDA zugelassene klinische Dermatologie-Diagnosetechnik (510(k)# K080788), die auch von den meisten Versicherungen in den USA abgedeckt wird USA zur Diagnose von Hautläsionen.10 Es handelt sich um eine nicht-invasive und kostengünstige Alternative zu klassischen Biopsie- und Histopathologietechniken zur Diagnose und Überwachung von Hautkrebs und deren Behandlung.10 Zu den präklinischen Bildgebungsmethoden zur Visualisierung der Kollagenorganisation gehört die Rasterkraftmikroskopie ( AFM),11 Elektronenmikroskopie,11,12 histochemische Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie,13 Polarisationslichtmikroskopie,14 konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM),15,16 multimodale konfokale Reflexions- und Fluoreszenzmikroskopie17 und Röntgenkleinwinkelstreuung18 sehr bekannt.

Einer der größten Vorbehalte, die den Einsatz der oben genannten klinischen Bildgebungstechniken einschränken, besteht darin, dass sie eine langwierige manuelle Beurteilung erfordern, da Fachwissen und Erfahrung zur genauen Analyse von Schwarzweißbildern von Hautstrukturen erforderlich sind.19,20 Daher sind weitere Anstrengungen erforderlich Im Bereich der Bildverarbeitung ist es erforderlich, Algorithmen und Software zur Automatisierung der Analyse zu entwickeln und zu validieren,5 einfach zu interpretierende digital gefärbte Bilder zu erstellen16,17 und quantitative Informationen zu extrahieren, um den Krankheitsverlauf und die Therapie zu überwachen, einschließlich der Kollagenorganisation im Kontext unserer Forschung.3,6,12–14 Es wird Nicht-Dermatologen und Dermatologen ermöglichen, schneller und sicherer Entscheidungen zu treffen, da die Entscheidungen anhand einer größeren Stichprobe der randomisierten Bilder getroffen werden. Es wurden einige grundlegende Studien durchgeführt, um die Verwendung von RCM und MPM zum Verständnis altersbedingter Hautveränderungen (einschließlich Kollagenorganisation) bei jungen im Vergleich zu alten oder lichtgealterten Probanden zu zeigen.21,22 Allerdings gibt es nur begrenzte Anstrengungen, die Leistungsfähigkeit zu erweitern dieser Bildgebungstechniken zur Erfassung von Behandlungsverbesserungen, was eine ausgefeilte Bildverarbeitung erfordert, um quantitative Informationen zu erhalten.3,13,16

Ziel dieser Studie war es, einen ganzheitlichen Bildgebungs- und Bildverarbeitungsansatz zu entwickeln und zu demonstrieren, um Verbesserungen bei der Hautumgestaltung (hauptsächlich Kollagen) zu visualisieren und zu quantifizieren. Zur Machbarkeitsstudie wurde ein klinisch erprobtes kommerzielles Anti-Aging-Kosmetikprodukt mit Kollagen-Organizer-Technologie verwendet, um die Machbarkeit des Einsatzes von Bildverarbeitung zur Quantifizierung geringfügiger Veränderungen des Kollagens vor und nach der Behandlung zu bewerten.

2. MATERIALIEN UND METHODEN

2.1 Hautbiopsien und ihre Behandlung

Bei den in dieser Untersuchung verwendeten Hautbiopsien handelte es sich um übrig gebliebenes Material aus der plastischen Bauchchirurgie, das von zwei Spendern nach deren Einwilligung (die Einwilligung blieb den Kliniken vorbehalten) entnommen wurde. Spender Nr. 1 (62 Jahre alt) und Spender Nr. 2 (52 Jahre alt) waren beide weiblich und hatten einen Fitzpatrick-Hauttyp II. Die Biopsien wurden unter Standardkulturbedingungen gehalten und 6 Tage lang täglich mit dem Testprodukt oder der Kontrolle (unbehandelt oder Placebo) behandelt und am 7. Tag für die Bildgebung und den ELISA geerntet. Biopsien von Spender Nr. 1 wurden für ELISA, RCM und AFM verwendet, während Biopsien von Spender Nr. 2 für die histochemische Bildgebung verwendet wurden.

