Humane amniotische mesenchymale Stammzellen lindern AGVHD nach Allo-HSCT, indem sie die Wechselwirkungen zwischen Darmmikrobiota und intestinaler Immunität regulieren

Abstrakt

Die akute Graft-versus-Host-Krankheit (aGVHD) nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation stellt eine der schwierigsten Herausforderungen dar. Eine Dysbiose der Darmmikrobiota kann bei aGVHD fortschreiten, und mesenchymale Stammzellen (MSCs) haben ein vielversprechendes therapeutisches Potenzial für aGVHD. Es bleibt jedoch unklar, ob hAMSCs die Darmmikrobiota während der aGVHD-Abschwächung beeinflussen. Dementsprechend haben wir versucht, die Wirkungen und zugrunde liegenden Mechanismen menschlicher Amnionmembran-abgeleiteter MSCs (hAMSCs) zu definieren, die die Darmmikrobiota und die Darmimmunität bei aGVHD regulieren. Durch die Etablierung humanisierter aGVHD-Mausmodelle und der Behandlung mit hAMSCs stellten wir fest, dass hAMSCs die aGVHD-Symptome deutlich linderten, das Immunungleichgewicht von T-Zell-Untergruppen und Zytokinen umkehrten und die Darmbarriere wiederherstellten. Darüber hinaus wurden die Vielfalt und Zusammensetzung der Darmmikrobiota durch die Behandlung mit hAMSCs verbessert. Die Korrelationsanalyse von Spearman zeigte, dass es eine Korrelation zwischen der Darmmikrobiota und Tight-Junction-Proteinen, sowie Immunzellen und Zytokinen gab. Unsere Forschung legte nahe, dass hAMSCs aGVHD linderten, indem sie die Normalisierung der Darmmikrobiota förderten und die Wechselwirkungen zwischen der Darmmikrobiota und der Darmbarriere, also der Immunität, regulierten.

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Schlüsselwörter

Akute Graft-versus-Host-Krankheit · Amnionische mesenchymale Stammzellen · Darmmikrobiota · Darmbarriere · Darmimmunität

Einführung

Der Hauptvorteil der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (allo-HSCT) ist die starke Antitumorreaktion aufgrund eines Graft-versus-Leukämie-Effekts (GVL), der durch die Erkennung von Peptiden ausgelöst wird, die sich aus Unterschieden in den genomischen Polymorphismen zwischen Patient und Patient ergeben Spender. Bei der akuten Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (aGVHD) geht es jedoch um die Entwicklung einer Schädigung des Empfängergewebes aufgrund des Angriffs der allo-reaktiven Spender-T-Zellen und stellt eine lebensbedrohliche Hauptkomplikation bei der alloHSCT dar [1, 2]. Es wurde berichtet, dass die mikrobielle Störung des Darms Entzündungsreaktionen auslöst und mit entzündungsbedingten Erkrankungen korreliert [3, 4]. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Störungen in der Darmmikrobiota ein wesentlicher Faktor für die Auslösung von aGVHD nach allo-HSCT sind und ein neues Behandlungsziel darstellen [5, 6]. Insbesondere ist die Darmmikrobiota-Dysbiose bei aGVHD in der Regel durch den Verlust der Darmbakterienvielfalt und das Wachstum opportunistischer Krankheitserreger gekennzeichnet [6]. Bei gastrointestinaler GVHD initiiert die beeinträchtigte Schleimhautbarriere die Aktivierung von Antigen-präsentierenden Wirtszellen und Spender-T-Zellen, was in der T-Zell-Differenzierung entlang der pathogenen Typ-1- und Typ-17-Paradigmen auf Kosten tolerogener regulatorischer T-Zellen gipfelt. Zellmuster [7]. Vor allem auf der Grundlage der 16S-ribosomalen RNA (16S-rRNA)-Sequenzierung wurde darauf hingewiesen, dass mehrere Arten von Darmmikrobiota mit GVHD in Verbindung gebracht wurden und dass beispielsweise Butyrat-produzierende Clostridien mit der Aufrechterhaltung der epithelialen Barrierefunktion und der Abschwächung einer akuten GVHD verbunden sind [8]. ]. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) haben im letzten Jahrzehnt aufgrund ihrer Selbsterneuerungs- und Multilinien-Differenzierungspotentiale sowie ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften große Aufmerksamkeit erlangt [9]. Man geht davon aus, dass MSCs geschädigtes Gewebe bei Vorliegen einer starken Entzündung aus einem ausgewogenen entzündlichen und regenerativen Mikromilieu befreien und werden häufig zur Behandlung immunbasierter Erkrankungen eingesetzt, wobei die erfolgreichste klinische Anwendung die GVHD-Behandlung darstellt [10]. Humane amniotische mesenchymale Stammzellen (hAMSCs) sind perinatale Stammzellen, die eine embryonale stammzellähnliche Differenzierungsfähigkeit und adulte stammzellähnliche immunmodulatorische Eigenschaften besitzen. Da sie ähnliche Phänotypen wie typische MSCs aufweisen, sind hAMSCs aufgrund der einfachen, nichtinvasiven und sicheren Gewebegewinnung, der hohen Zellausbeute und der im Vergleich zu Stammzellen aus anderen Quellen sehr geringen ethischen und moralischen Streitigkeiten zu einer vielversprechenden Quelle für Stammzellen geworden. Humane AMSCs haben den Vorteil einer geringen Immunogenität und keiner Tumorgenität, was sie zur idealen Zellquelle für die Zelltherapie macht [11, 12]. In-vitro-Experimente haben bestätigt, dass hAMSCs eine höhere Proliferationskapazität und eine größere langfristige Wachstumsfähigkeit aufwiesen als aus Knochenmark stammende MSCs [13, 14]. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass hAMSCs das Potenzial haben, viele entzündliche Erkrankungen zu lindern, darunter entzündliche Darmerkrankungen, Arthrose und Autoimmunerkrankungen [11]. Unsere aktuelle Studie hat gezeigt, dass hAMSCs die aGVHD verbesserten, indem sie das Gleichgewicht von T-Effektor- und Treg-Zellen regulierten [15]. Die Wirkung und der Mechanismus von hAMSCs auf die mikrobielle Darmstörung bei GVHD sind jedoch unbekannt. Hier wollen wir die möglichen Auswirkungen von hAMSCs auf aGVHD sowie das Darmmikroökosystem untersuchen. Es wäre die erste Studie, die die Darmmikrobiota und ihren Zusammenhang mit der Darmimmunität nach der Behandlung von aGVHD mit hAMSCs aufdeckt.

Materialen und Methoden

Isolierung, Kultur und Identifizierung von hAMSCs

Die hAMSCs wurden wie zuvor beschrieben extrahiert [15]. Zellen der dritten Passage (P3) wurden aus der Phänotypidentifizierung durch Anfärben mit Antikörpern gegen CD34 (581, BD Pharmingen, USA), CD45 (HI30, BD Pharmingen, USA), HLA-DR (G46-6, BD Pharmingen) geerntet , USA), CD11b (ICRF44, BD Pharmingen, USA), CD90 (5E10, BD Pharmingen, USA), CD73 (AD2, BD Pharmingen, USA) und CD105 (SN6, Bioscience, USA) und dann mit einem Durchflusszytometer analysiert ( BD FACS Canto II). Die Zellen wurden unter Verwendung eines spezifischen Induktionsmediums (BGscience, China) auf ihre Multiliniendifferenzierung überprüft und mit Oil Red-O und Alizarin Red auf Adipogenese bzw. osteogene Differenzierung gefärbt. Für die Experimente wurden hAMSCs in den Passagen 3 bis 6 verwendet.