2.2 RCM- und AFM-Bildgebung

Die Hautbiopsien von Spender Nr. 1 wurden am 7. Tag entnommen und direkt ohne Schnitte und Färbung abgebildet. AFM (Bruker, Multimode 8 AFM) und RCM (Vivascope® 1500) wurden verwendet, um hochauflösende Bilder im Nano- und Mikromaßstab von Kollagen in Haut zu erhalten, die mit dem Testprodukt behandelt und als Kontrolle unbehandelt war. Für alle Experimente war das AFM mit einem kleinen Ausleger (PPP-FMR- 20, Nanosensors) ausgestattet: Federkonstante, k=0,5–9,5 N/m, Resonanzfrequenz, f {{13} }–115 kHz in Luft und wurde im Klopfmodus bei Raumtemperatur betrieben. Die Hautproben wurden seitlich auf eine Magnetplatte (1 mm × 1 mm) montiert und auf den Tisch gelegt. Die AFM-Bilder wurden durch eine seitliche/seitliche Ansicht der Hautbiopsien aufgenommen, um Schnitte zu vermeiden. Für die RCM-Bildgebung wurden sieben Zufallsbilder von behandelten und unbehandelten Biopsien von oben (Stratum-corneum-Seite) und unten (Dermis-Seite) aufgenommen, um qualitativ hochwertige Bilder von Kollagen zu erhalten. RCM-Bilder wurden mit ConfoScan® auf Kollagentextur verarbeitet und analysiert, um den mittleren Fragmentierungsindex zu ermitteln. Der Fragmentierungsindex wird durch die Fläche der Objekte dividiert durch die Anzahl der Objekte definiert, die nach der Verarbeitung der Rohbilder für die Kollagentextur erhalten wurden. Abbildung S1 zeigt die Bildverarbeitung mit ConfoScan®, um quantitative Werte für den Kollagenfragmentierungsindex (CFI) zu erhalten.

2.3 Histochemische Bildgebung

Um die Wirkung des Anti-Aging-Produkts auf die Behandlung lichtgealterter Haut (Wiederherstellung von lichtgeschädigtem Kollagen und Elastin) zu testen, wurden die Biopsien von Spender Nr. 2 einer simulierten UV-Dosis (6 J/cm2 mit 96 Prozent UVA) ausgesetzt ). Die in den Experimenten getesteten Proben und Bedingungen waren: (A) Negativkontrolle (unbehandelt, keine UV-Strahlung und kein Testprodukt), (B) Positivkontrolle (UV-Strahlung ausgesetzte Haut, aber kein Testprodukt) und (C) behandelte ( UV-exponierte Haut, anschließend tägliche Behandlung mit Testprodukt). Am 7. Tag wurden Hautbiopsien entnommen, geschnitten, auf Kollagen (Picosirius-Färbung) und Elastin (Immunfärbung) gefärbt und abgebildet. Die Bilder wurden mithilfe eines proprietären Bildanalysealgorithmus verarbeitet und analysiert, um quantitative Informationen über den Gehalt an Kollagen und Elastin in der papillären Dermis zu erhalten. Kurz gesagt umfasst der Analyseprozess zur Gewinnung quantitativer Informationen über den Kollagen- und Elastingehalt die Konvertierung von RGB-Bildern in den LAB-Farbraum, das Herausfiltern des Hintergrunds, um klare Bilder von Kollagen und Elastin zu erhalten, und die anschließende Normalisierung des Kollagen- und Elastingehalts in der papillären Dermis der gleiche Bereich oder mehrere Pixel. Es gab sechs Biopsien oder Hautproben für jede Erkrankung und zwei Schnitte oder Bilder von jeder Probe, was zu N=12 Bildern und Datenpunkten für statistische Tests führte. Abbildung S2 zeigt das Schema des Bildverarbeitungsansatzes, um quantitative Werte zum Kollagengehalt zu erhalten.

2.4 ELISA

Nach der Gewebeentnahme am 7. Tag wurde eine Stanze mit 4 mm Durchmesser verwendet, um kleinere Biopsien zu erhalten, und es wurden zwei Biopsien mit etwa 25 mg/Biopsie ausgewählt. Die gestanzten Biopsien (50 mg Gesamtgewicht) wurden in einem Lysepuffer gemischt, der 0,1 Prozent Triton und einen Proteaseinhibitor-Cocktail enthielt, gefolgt von der Homogenisierung des Gewebes mit einem automatisierten Dual-Processing-Homogenisator mit mechanischen und Ultraschallfunktionen, um das Gewebe vollständig zu lysieren Gewebe. Das lysierte Gewebe wurde zentrifugiert, der Überstand gesammelt, in zwei Teile aufgeteilt und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert. Zusätzlich zur Normalisierung hinsichtlich des Gewichts (50 mg) wurden die Proben auch auf den Gesamtproteingehalt im Überstand normiert. Der Überstand wurde mit kommerziellen ELISA-Kits auf Pro-Collagen 1, Elastin, Alpha-Smooth Muscle Actin (A-SMA), Tenascin-X und Hyaluronsäure analysiert. Die Statistiken wurden an N=6 Datenpunkten (3 Biopsien × 2 Aliquots) durchgeführt.

3. ERGEBNISSE

Die histochemische Bildgebung (Abbildung 1) lieferte makroskopische Informationen über die Verteilung und Menge von Kollagen und Elastin. Nach der Behandlung der Hautbiopsien mit UV konnte ein deutlicher Rückgang der Rotfärbung der Kollagen- und Elastinfaserbündel beobachtet werden.

Tabelle 1 zeigt die quantitativen Werte des Kollagen- und Elastingehalts unter drei Behandlungsbedingungen. Mithilfe dieser Werte konnten wir Verbesserungen des Kollagen- und Elastingehalts messen und statistische Vergleiche anstellen. Die Abnahme des Kollagen- (–23 Prozent vs. unbehandelt) und Elastingehalts (–30 Prozent vs. unbehandelt) nach UV-Exposition war signifikant (Abbildung 2). Nach 6-tägiger Behandlung mit dem Testprodukt konnten die UV-exponierten Hautbiopsien Kollagen (plus 18 Prozent im Vergleich zur UV-Behandlung) und Elastin (plus 46 Prozent im Vergleich zur UV-Behandlung) zurückgewinnen. Obwohl die Organisation von Kollagen in histochemischen Bildern nicht klar ist (da das Kollagen in der Haut am häufigsten und am dichtesten gepackt ist), wird bei nativer (Abbildung 1A) und UV-geschädigter Haut eine charakteristische senkrechte Ausrichtung der Elastinfasern beobachtet, die in Richtung Epidermis verlaufen Behandlung mit Testprodukt (Abbildung 1C).

ELISA (Abbildung 3) vergleicht die Konzentrationen von Biomarkern, die durch Hautbiopsien ausgedrückt werden, die mit dem Testprodukt oder Placebo behandelt wurden (dem ein Cocktail aus Wirkstoffen fehlt, die für die Hautumgestaltung bekannt sind). Im Vergleich zum Placebo kam es zu einem zwei- bis dreifachen Anstieg des Elastin- und Kollagenspiegels, insbesondere des Typ-1-Prokollagens (Testprodukt vs. Placebo). Obwohl nicht signifikant, wurde auch ein merklicher Anstieg (P < 0,1) bei Hyaluronsäure und Tenascin-X beobachtet.