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Sammlung menschlicher PBMCs

Plasmaproben wurden von gesunden Freiwilligen mit schriftlicher Einverständniserklärung entnommen. Menschliche mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) wurden durch Ficoll-Hypaque-Dichtezentrifugation (Tianjin Haoyang, China) aus peripherem Blut isoliert, mit PBS gewaschen und 15 Minuten lang bei 4 Grad in Lysepuffer für rotes Blut (Solarbio, China) suspendiert. Nochmals waschen und dann in PBS zur Schwanzveneninjektion in NPG-Mäuse suspendieren.

Mäuse

8–10 Wochen alte und 25–30 g schwere männliche und weibliche NPG-Mäuse wurden von Beijing Vitalstar Biotechnology Co., Ltd. gekauft und unter SPF-Bedingungen in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit aufgezogen. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (Nr. L2019132) der Southern Medical University gemäß den Richtlinien des National Health and Medical Research Council of China für Tierversuche genehmigt.

Akutes GVHD-Tiermodell und Behandlung

Das aGVHD-Mausmodell wurde wie zuvor beschrieben etabliert [15]. Zur Behandlung wurden jeder Maus am dritten Tag nach der Transplantation 5 × 105 hAMSCs pro Maus (hier hAMSCs-Gruppe) und PBS (hier aGVHD-Gruppe) über die Schwanzvene injiziert. In allen Mausmodellen wurden die Mäuse alle zwei Tage auf Morbidität und Gewichtsveränderungen untersucht. Jede Maus wurde auf pathologische Merkmale wie Gewichtsverlust, gebeugte Haltung, zerzaustes Fell, Hautläsionen, eingeschränkte Beweglichkeit und Durchfall hin bewertet und dann nach dem klinischen Bewertungssystem aGVHD bewertet, das an das ursprünglich von Cooke beschriebene System angelehnt war [16]. In einigen Fällen litten Mäuse in der aGVHD-Gruppe an schwerer aGVHD, und die Mäuse in der hAMSCs-Gruppe wurden am dritten Tag nach der Behandlung getötet, um peripheres Blut und Zielorgane, einschließlich Leber, Milz, Lunge und Darm, zu entnehmen. Der Kot dieser Mäuse wurde vor der Tötung gesammelt.

GFP-markierte hAMSCs und In-vivo-Tracing

GFP-markierte hAMSCs wurden wie zuvor beschrieben etabliert und identifiziert [15]. Kurz gesagt, wir haben das Gen des grünen Fluoreszenzproteins (GFP) mit Lentivirus als Vektor in hAMSCs transfiziert. 5 × 105 GFP-markierte hAMSCs, suspendiert in 500 μl PBS, wurden über die Schwanzvene in aGVHD-Mäuse injiziert. Nach 24 und 72 Stunden wurden die Mäuse eingeschläfert, um den Darm zu entnehmen und anschließend Gefrierschnitte zu erzeugen. Zur Unterscheidung der Empfängerzellen wurde eine DAPI-Gegenfärbung verwendet.

Histopathologische Untersuchung

Die aGVHD-Zielorgane wurden zum Zeitpunkt der Autopsie gesammelt und dann zu in Paraffin eingebetteten Blöcken verarbeitet, um 5-μm dicke Schnitte für die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) zu erzeugen. Die histologischen Ergebnisse wurden anhand der Zerstörung der Gewebestruktur und der Lymphozyteninfiltration bewertet [17]. Für die Immunhistochemie wurden die Schnitte entparaffiniert, rehydriert und 20 Minuten lang mit 3 % H2O2 in Methanol behandelt, um die endogene Peroxidaseaktivität zu inaktivieren. Anschließend wurden die Schnitte einer Antigengewinnung unterzogen und eine Stunde lang mit Serumalbumin behandelt. Anschließend wurden die Schnitte mit Kaninchen-Anti-Human-CD45-Antikörpern (EP322Y, Abcam, England) oder ZO-1-Antikörpern ((EPR19945-296, Abcam, England) 1 Stunde lang bei 37 Grad inkubiert. Die gebundene Antikörper wurden mit HRP-konjugiertem Sekundärantikörper (Genentech, USA) nachgewiesen und mit DAB sichtbar gemacht. Der positive Bereich wurde mit Image J analysiert.

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16S-rRNA-Sequenzierung fäkaler Mikrobiota

Fäkale genomische DNA wurde aus 0,1 g gefrorenen Stuhlproben unter Verwendung eines EZNA®-Stuhl-DNA-Kits (Omega BioTek, Norcross, GA, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Unter Verwendung genomischer DNA als Matrize wurden zur Amplifikation spezifische Primer (338F: 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′ und 806R: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) mit Barcodes und PremixTaq (TaKaRa, China) verwendet die hypervariablen V3-V4-Regionen des bakteriellen 16S-rRNA-Gens. Nach der Amplifikation und Reinigung wurde das gesamte Genom der Probe auf der Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattform Illumina Hiseq oder Miseq von Magigene Technology Co., Ltd. (Guangzhou, China) sequenziert, um Rohdaten im FASTQ-Format zu erhalten. Sequenzdatenanalysen wurden hauptsächlich mit der Magichand-Plattform durchgeführt.

Durchflusszytometrische Analyse

Die aGVHD-Zielorgane und das periphere Blut von Mäusen wurden gewonnen und zu einer Einzelzellsuspension verarbeitet. Die Zellen wurden mit monoklonalen Antikörpern gegen CD3 (UCHT1, Biolegend, USA), CD4 (RPA-T4, Invitrogen, USA), CD8 (RPA-T8, Biolegend, USA), CD25 (BC96, Biolegend, USA) oder isotypangepasst gefärbt Kontroll-IgG (eBioscience, USA) für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Anschließend wurden die Zellen mit Lysepuffer (BD Pharm Lyse™) bei 4 Grad im Dunkeln 15 Minuten lang verarbeitet. Die intrazelluläre Foxp3-Färbung (236A/E7, Invitrogen, USA) wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt (Fixation/Permeabilization Solution Kit; eBioscience). Anschließend wurden polychromatische durchflusszytometrische Analysen mit einem Durchflusszytometer durchgeführt.

Quantifizierung von Zytokinen

Die Zytokinspiegel im Serum und Gewebeüberstand von Mäusen wurden unter Verwendung des Cytmetric Bead Array (CBA) Human Th1/Th2/Th17-Zytokin-Kits (BD Pharmingen, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Kurz gesagt, 50 μl jeder der Überstandsproben wurden mit 50 μl der gemischten humanen Th1/Th2/Th17-Zytokin-Einfangkügelchen und 50 μl des humanen Th1/Th2/Th17-PE-Nachweisreagenzes bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert und dann suspendiert für die Durchflusszytometrieanalyse 3 Stunden später.

Quantitative Echtzeit-PCR

Die Gesamt-RNA wurde nach Isolierung mit Trizol-Reagenz (TaKaRa, China) aus dem Dickdarmgewebe der Maus extrahiert. Gesamt-RNA wurde als Matrize für die Umkehrtranskription von cDNA verwendet. -actin wurde als interne Referenz verwendet. Die mRNA-Expression wurde durch qPCR unter Verwendung der folgenden Primer gemessen: ZO-1-F, 5'-ACCACCAACCCGAGAAGAC-3' und ZO- 1-R, 5'-CAGGAGTCATGGACGCACA-3 '; Occludin-F, 5'-TTGAAAGTCCACCTCCTTACAGA-3' und OccludinR, 5'-CCGGATAAAAAGAGTACGCTGG-3'; -actin-F, 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3' und -actin-R, 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'. Zur Messung der RNA-Expressionsniveaus wurde die 2-ct-Methode verwendet.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Die D-LA- und DAO-Spiegel im Plasma wurden mit ELISA-Kits (Jingmei, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Kurz gesagt, die gesammelten Plasmaüberstände wurden jeweils in mit 96-Well-spezifischen Antikörpern beschichtete Platten gegeben. Die Absorption wurde bei 450 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (Multiskan MK3, Thermo Fisher Scientific) aufgezeichnet.

Statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Der T-Test unabhängiger Stichproben wurde mit GraphPad Prism8 durchgeführt und visualisiert.0. 16S-rRNA-Sequenzierungsdatenanalysen wurden mit der Magichand-Plattform durchgeführt (http://cloud.magigenecom/). Die Korrelationsanalyse zwischen Darmmikrobiota und Immunität wurde von R-Paketen (v3.6.3) durchgeführt, um eine Korrelationsmatrix anzuzeigen. P-Werte<0.05 were considered statistically significant. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001, n.s. not signifcant.

Ergebnisse

Identifizierung von hAMSCs

Die hAMSCs zeigten in Kultur eine Polygon- oder Fibroblasten-ähnliche Morphologie (Abb. 1A) und waren stark positiv für die Oberflächenexpression der MSC-spezifischen Marker CD90, CD105 und CD73, aber negativ für CD34, CD45, HLA-DR und CD11b (Abb . 1C). Was die Differenzierung mehrerer Abstammungslinien betrifft, zeigten unsere Ergebnisse, dass hAMSCs eine adipozytische und osteoblastische Differenzierung zeigten (Abb. 1B).

hAMSCs linderten die aGVHD-Symptome bei Mäusen deutlich

Wir haben zunächst die therapeutische Wirkung von hAMSCs auf aGVHD untersucht. Im Vergleich zur aGVHD-Gruppe verbesserten hAMSCs die aGVHD signifikant, was durch den deutlich verringerten Gewichtsverlust (Abb. 2B) und den verringerten klinischen aGVHD-Score (Abb. 2C) belegt wird. Darüber hinaus hatte die hAMSC-Gruppe im Vergleich zu aGVHD-Mäusen eine signifikant höhere Überlebensrate (Abb. 2D). Die pathologische Histologieanalyse zeigte, dass aGVHD schwere Gewebeschäden und eine Leukozyteninfiltration verursachte. hAMSCs schwächten, wie H&E zeigte, die Gewebeschädigung und die Infiltration exogener T-Zellen in aGVHD-Zielorganen ab (Abb. 2E). Die Ergebnisse der IHC bestätigten übereinstimmend auch, dass hAMSCs abnormale pathologische Manifestationen verbesserten (Abb. 2F). Diese Ergebnisse legen nahe, dass hAMSCs das Potenzial haben, aGVHD-Symptome bei aGVHD-Mäusen zu lindern.

hAMSCs beeinflussten die Wirtsimmunität bei aGVHD-Mäusen

Um die zugrunde liegenden immunmodulatorischen Mechanismen zu verstehen, durch die hAMSCs aGVHD reduzieren, haben wir die Aktivierung und Expansion von T-Zellen im peripheren Blut und in Zielorganen gemessen. Ein Durchflusszytometrietest ergab, dass hAMSCs die Anzahl der CD3+CD4+T- und CD3+CD8+T-Zellen im Blut und in den Zielorganen deutlich hemmten (Abb. 3A, B). Darüber hinaus war der Anteil von CD4+CD25+Foxp3+Tregs im Blut und in den Zielorganen von Mäusen in der hAMSCs-Gruppe deutlich höher als in der aGVHD-Gruppe (Abb. 3C). . Als nächstes untersuchten wir die Wirkung von hAMSCs auf das Zytokinprofil (Abb. 4). Die Verabreichung von hAMSCs führte zu einem deutlichen Rückgang der IL-17A-, IFN-, TNF-, IL-6- und IL{13}}-Spiegel in den Zielorganen und im Blut im Vergleich zu denen der aGVHD-Gruppe. mit Ausnahme des TNF-Spiegels in der Milz. In der Zwischenzeit zeigten hAMSCs-behandelte Mäuse zusätzlich zu den IL-10-Spiegeln in der Leber deutlich erhöhte IL-10- und IL-4-Spiegel in den Zielorganen und im Blut. Zusammengenommen spielten hAMSCs eine schützende Rolle bei aGVHD, indem sie das Immunungleichgewicht von T-Zell-Untergruppen und den Zytokinsturm umkehrten.

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hAMSCs verbesserten die Schädigung der Darmbarriere bei aGVHD-Mäusen

Um zu untersuchen, ob hAMSCs die Darmbarriere bei aGVHD reparieren können, haben wir zunächst beobachtet, ob hAMSCs in den Darm wandern können. Wie in Abb. 5A gezeigt, wurden GFP-markierte hAMSCs nach der Injektion in hAMSCs im Darm nachgewiesen und konnten sich im Darm ansiedeln und infiltrieren. Anschließend entwickelten wir eine histopathologische Untersuchung des Dünndarmgewebes. In der aGVHD-Gruppe war der Darm erodiert und nekrotisch, die Darmzotten waren offensichtlich zerstört, die Zotten waren gebrochen und massive Leukozyten infiltrierten die Darmschleimhaut, Submukosa und Lamina propria. Die Darmzotten waren regelmäßig angeordnet, und nach der Behandlung mit hAMSCs kam es zu keinem Darmzottenbruch oder einer Ablösung des Zottenepithels (Abb. 5B). Die Infiltration menschlicher Lymphozyten wurde auch durch Immunhistochemie im Darm der aGVHD-Gruppe beobachtet, wohingegen die Behandlung mit hAMSCs ihre Infiltration verringern konnte (Abb. 5C). Um die schützende Wirkung von hAMSCs auf die Integrität der Darmschleimhaut zu beurteilen, führten wir eine Immunhistochemie durch, um die Wirkung auf ZO-1 festzustellen. In der hAMSCs-Behandlungsgruppe war das Expressionsniveau des Tight Junction-Proteins ZO-1 im Vergleich zur aGVHD-Gruppe signifikant erhöht (Abb. 5D). Wir untersuchten auch die mRNA-Expressionsniveaus von intestinalen Tight-Junction-Proteinen (TJs) und die Plasmaniveaus von D-Milchsäure (D-LA) und Diaminoxidase (DAO), um die Funktion der Darmbarriere und die Darmpermeabilität zu bestimmen. Bei intravenöser Verabreichung könnten hMASCs die mRNA-Expressionsniveaus von ZO-1 und Occludin, den Schlüsselproteinen von TJs, deutlich erhöhen (Abb. 5E, F), während sie gleichzeitig die Niveaus von D-LA und DAO senken (Abb. 5G, H). Wenn also aGVHD auftrat, wurde die Darmbarriere geschädigt, wodurch die Tight-Junction-Proteine ​​im Darm reduziert wurden und die Darmpermeabilität zunahm. Unterdessen könnten hAMCSs die Störung der Darmbarriere deutlich umkehren.

Abb. 1 Phänotypische und funktionelle Charakterisierung von hAMSCs. (A) Repräsentative mikroskopische Aufnahmen von hAMSCs von Durchgang 0 bis 3 (keine Färbung, 100×). (B) Multilinien-Differenzierungsfähigkeit von hAM-SCs. Die adipogene Differenzierung von hAMSCs (links) wurde mit Oil Red-O gefärbt, und die osteoblastische Differenzierung von hAMSCs (rechts) wurde mit Alizarin Red gefärbt (Färbung, 100×). (C) Durchflusszytometrische Analyse, die darauf hinweist, dass hAMSCs positiv für CD90, CD105 und CD73 und negativ für CD34, CD45, CD11b und HLA-DR sind

Abb. 2 hAMSCs linderten aGVHD bei NPG-Mäusen. (A) Ein schematisches Diagramm, das den Verabreichungsplan von hAMSCs in aGVHD-Mausmodellen veranschaulicht. (B) Veränderungen des Körpergewichts in verschiedenen Gruppen (n=10). (C) klinischer aGVHD-Score (basierend auf Gewichtsverlust, gebeugter Haltung, struppigem Fell, Hautläsionen, eingeschränkter Mobilität und Durchfall) in verschiedenen Gruppen (n=10). (D) Überleben zwischen verschiedenen Gruppen (n=10). (E) Repräsentative mikroskopische Bilder der H&E-Färbung (400-fach) und Histologie-Score (basierend auf der Zerstörung der Gewebestruktur und der Lymphozyteninfltration) (n=4). (F) Repräsentative mikroskopische Bilder der Immunhistochemie (400×) und der Anteil der CD45-positiven Fläche (n=4). Die Werte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt

Abb. 3 hAMSCs hemmten die Expansion von Spender-T-Zellen und steigerten gleichzeitig die Treg-Erzeugung oder -Expansion in vivo. (A) Durchflusszytometrie-Analyse von CD3+CD4+T-Zellen(n=6), (B) Durchflusszytometrie-Analyse von CD3+CD8+ T-Zellen (n=6), (C) Durchflusszytometrie-Analyse von CD4+CD25+Foxp3+Tregs (n=6). Die Werte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt

Abb. 4 hAMSCs regulierten die proinflammatorischen Zytokine IL-17A, IFN-, TNF, IL-6, IL-2 herunter und regulierten die entzündungshemmenden Zytokine IL-10 und IL hoch -4 in vivo (n=5). Die Werte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt

Veränderungen der Darmmikrobiota nach hAMSC-Behandlung bei aGVHD-Mäusen

Die 16S-rRNA-Sequenzierung wurde in fäkaler Bakterien-DNA durchgeführt, die aus verschiedenen Gruppen von Mäusen isoliert wurde. Die Diversitätsindizes, einschließlich der OUT-, Chao1- und Shannon-Indizes, zeigten ähnliche Tendenzen, und Mäuse, die mit hAMSCs behandelt wurden, wiesen eine Mikrobiota mit deutlich höherer Diversität im Vergleich zu der der aGVHD-Gruppe auf (Abb. 6A). Die Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) basierend auf der Un-gewichteten Unifrac-Distanz, der Manhattan-Distanz und der metrischen Bray-Curtis-Distanz ergab verteilte Datenpunkte auf den Diagrammen der beiden Gruppen, obwohl der Unterschied nicht signifikant war (Abb. 6B). Anschließend untersuchten wir die Landschaft der Darmmikrobiota, um den möglichen Unterschied in der Zusammensetzung zwischen den beiden Gruppen weiter zu untersuchen. Insgesamt wurden 773 OTUs berechnet, und die hAMSCs-Gruppe wies im Vergleich zur aGVHD-Gruppe höhere OTUs auf (Abb. 6C). In Bezug auf die Bakterienzusammensetzung auf Stammebene waren Firmicutes und Bacteroidetes die beiden vorherrschenden Stämme (Abb. 6D). Wir haben auch eine Vergleichs-Heatmap für die Analyse der Darmmikrobiota zwischen den beiden Gruppen erstellt (Abb. 6E). Die Gattungen Odoribacter und Ruminococcus_1 zeigten eine relativ hohe Häufigkeit in der Gruppe der hAMSCs, bei denen es sich um wichtige Mikroben zur Aufrechterhaltung der Darmhomöostase handelt (Abb. 6F, G). Um zu bestätigen, welches Bakterium durch die Behandlung mit hAMSCs verändert wurde und sich wiederum auf das Fortschreiten der Krankheit gegenüber aGVHD auswirkte, führten wir hochdimensionale Klassenvergleiche mithilfe der linearen Diskriminanzanalyse (LDA) der Effektgröße (LEfSe) durch, die deutliche Unterschiede in der Dominanz der Bakteriengemeinschaften zwischen ihnen feststellte die beiden Gruppen. Wie in (Abb. 6H, I) gezeigt, waren Streptococcaceae (die Familie und Gattung Streptococcus), Paludibacteraceae, F0058 und Delftia die wichtigsten Bakterientypen, die zur Dysbiose der Darmmikrobiota in der aGVHD-Gruppe beitrugen. Dennoch zeigten die nützlichen Bakterien Lachnospiraceae, Roseburia, Ruminococcaceae, Ruminiclostridium, Oscillibacter und Clostridia (die Klasse und Ordnung Clostridiales) eine relative Anreicherung in der hAMSC-Gruppe, die möglicherweise mit der durch hAMSCs vermittelten Linderung von aGVHD verbunden ist. Insgesamt verbesserten sich die Diversität und Zusammensetzung der Darmmikrobiota nach der Verabreichung von hAMSCs und führten zu einem allgemeinen Trend, der dem Körper zugute kam.

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hAMSCs regulierten die Wechselwirkungen zwischen Darmmikrobiota und intestinaler Immunität

Um den möglichen Zusammenhang zwischen der Darmmikrobiota und der Darmschleimhautbarriere zu verstehen, wurden die Korrelationen zwischen den TJs und der Darmmikrobiota auf Gattungsebene durch Spearmans Korrelationsanalyse analysiert. Wie in Abb. 7 gezeigt, bestand eine positive Beziehung zwischen ZO-1 und den nützlichen Bakterien Ruminococcaceae_UCG.014, Muribaculum, Ruminococcus_1 und Ruminiclostridium_9. Die relative Häufigkeit der nützlichen Bakterien Roseburia, Odoribacter, Ruminococcus_1 und Ruminococcaceae_UCG.014 zeigte dramatisch positive Korrelationen mit Occludin. Als nächstes führten wir eine Korrelationsanalyse zwischen Darmmikrobiota und intestinaler Immunbarriere mithilfe der Rangkorrelationsmethode nach Spearman durch (Abb. 7). Wir beobachteten, dass der Anstieg von Roseburia, Muribaculum und Ruminococcus _1 negativ mit dem Prozentsatz der CD3 +CD4+T-Zellen korrelierte. Darüber hinaus korrelierte der Anstieg der nützlichen Bakterien Ruminococcus_1 und Ruminiclostridium _9 positiv mit dem Prozentsatz der Tregs, während er negativ mit IL-17 korrelierte. Die Häufigkeit von Lactobacillus und Candidatus_Arthromitus korrelierte negativ mit IFN-. Es gab eine negative Korrelation zwischen der Häufigkeit von Muribaculum und IL-2. Die Zunahme der Häufigkeit von Candidatus_Saccharimonas und die Abnahme von Escherichia. Die Shigella-Häufigkeit korrelierte positiv mit dem IL-10-Spiegel (Abb. 7). Die Ergebnisse der Korrelationsanalyse zeigten, dass hAMSCs das Entzündungsumfeld des Wirts verbesserten und die Darmhomöostase regulierten, was möglicherweise mit der Modulation der Darmmikrobiota verbunden ist, und folglich aGVHD verhinderten.

Abb. 5 hAMSCs verbesserten die Funktionsstörung der Darmbarriere bei aGVHD-Mäusen. (A) GFP-markierte hAMSCs, die in den Darm infiltriert wurden. (B) Repräsentative mikroskopische Bilder der H&E-Färbung des Darms (400×) und Histologie-Score (basierend auf der Zerstörung der Gewebestruktur und der Lymphozyteninfiltration) (n=4). (C) Repräsentative mikroskopische Bilder der Immunhistochemie (400×) des Darms und des Anteils der CD45-positiven Fläche (n=4). (D) Repräsentative mikroskopische Bilder der Immunhistochemie (400×) des Darms und der Anteil des ZO-1-positiven Bereichs (n=4). (E) mRNA-Expressionsniveaus von ZO-1 und Occludin (n=3). (F) Plasmaspiegel von D-LA und DAO (n=4).Die Werte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt

Diskussion

Fortschrittliche mikrobielle Analysen haben neue Erkenntnisse über die komplexen Wechselwirkungen zwischen Wirt und Darmmikrobiota geliefert [18]. Die Darmmikrobiota könnte nach allo-HSCT verändert sein und steht in engem Zusammenhang mit aGVHD, was darauf hindeutet, dass Darmmikrobiota ein neues Ziel für die aGVHD-Behandlung sein könnte [5]. Zahlreiche Studien, einschließlich unserer jüngsten Studie, haben die therapeutische Wirkung von MSCs auf aGVHD untersucht und bestätigt [15, 19, 20]. Die Auswirkungen auf die Darmmikrobiota während dieses Zeitraums bleiben jedoch unklar. In dieser Studie untersuchten wir den Einfluss von hAMSCs auf aGVHD und die möglichen Mechanismen darin in vivo. In Übereinstimmung mit früheren Studien (15, 21–23) zeigten unsere Ergebnisse, dass hAMSCs eine günstige Schutzwirkung auf aGVHD bei Mäusen haben, was sich in abgeschwächten aGVHD-Symptomen und einem verlängerten Überleben zeigt. Wir haben auch gezeigt, dass hAMSCs eine immunsuppressive Wirkung zeigten, indem sie die Expansion von Spender-T-Zellen reduzierten und gleichzeitig die Tregs-Erzeugung bei aGVHD steigerten. Unterdessen könnten hAMSCs in vivo entzündungsfördernde Zytokine herunterregulieren und entzündungshemmende Zytokine hochregulieren, um so Entzündungsreaktionen zu hemmen. Die Darmbarriere, eine dichte Struktur, die aus einer Monoschicht von Darmepithelzellen besteht, behält ihre Integrität bei und verhindert die Translokation luminaler Mikrobiota in einem gesunden Zustand [24]. Während der allo-HSCT schädigen Konditionierungsregime die Darmbarriere, was der erste Schritt bei der Entwicklung von aGVHD ist, da sie die Translokation von Bakterien über die Barriere hinweg ermöglicht und zu einer Störung der intestinalen Immunhomöostase führt [24, 25]. Immer mehr Beweise belegen, dass MSCs die Fähigkeit zur Gewebereparatur besitzen, was nachweislich die Integrität der Darmbarriere bei Colitis-Mäusen wiederherstellt [26]. Tight-Junction-Proteine, darunter ZO-1 und Occludin, spielen eine wesentliche Rolle bei der Funktion der Darmbarriere, und die Verlagerung der Darmmikrobiota über die beeinträchtigte Darmbarriere führt zu Entzündungen [27]. D-LA wird aus Darmbakterien gewonnen und DAO konzentriert sich hauptsächlich in der Darmschleimhaut. Daher könnten hohe Konzentrationen von Plasma-D-LA und -DAO teilweise Veränderungen der Darmpermeabilität und der Darmbarrierefunktion widerspiegeln [28]. Derzeit haben wir festgestellt, dass die Expressionsniveaus von TJs nach der Verabreichung von hAMSCs dramatisch anstiegen, wohingegen die Plasmaspiegel von D-LA und DAO signifikant abnahmen, was darauf hindeutet, dass hAMSCs die Funktionsstörung der Darmbarriere verbessern und die Darmpermeabilität wiederherstellen könnten. Der Darm ist eines der Organe, die am stärksten von aGVHD betroffen sind, und Untersuchungen haben gezeigt, dass Bakterien, insbesondere die Darmmikrobiota, eine zentrale Rolle bei der Pathogenese und Entwicklung von aGVHD spielen [5, 6]. Wie in früheren Studien berichtet, war der Verlust der Bakterienvielfalt bei Allo-HSCT-Patienten mit einer erhöhten Mortalität aufgrund von aGVHD verbunden (29, 30). Die fäkale Dominanz der opportunistischen Krankheitserreger Enterococcus und Proteobacteria wurde ebenfalls mit einer erhöhten GVHD in Verbindung gebracht [6, 31]. In den letzten Jahrzehnten wurde der Korrelation zwischen der Darmmikrobiota und der Behandlung von MSCs bei Entzündungskrankheiten zunehmend Aufmerksamkeit geschenkt. Es wurde nachgewiesen, dass MSCs die Darmmikrobiota-Dysbiose bei rheumatoider Arthritis, Sepsis und entzündlichen Darmerkrankungen lindern [32–34]. Um den Mechanismus, durch den hAMSCs aGVHD lindern, weiter zu untersuchen, untersuchten wir den Einfluss von hAMSCs auf die Darmmikrobiota. In der aktuellen Studie zeigte die Verabreichung von hAMSCs im Vergleich zu keiner Transplantation einen erheblichen Einfluss auf die Vielfalt der mikrobiellen Gemeinschaften, was darauf hindeutet, dass sich die Häufigkeit der Darmmikrobiota nach der Behandlung mit hAMSCs verändern könnte. Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied bei den Diversitätsmessungen, möglicherweise aufgrund der geringen Stichprobengröße beider Gruppen oder des unzureichenden Behandlungszyklus der hAMSCs. Die Analyse unter Verwendung einer Vergleichs-Heatmap in den Gattungswerten zeigte, dass die Verabreichung von hAMSCs die Häufigkeit nützlicher Bakterien, Odoribacter und Ruminococcus_1, in der Darmflora erhöhte, die kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) mit entzündungshemmenden Eigenschaften produzieren [35]. , 36]. Um die zugrunde liegenden dominanten Bakterien zu identifizieren, die durch die hAMSC-Transplantation vermittelt werden, wurde eine LEfSe-Analyse zwischen den beiden Gruppen durchgeführt. Im Vergleich zur aGVHD-Gruppe erhöhte die Behandlung mit hAMSCs die Häufigkeit einiger nützlicher Mikroben im Zusammenhang mit entzündungshemmenden Wirkungen erheblich, wie Lachnospiraceae, Roseburia, Ruminococcaceae, Ruminiclostridium, Oscillibacter und Clostridia, von denen alle beschrieben wurden, dass sie sich positiv auf die Produktion von SCFA-Metaboliten im Darm auswirken [ 37–42]. Daher deuten unsere Beobachtungen darauf hin, dass nach der hAMSC-Verabreichung die Dysbiose der Darmmikrobiota gebessert wurde, was sich in der verbesserten Diversität und der erhöhten relativen Häufigkeit nützlicher Bakterien äußert.

Abb. 6 Veränderungen der Darmmikrobiota bei aGVHD-Mäusen. (A) Vergleich der Vielfalt. (B) Vergleich der Vielfalt. (C) Venn-Diagramm von OTUs. (D) Relative Bakterienhäufigkeit auf Stammebene. (E) Heatmap der Artenhäufigkeit auf Gattungsebene. (F) Relative Häufigkeit von Odoribacter auf Gattungsebene. (G) Relative Häufigkeit von Ruminococcus_1 auf Gattungsebene. (H) Cladogramm basierend auf LEfSe-Analyse. (I) LDA-Score, berechnet aus Merkmalen, die zwischen aGVHD- und hAMSCs-Gruppen unterschiedlich häufig vorkommen. (AI) n=3 Mäuse pro Gruppe. Die Werte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt

aGVHD ist ein komplizierter Entzündungsprozess, der durch die Zerstörung der Integrität der Darmbarriere und die anschließende Translokation der Darmmikrobiota und ihrer Bestandteile ausgelöst wird. Die Erkennung schadensassoziierter molekularer Muster und pathogenassoziierter molekularer Muster durch Antigen-präsentierende Zellen induziert eine proinflammatorische Reaktion, einschließlich der Aktivierung von T-Zellen und eines Zytokinsturms, um Schäden an der Darmbarriere zu verschlimmern und die Entwicklung von aGVHD zu fördern [24, 43]. Andererseits spielen die Darmmikrobiota und von Mikrobiota abgeleitete Metaboliten wie SCFAs eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität der Darmbarriere und der Darmhomöostase sowie bei der Gestaltung des mukosalen Immunsystems und dem Ausgleich der Wirtsabwehr mit mikrobiellen Komponenten und Metaboliten [24, 44] . Die gegenseitige Kommunikation zwischen Wirt und Darmmikrobiota an der Darmbarriere reguliert Schleimhaut- und systemische Immunantworten und kann in pathologischen Zuständen zu einer GVHD führen [6, 45, 46]. Es wurde vermutet, dass die Darmmikrobiota eng mit der Expression von Tight-Junction-Proteinen zusammenhängt [47]. Die vorliegende Studie zeigte, dass die mRNA-Expression der TJs ZO-1 und Occludin negativ mit der relativen Häufigkeit schädlicher Bakterien korreliert, während sie positiv mit nützlichen Bakterien korreliert, was darauf hinweist, dass die Darmmikrobiota wichtig ist, um die Integrität der Bakterien aufrechtzuerhalten Darmbarriere. Darüber hinaus ist die Darmmikrobiota auch für die Aufrechterhaltung der intestinalen Immunbarriere von großer Bedeutung [47]. Wir beobachteten, dass einige der nützlichen Bakterien negativ mit dem Prozentsatz der CD3+CD4+T-Zellen korrelierten, jedoch positiv mit dem Prozentsatz der Tregs korrelierten. Hier haben wir gezeigt, dass nützliche Bakterien, hauptsächlich SCFA-Produzenten, negativ mit entzündungsfördernden Zytokinen, aber positiv mit entzündungshemmenden Zytokinen korrelieren, während schädliche Bakterien umgekehrt korrelieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der signifikante Unterschied in der Darmmikrobiota zwischen den Behandlungen ein vollständiges Bild der Wechselwirkungen zwischen der Darmmikrobiota und der Darmbarriere, der Immunität, nahelegt. In unseren Experimenten gab es noch einige diskussionswürdige Einschränkungen. Erstens: Obwohl unsere Studie die Auswirkungen von hAMSCs auf die Immunität, die Darmbarriere und die Darmmikrobiota bei aGVHD untersuchte, muss der zugrunde liegende Mechanismus noch in weiteren Studien verifiziert werden. Zweitens sind eine Depletion der Darmmikrobiota und eine Transplantation fäkaler Mikrobiota erforderlich, um die kausalen Zusammenhänge zwischen der Darmmikrobiota, der Darmbarriere und der Immunität zu untersuchen. Drittens sind weitere Untersuchungen zur Untersuchung der Auswirkungen von hAMSCs auf aus Mikrobiota stammende SCFAs und andere Metaboliten erforderlich. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Forschung darauf hindeutet, dass hAMSCs aGVHD lindern, indem sie die Normalisierung der Darmmikrobiota fördern und die Wechselwirkungen zwischen der Darmmikrobiota und der Darmbarriere, also der Immunität, regulieren. Unsere Studie ist die erste, die systematisch die Wirkungen und zugrunde liegenden Mechanismen von hAMSCs definiert, die die Darmmikrobiota und die Darmimmunität bei aGVHD regulieren.

Abb. 7 Korrelationsanalyse zwischen Darmmikrobiota und Darmimmunität. Spearmans Korrelationsanalyse wurde zwischen der relativen Häufigkeit von 15 verschiedenen Darmmikrobiota (auf Gattungsebene) und dem mRNA-Expressionsniveau von TJs, dem Prozentsatz an Immunzellen sowie der Konzentration von Zytokinen im Darm zwischen den beiden Gruppen durchgeführt. Spearman-r-Werte liegen zwischen -0,5 (blau) und 0,5 (rot).

Verweise

1. Schmid, C. (2021). Ein Schritt näher an GVL ohne GVHD. Blut, 137(19), 2565–2566. https://doi.org/10.1182/blood.2020010132

2. Chang, Y., Zhao, X. & Huang, X. (2018). Strategien zur Verstärkung und Erhaltung der Anti-Leukämie-Wirkung ohne Verschlimmerung der Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit. Frontiers in Immunology, 9, 3041. https://doi.org/10.3389/fmmu.2018.03041

3. Zhu, W., Winter, MG, Byndloss, MX, Spiga, L., Duerkop, BA, Hughes, ER, Büttner, L., de Lima Romão, E., Behrendt, CL, Lopez, CA, Sifuentes- Dominguez, L., Huf-Hardy, K., Wilson, RP, Gillis, CC, Tükel, Ç., Koh, AY, Burstein, E., Hooper, LV, Bäumler, AJ, & Winter, SE (2018). Eine präzise Bearbeitung der Darmmikrobiota lindert Kolitis. Natur, 553(7687), 208–211. https://doi.org/10.1038/nature25172

4. Zhao, L., Zhang, F., Ding, X., Wu, G., Lam, YY, Wang, X., Fu, H., Xue, X., Lu, C., Ma, J. , Yu, L., Xu, C., Ren, Z., Xu, Y., Xu, S., Shen, H., Zhu, X., Shi, Y., Shen, Q., … Zhang, C . (2018). Durch Ballaststoffe gezielt geförderte Darmbakterien lindern Typ-2-Diabetes. Science (New York, NY), 359(6380), 1151–1156. https://doi.org/10.1126/science.aao5774

5. Shono, Y. & van den Brink, MRM (2018). Schädigung der Darmmikrobiota bei allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Naturrezensionen. Krebs, 18(5), 283–295. https://doi.org/10.1038/nrc.2018.10

6. Stafas, A., Burgos da Silva, M. & van den Brink, MRM (2017). Die Darmmikrobiota bei allogener hämatopoetischer Zelltransplantation und Graft-versus-Host-Krankheit. Blut, 129(8), 927–933. https://doi.org/10.1182/blood-2016-09-691394

7. Wu, K., Yuan, Y., Yu, H., Dai, X., Wang, S., Sun, Z., Wang, F., Fei, H., Lin, Q., Jiang, H ., & Chen, T. (2020). Der mikrobielle Darmmetabolit Trimethylamin-N-oxid verschlimmert GVHD, indem er bei Mäusen eine M1-Makrophagenpolarisation induziert. Blut, 136(4), 501–515. https://doi.org/10.1182/blood.2019003990

8. Mathewson, ND, Jenq, R., Mathew, AV, Koenigsknecht, M., Hanash, A., Toubai, T., Oravecz-Wilson, K., Wu, S., Sun, Y., Rossi, C ., Fujiwara, H., Byun, J., Shono, Y., Lindemans, C., Calafore, M., Schmidt, TM, Honda, K., Young, VB, Pennathur, S., … Reddy, P. (2016). Aus dem Darmmikrobiom stammende Metaboliten modulieren die Schädigung der Darmepithelzellen und mildern die Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit. Nature Immunology, 17(5), 505–513. https://doi.org/10.1038/ni.3400

9. Dave, JR, Chandekar, SS, Behera, S., Desai, KU, Salve, PM, Sapkal, NB, Mhaske, ST, Dewle, AM, Pokare, PS, Page, M., Jog, A., Chivte , PA, Srivastava, RK, & Tomar, GB (2022). Menschliche gingivale mesenchymale Stammzellen behalten ihr Wachstum und ihre immunmodulatorischen Eigenschaften unabhängig vom Alter des Spenders. Wissenschaftliche Fortschritte, 8(25), m6504. https://doi.org/10. 1126/sciadv.abm6504

10. Zhao, K. & Liu, Q. (2016). Die klinische Anwendung mesenchymaler Stromazellen bei der Transplantation hämatopoetischer Stammzellen. Journal of Hematology & Oncology, 9(1), 46. https://doi.org/ 10.1186/s13045-016-0276-z

11. Liu, Q., Huang, Q., Wu, H., Zuo, G., Gu, H., Deng, K. & Xin, H. (2021). Eigenschaften und therapeutisches Potenzial menschlicher, aus Amnion gewonnener Stammzellen. International Journal of Molecular Sciences, 22(2), 970. https://doi.org/10.3390/ijms22020970