Das RCM konnte die Organisation von Kollagenfasern (Kollagenfibrillenbündel) in der Haut erfolgreich aufdecken (Abbildung 4). Aufgrund seiner konfokalen und optischen Viertelwellenplatteneigenschaften war die Technik in der Lage, Kollagen (starkes endogenes Kontrastmittel mit Doppelbrechung) erfolgreich von anderen Matrizen zu unterscheiden, ohne die Haut zu schneiden und zu färben. Das kurz fragmentierte Kollagen und seine zusammengeballte Anordnung (charakteristisch für beschädigtes und schlecht organisiertes Kollagen in gealterter/fotogealterter Haut) werden bei unbehandelter Hautbiopsie beobachtet. Nach 6-tägiger Behandlung mit dem Testprodukt sieht die Anordnung der Kollagenfasern in dieser Hautbiopsie einer 62-jährigen Frau (Spender Nr. 1) relativ organisierter aus als bei unbehandelten Kollagenfasern mit Längen von mehr als 100 µm parallel zueinander. Obwohl der Kontrast gering ist, können wir die Form und Größe der Fibroblasten beobachten (hervorgehoben durch Pfeile in Abbildung 4), große und ausgedehnte Fibroblasten mit regelmäßigen Formen in der behandelten Haut im Vergleich zu unbehandelter Haut. Von besonderem Interesse sind die hellen runden Zellen in Abbildung 4C. Dabei kann es sich um Mastzellen oder Entzündungszellen handeln. Es ist nicht klar, ob diese Entzündungszellen für normale Hautgesundheitszustände repräsentativ sind oder ob sie als Reaktion auf eine erhebliche Krafteinwirkung auf den Laserkopf gebildet wurden, um einen besseren Kontakt zwischen Laserkopf und Haut für qualitativ hochwertige Bilder des Kollagens zu erreichen Fasern.

Tabelle 2 zeigt den mittleren Fragmentierungsindex, der durch ConfoScan®-Analyse von sieben zufälligen Bildern behandelter und unbehandelter Haut ermittelt wurde. Der Kollagen-Mittelfragmentierungsindex der behandelten gegenüber der unbehandelten Gruppe betrug 0.032 bzw. 0,064. Eine Abnahme des Fragmentierungsindex weist auf eine Verbesserung der Kollagenorganisation hin.

Um einen tieferen Einblick in die Kollagenanordnung zu erhalten, wurden AFM-Bilder aufgenommen, um die Kollagenanordnung im Nanomaßstab zu visualisieren (Abbildung 5). Wir können einzelne Kollagenfibrillen (die sich zu einer Kollagenfaser bündeln) von Nanometerdicke sehen. Darüber hinaus können wir auch das charakteristische Querstreifenmuster von Kollagenfibrillen (D ∼ 68 nm) erkennen, das mit der Literatur übereinstimmt11 und bestätigt, dass AFM in der Lage war, Kollagen von anderen ECM-Fasern zu unterscheiden. Im Einklang mit RCM wurde unter AFM auch eine relativ parallele Organisation von Kollagenfibrillen bei behandelter und unbehandelter Haut beobachtet.

4. DISKUSSION

In dieser Forschung haben wir das Potenzial der Verwendung von drei bildgebenden Verfahren zur Visualisierung von Kollagenveränderungen in menschlichen Hautbiopsien untersucht, die mit einem kommerziellen Anti-Aging-Produkt behandelt wurden, das einige bahnbrechende synthetische Peptide enthält, von denen bekannt ist, dass sie den Kollagenumbau induzieren. Die histochemischen Bildgebungs- und RCM-Bildgebungstechniken wurden mit der Bildverarbeitung gekoppelt, um semiquantitative Informationen über den Kollagengehalt und die Fragmentierung als Index für die Bewertung der Kollagenverbesserung nach der Behandlung mit dem Anti-Aging-Produkt zu erhalten.

Interessanterweise zeigte unsere Studie eine sehr starke Korrelation zwischen histochemischer Bildgebung und ELISA und berichtete über einen signifikanten Anstieg der Kollagen- und Elastinspiegel nach der Behandlung mit dem Testprodukt. Pro-Kollagen vom Typ 1 ist der Marker für neu synthetisiertes Kollagen, und seine Überexpression durch Fibroblasten als Reaktion auf Matrixyl® (Sederma/Croda) ist ein gut charakterisierter Mechanismus für die Anti-Aging-Wirkung.23,24 Es gab auch einen signifikanten Anstieg bei der Expression von A-SMA, einem Marker, der nur bei Myofibroblasten vorkommt, bei denen es sich um speziell differenzierte Fibroblastenzellen handelt. Die Rolle von A-SMA bei der Fibroblasten-vermittelten ECM-Kontraktion und -Remodellierung ist gut verstanden,25 und es wird über eine direkte Korrelation zwischen der A-SMA-Expression und der Fibroblasten-Kontraktionsaktivität berichtet.26 Ein Anstieg der Hyaluronsäure, wenn auch nicht signifikant, könnte in erster Linie der Fall sein Dies wird auf das Vorhandensein von Hyaluronsäure als feuchtigkeitsspendendem Inhaltsstoff im Anti-Aging-Produkt zurückgeführt. TNSX ist ein neuartiges ECM-Protein, das zwischen oder an der Oberfläche von Kollagenfibrillen in der Hautdermis lokalisiert ist27 und es wird berichtet, dass TNSX eine dosisabhängige Kollagenfibrillogenese induziert,28,29 obwohl es Kontroversen darüber gibt, ob TNSX spezifisch an den Pro-Kollagen-Typ bindet 1 oder auch andere Kollagen- und ECM-Biomoleküle.28,29 Es wird über einen dosisabhängigen Anstieg von TNSX als Reaktion auf SKINectura™ (Lucas Meyer Cosmetics), einem Wirkstoff im Anti-Aging-Testprodukt, berichtet (Internationale Patentanmeldung Nr. PCT /IB2017/056370). Daher kann die Hypothese aufgestellt werden, dass Matrixyl® (Sederma/Croda) und SKINectura™ (Lucas Meyer Cosmetics) im Testprodukt zusammenarbeiten, um die Synthese und Ausrichtung von frisch synthetisiertem Kollagen, Prokollagen Typ 1, zu erleichtern. Eine deutliche Abnahme von Kollagen und Elastin nach der UV-Behandlung (Modell der durch Licht geschädigten Haut) und anschließender Reparatur nach der Behandlung mit einem Anti-Aging-Produkt (gleicht sich auf die natürliche, nicht der UV-Strahlung ausgesetzte Haut aus) zeigt die Fähigkeit der histochemischen Bildgebung (Polarisationsmikroskopie) und der Bildverarbeitungstechnik dazu Messen Sie kleine Änderungen im Inhalt von ECM-Komponenten (Abbildungen 1 und 2). Es wurden sorgfältige Anstrengungen unternommen, um die Kollagen- und Elastinorganisation (nach Immunfluoreszenzmarkierung) mithilfe des neu erworbenen Thunder Leica-Fluoreszenzbildgebungssystems abzubilden. Allerdings war die Auflösung nicht hoch genug, so dass keine verlässlichen Rückschlüsse auf die Organisation gezogen werden konnten. Die fluoreszenzbasierte CLSM-Bildgebung bietet eine höhere Auflösung als herkömmliche Weitfeld-Fluoreszenzbildgebung und ermöglicht eine klare Visualisierung der Kollagen- und Elastinorganisation. Die konventionelle Weitfeld-Fluoreszenzbildgebung ist durch die Dominanz der Sekundärfluoreszenz und die Dicke der Proben eingeschränkt, die für CLSM kein Problem darstellen.