12. Li, J., Zhou, Z., Wen, J., Jiang, F. & Xia, Y. (2020). Menschliche amniotische mesenchymale Stammzellen fördern die endogene Knochenregeneration. Frontiers in Endocrinology, 11, 543623. https://doi.org/10.3389/fendo.2020.543623

13. Díaz-Prado, S., Muiños-López, E., Hermida-Gómez, T., Cicione, C., Rendal-Vázquez, ME, Fuentes-Boquete, I., de Toro, FJ, Blanco, FJ ( 2011). Menschliche Fruchtwassermembran als alternative Stammzellquelle für die regenerative Medizin. Differenzierung; Forschung zur biologischen Vielfalt, 81(3), 162–171. https://doi.org/10.1016/j.dif.2011.01.005

14. Hong, J., Gao, Y., Song, J., Zhuo, W., Sun, H. & Ping, B. (2016). Vergleich der biologischen Eigenschaften und der immunsuppressiven Aktivität zwischen menschlichen amnionischen mesenchymalen Stammzellen und menschlichen mesenchymalen Knochenmarksstammzellen. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi, 24(3), 858–864. https://doi.org/10.7534/j.issn.1009-2137.2016.03.041

15. Gao, Y., Li, W., Bu, X., Xu, Y., Cai, S., Zhong, J., Du, M., Sun, H., Huang, L., He, Y ., Hu, X., Liu, Q., Jin, H., Wang, Q. & Ping, B. (2021). Menschliche amnionische mesenchymale Stammzellen hemmen aGVHD, indem sie das Gleichgewicht von Treg- und T-Efektorzellen regulieren. Journal of Inflammation Research, 14, 3985–3999. https://doi.org/10.2147/ JIR.S323054

16. Cooke, KR, Kobzik, L., Martin, TR, Brewer, J., Delmonte, JJ, Crawford, JM und Ferrara, JL (1996). Ein experimentelles Modell des idiopathischen Pneumonie-Syndroms nach Knochenmarktransplantation: I. Die Rolle von Minor-H-Antigenen und Endotoxin. Blut, 88(8), 3230–3239.

17. Yañez, R., Lamana, ML, García-Castro, J., Colmenero, I., Ramírez, M. & Bueren, JA (2006). Aus Fettgewebe gewonnene mesenchymale Stammzellen haben in vivo immunsuppressive Eigenschaften, die zur Bekämpfung der Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit geeignet sind. Stammzellen (Dayton, Ohio), 24(11), 2582–2591.

18 Hooper, LV, Littman, DR, & Macpherson, AJ (2012). Wechselwirkungen zwischen der Mikrobiota und dem Immunsystem. Science (New York, NY), 336(6086), 1268–1273. https://doi.org/10.1126/science.1223490

19. Kelly, K. & Rasko, JEJ (2021). Mesenchymale Stromazellen zur Behandlung der Graft-versus-Host-Krankheit. Frontiers in Immunology, 12, 761616. https://doi.org/10.3389/fmmu.2021.761616

20. Macías-Sánchez, MDM, Morata-Tarifa, C., Cuende, N., Cardesa-Gil, A., Cuesta-Casas, M. Á., Pascual-Cascon, MJ, Pascual, A., Martín-Calvo , C., Jurado, M., Perez-Simón, JA, Espigado, I., Garzón López, S., Carmona Sánchez, G., Mata-Alcázar-Caballero, R., & Sánchez-Pernaute, R. (2022 ). Mesenchymale Stromazellen zur Behandlung der steroidresistenten akuten und chronischen Graft-versus-Host-Krankheit: Eine multizentrische Compassionate-Use-Erfahrung. Stammzellen Translationale Medizin, 11(4), 343–355. https://doi.org/10.1093/stcltm/szac003

21. Tago, Y., Kobayashi, C., Ogura, M., Wada, J., Yamaguchi, S., Yamaguchi, T., Hayashi, M., Nakaishi, T., Kubo, H. & Ueda, Y. (2021). Aus menschlichen Amnionen gewonnene mesenchymale Stammzellen mildern die xenogene Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit, indem sie die Aktivierung und Proliferation von T-Zellen verhindern. Wissenschaftliche Berichte, 11(1), 2406. https://doi. org/10.1038/s41598-021-81916-y

22. Yamahara, K., Harada, K., Ohshima, M., Ishikane, S., Ohnishi, S., Tsuda, H., Otani, K., Taguchi, A., Soma, T., Ogawa, H ., Katsuragi, S., Yoshimatsu, J., Harada-Shiba, M., Kangawa, K. & Ikeda, T. (2014). Vergleich der angiogenen, zytoprotektiven und immunsuppressiven Eigenschaften menschlicher mesenchymaler Stammzellen aus Amnion und Chorion. PLoS One, 9(2), e88319. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088319

23. Yamahara, K., Hamada, A., Soma, T., Okamoto, R., Okada, M., Yoshihara, S., Yoshihara, K., Ikegame, K., Tamaki, H., Kaida, K ., Inoue, T., Ohsugi, Y., Nishikawa, H., Hayashi, H., Ito, YM, Iijima, H., Ohnishi, S., Hashimoto, D., Isoe, T., … Fujimori, Y . (2019). Sicherheit und Wirksamkeit von Amnion-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen (AM01) bei Patienten mit steroidrefraktärer akuter Graft-versus-Host-Krankheit nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation: ein Studienprotokoll für eine japanische Phase-I/II-Studie. BMJ Open, 9(7), e26403. https://doi.org/10.1136/bmjop de-2018-026403

24. Lin, D., Hu, B., Li, P., Zhao, Y., Xu, Y. & Wu, D. (2021). Rollen der Darmmikrobiota und mikrobiellen Metaboliten bei akuter GVHD. Experimental Hematology & Oncology, 10(1), 49. https://doi.org/10.1186/s40164-021-00240-3

25. Ghimire, S., Weber, D., Mavin, E., Wang, XN, Dickinson, AM, & Holler, E. (2017). Pathophysiologie von GvHD und anderen HSCT-bedingten schwerwiegenden Komplikationen. Frontiers in Immunology, 8, 79. https://doi.org/10.3389/fmmu.2017.00079

26. Xu, J., Wang, X., Chen, J., Chen, S., Li, Z., Liu, H., Bai, Y. & Zhi, F. (2020). Aus embryonalen Stammzellen gewonnene mesenchymale Stammzellen fördern die Integrität und Regeneration des Dickdarmepithels, indem sie den zirkulierenden IGF-1 bei Colitis-Mäusen erhöhen. Theranostics, 10(26), 12204–12222. https://doi.org/10.7150/thno.47683

27. Zhao, Y., Huang, J., Li, T., Zhang, S., Wen, C. & Wang, L. (2022). Berberin lindert aGVHD durch Umbau der Darmmikrobiota, Unterdrückung des TLR4-Signals und Reparatur der Dickdarmbarriere zur Hemmung des NLRP3-Inflammasoms. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 26(4), 1060–1070. https://doi.org/10. 1111/jcmm.17158

28. Yuan, M., Lin, L., Cao, H., Zheng, W., Wu, L., Zuo, H., Tian, ​​X. & Song, H. (2022). Darmmikrobiota ist an der Schutzwirkung von HO-1/BMMSCs bei Lebertransplantationen mit steatotischen Lebertransplantaten bei Ratten beteiligt. Frontiers in Microbiology, 13, 905567. https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.905567

29. Taur, Y., Jenq, RR, Perales, M., Littmann, ER, Morjaria, S., Ling, L., No, D., Gobourne, A., Viale, A., Dahi, PB, Ponce , DM, Barker, JN, Giralt, S., van den Brink, M. & Pamer, EG (2014). Die Auswirkungen der Bakterienvielfalt im Darmtrakt auf die Mortalität nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Blut, 124(7), 1174–1182. https://doi.org/10.1182/ Blut-2014-02-554725