Mit RCM konnten wir die Kollagenorganisation visualisieren (Abbildung 4). RCM ist eine bessere Wahl als CLSM, weil (1) RCM keine Markierung oder Färbung verwendet (im Gegensatz zu Fluoreszenz-CLSM, das eine Immunfluoreszenzmarkierung erfordert), wodurch jegliches Risiko einer Unsicherheit oder Unspezifität aufgrund von Markierungen ausgeschlossen ist, und (2) RCM weit verbreitet ist verwendete klinische dermale Bildgebungstechnik für Kollagen. Eine Verbesserung der Textur von Kollagenfasern, langen und dünnen Fasern nach der Behandlung mit einem Anti-Aging-Produkt (im Vergleich zu dichten und kurzen fragmentierten Kollagenfasern in unbehandelter Haut) weist auf die Wirkungsweise auf struktureller Ebene hin. Die RCM-Auflösung war hoch genug, um sogar Fibroblastenzellen, die Kollagensynthesefabrik der Haut, zu erfassen. Die um die Fibroblasten gewickelten Kollagenfasern könnten die neu synthetisierten Kollagenfasern sein, da sie einen dünneren Durchmesser haben als die umgebenden Kollagenfasern und ihre Bündel (Abbildung 4). Basierend auf der ConfoScan®-Analyse randomisierter RCM-Bilder können wir den Schluss ziehen, dass unbehandelte Haut im Vergleich zur behandelten Haut einen viel höheren Index an fragmentiertem Kollagen aufweist. Obwohl wir in RCM-Bildern die parallele Ausrichtung der Kollagenfasern nach der Behandlung mit dem Testprodukt sehen können, kann daraus keine Schlussfolgerung gezogen werden, es sei denn, das Isotropie-/Anisotropie-Verhältnis wird berechnet, was den Rahmen dieser Untersuchung sprengen würde. Die ultrahohe AFM-Auflösung im Nanomaßstab zeigt jedoch Hinweise auf eine Kollagenausrichtung auf der Ebene einzelner Fibrillen. Basierend auf der positiven Korrelation zwischen RCM- und AFM-Bildern zur parallelen Ausrichtung von Kollagenfasern (unbehandelt vs. behandelt) besteht eine starke Wahrscheinlichkeit, dass das Anti-Aging-Produkt die behauptete Eigenschaft der Kollagenreorganisation aufweist. Für zukünftige Forschungen sollte die Studie durchgeführt werden, um die gleiche Stelle (Kollagenfasern) im Laufe der Zeit (Längsschnittstudie) vor und nach der Behandlung mit dem Testprodukt zu überwachen, um zu untersuchen, ob es sich um die Ausrichtung des vorhandenen Kollagens oder der neu synthetisierten Kollagenfasern handelt mehr ausgerichtet. Eine solche Längsschnittstudie erfordert jedoch die Integration von RCM- und AFM-Instrumenten zur Live-Gewebebildgebung und Zeitrafferbildgebung zur Erfassung von Echtzeitänderungen bei der Kollagenumgestaltung.

5. SCHLUSSFOLGERUNGEN

Basierend auf unseren Forschungsergebnissen aus dieser Proof-of-Concept-Studie können wir den Schluss ziehen, dass AFM, RCM und histochemische Bildgebungstechniken in der Lage sind, Veränderungen in der Kollagenorganisation auf der Nano-, Mikro- bzw. Makroskala zu überwachen. AFM- und RCM-Bilder zeigen Hinweise auf eine Kollagenausrichtung im Nano- und Mikromaßstab nach der Behandlung mit dem Testprodukt. Die Analyse randomisierter RCM- und histochemischer Bilder mithilfe proprietärer Bildverarbeitungsansätze zeigt außerdem, dass die Haut nach der Behandlung mit dem Testprodukt im Vergleich zu unbehandelter Haut eine geringere Kollagenfragmentierung und eine höhere Kollagenverdichtung aufweist. Obwohl einige Anstrengungen in die Entwicklung und Validierung von Bildverarbeitungsalgorithmen 3,5,6,12–14,16,17 gesteckt wurden, ist weitere Forschung in dieser Richtung erforderlich, um datengesteuerte präklinische und klinische Forschungs- und Diagnoseentscheidungen zu treffen. Unser ganzheitlicher Ansatz, hochauflösende Bildgebungstechniken mit hohem Inhalt in Kombination mit leistungsstarken und robusten Bildverarbeitungsalgorithmen und -software anzuwenden, ist ein Schritt in diese Richtung.

Obwohl sich der Umfang dieser Forschung auf die Untersuchung der Kollagenorganisation als Reaktion auf ein Anti-Aging-Testprodukt bei einer Ex-vivo-Hautbiopsie beim Menschen beschränkte, haben diese bildgebenden Verfahren Auswirkungen auf die Überwachung und Quantifizierung der ECM-Remodellierung, die das Kennzeichen einer normalen Entwicklung ist. Wundheilung sowie ein Schlüsselmarker in der Pathophysiologie lebensbedrohlicher Erkrankungen wie Fibrose und Krebs, die durch unkontrollierte ECM-Remodellierung entstehen.2

INTERESSENSKONFLIKTE

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt als Beeinträchtigung der Unparteilichkeit der berichteten Forschung angesehen werden könnte.

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ZUSÄTZLICHE INFORMATIONEN

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