30. Jenq, RR, Taur, Y., Devlin, SM, Ponce, DM, Goldberg, JD, Ahr, KF, Littmann, ER, Ling, L., Gobourne, AC, Miller, LC, Docampo, MD, Peled, JU, Arpaia, N., Cross, JR, Peets, TK, Lumish, MA, Shono, Y., Dudakov, JA, Poeck, H., … van den Brink, MRM (2015). Darmblautia ist mit einer geringeren Sterblichkeit aufgrund der Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit verbunden. Biologie der Blut- und Marktransplantation: Journal of the American Society for Blood and Marrow Transplantation, 21(8), 1373–1383. https://doi.org/10.1016/j.bbmt.2015.04.016

31. Le Bastard, Q., Chevallier, P., & Montassier, E. (2021). Darmmikrobiom bei allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation und spezifische Veränderungen im Zusammenhang mit einer akuten Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung. World Journal of Gastroenterology, 27(45), 7792–7800. https://doi.org/10.3748/wjg.v27.i45.7792

32. Li, X., Lu, C., Fan, D., Lu, X., Xia, Y., Zhao, H., Xu, H., Zhu, Y., Li, J., Liu, H ., & Xiao, C. (2020). Menschliche mesenchymale Stammzellen aus der Nabelschnur zeigen therapeutisches Potenzial bei rheumatoider Arthritis, indem sie über den Aryl-Kohlenwasserstoffrezeptor die Wechselwirkungen zwischen Immunität und Darmmikrobiota regulieren. Frontiers in cell and developmental biology, 8, 131. https://doi.org/10.3389/fcell.2020.00131

33. Sun, J., Ding, X., Liu, S., Duan, X., Liang, H. & Sun, T. (2020). Aus Fett gewonnene mesenchymale Stammzellen mildern akute Lungenschäden und verbessern die Darmmikrobiota bei septischen Ratten. Stammzellforschung und -therapie, 11(1), 384. https://doi.org/10.1186/ s13287-020-01902-5

34. Soontararak, S., Chow, L., Johnson, V., Coy, J., Wheat, W., Regan, D. & Dow, S. (2018). Mesenchymale Stammzellen (MSC), die aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) stammen und den aus Fettgewebe gewonnenen MSC entsprechen, fördern die Darmheilung und die Normalisierung des Mikrobioms im Mausmodell für entzündliche Darmerkrankungen. Stammzellen Translationale Medizin, 7(6), 456–467. https://doi.org/ 10.1002/sctm.17-0305

35. Li, J., Zou, C. & Liu, Y. (2022). Verbesserung der Ovalbumin-induzierten Nahrungsmittelallergie bei Mäusen durch gezielte rektale und kolonische Verabreichung von Cyanidin-3-O-Glucosid. Foods (Basel, Schweiz), 11(11), 1542. https://doi.org/10.3390/foods11111542

36. Maruyama, S., Matsuoka, T., Hosomi, K., Park, J., Nishimura, M., Murakami, H., Konishi, K., Miyachi, M., Kawashima, H., Mizuguchi, K ., Kobayashi, T., Ooka, T., Yamagata, Z., & Kunisawa, J. (2022). Klassifizierung des Auftretens von Dyslipidämie anhand von Darmbakterien im Zusammenhang mit der Gerstenaufnahme. Frontiers in Nutrition, 9, 812469. https://doi.org/10.3389/fnut.2022.812469

37. Lee, SH, Park, H., Kang, CD, Choi, DH, Park, SC, Park, JM, Nam, S., Chae, GB, Lee, KY, Cho, H. & Lee, SJ ( 2022). Eine hochdosierte intramuskuläre Vitamin-D3-Supplementierung wirkt sich auf die Darmmikrobiota von Patienten mit Clostridioides-difcile-Infektion aus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 12, 904987. https://doi.org/10.3389/fcimb.2022.904987

38. Meyer, RK, Lane, AI, Weninger, SN, Martinez, TM, Kangath, A., Laubitz, D. & Duca, FA (2022). Oligofruktose stellt den postprandialen Gehalt an kurzkettigen Fettsäuren bei fettreicher Fütterung wieder her. Fettleibigkeit (Silver Spring, Md.), 30(7), 1442–1452. https://doi.org/10.1002/oby.23456

39. Sang, J, Zhuang, D, Zhang, T, Wu, Q, Yu, J, Zhang, Z (2022) Konvergente und divergente Altersmuster der Darmmikrobiota-Diversität bei Menschen und nichtmenschlichen Primaten. M-Systeme: e151221. https://doi.org/10.1128/msystems.01512-21

40. Ge, X., He, X., Liu, J., Zeng, F., Chen, L., Xu, W., Shao, R., Huang, Y., Farag, MA, Capanoglu, E. , El-Seedi, HR, Zhao, C. & Liu, B. (2022). Linderung von Typ-2-Diabetes durch die neuartige 6, 8-Guanidylluteolinchinon-Chrom-Koordination über biochemische Mechanismen und Interaktion mit Darmmikrobiota. Journal of Advanced Research, S2090–1232(22), 121–129. https://doi.org/ 10.1016/j.jare.2022.06.003

41. Ding, Q., Cao, F., Lai, S., Zhuge, H., Chang, K., Valencak, TG, Liu, J., Li, S. & Ren, D. (2022). Lactobacillus plantarum ZY08 lindert chronische alkoholbedingte Lebersteatose und Leberschäden bei Mäusen durch die Wiederherstellung der Homöostase der Darmforen. Food Research International (Ottawa, Ontario), 157, 111259. https://doi.org/10. 1016/j.foodres.2022.111259

42. Rees, NP, Shaheen, W., Quince, C., Tselepis, C., Horniblow, RD, Sharma, N., Beggs, AD, Iqbal, TH, & Quraishi, MN (2022). Eine systematische Überprüfung der prädiktiven Spender- und Empfänger-Biomarker für das Ansprechen auf eine fäkale Mikrobiota-Transplantation bei Patienten mit Colitis ulcerosa. EBioMedicine, 81, 104088. https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2022.104088

43. Li, A., Abraham, C., Wang, Y. und Zhang, Y. (2020). Neue Einblicke in die grundlegende Biologie der akuten Graft-versus-Host-Erkrankung. Haematologica, 105(11), 2540–2549. https://doi.org/10.3324/haematol. 2019.240291 44. Kayama, H., Okumura, R. & Takeda, K. (2020). Interaktion zwischen Mikrobiota, Epithelien und Immunzellen im Darm. Jahresrückblick auf die Immunologie, 38, 23–48. https://doi.org/ 10.1146/Annu rev-immunol-070119-115104

45. Schluter, J., Peled, JU, Taylor, BP, Markey, KA, Smith, M., Taur, Y., Niehus, R., Stafas, A., Dai, A., Fontana, E., Amoretti , LA, Wright, RJ, Morjaria, S., Fenelus, M., Pessin, MS, Chao, NJ, Lew, M., Bohannon, L., Bush, A., … Xavier, JB (2020). Die Darmmikrobiota ist mit der Dynamik der Immunzellen beim Menschen verbunden. Natur, 588(7837), 303–307. https://doi.org/10.1038/ s41586-020-2971-8

46. ​​Yang, J, Yang, H, Li, Y (2022) Die dreifachen Wechselwirkungen zwischen Darmmikrobiota, Mykobiota und Wirtsimmunität. Kritische Rezensionen in Lebensmittelwissenschaft und Ernährung: 1–21. https://doi.org/10.1080/10408 398.2022.2094888

47. An, J., Liu, Y., Wang, Y., Fan, R., Hu, X., Zhang, F., Yang, J. & Chen, J. (2022). Die Rolle der Darmschleimhautbarriere bei Autoimmunerkrankungen: Ein potenzielles Angriffsziel. Frontiers in Immunology, 13, 871713. https://doi.org/10.3389/fmmu.2022.871713