Immunmodulatorische Faktoren in Cistanche Salsa

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Shinjiro MARUYAMA", Koji YAMADA, Hirofumi TACHIBANA

Cistanche-Salsa(CAMever) G.Beck, Orobanchaceae ist eine parasitäre Pflanze, die in Japan als orientalisches Heilmittel verwendet wird. In unserer früheren Studie fanden wir heraus, dass C.-Salsa-Extrakt die Produktion von sowohl IgM als auch IgG in menschlichen Ivmph-Knoten-Lymphozyten verstärkte. Darüber hinaus verstärkte C, Salsa-Dialysat (CSD), das unter Verwendung einer Dialysemembran mit einem a3.500-Da-Molekulargewichts-Cutoff hergestellt wurde, die IgM-Produktion in der menschlichen B-Zelllinie BALL-1; außerdem induzierte es eine leichte Zellproliferation. Im Gegensatz dazu induzierte CSD jedoch eine von Apoptose begleitete Wachstumshemmung in der menschlichen Burkitt-Lymphom-Zelllinie Namalwa. Diese Ergebnisse weisen auf das mögliche Vorhandensein aktiver Bestandteile in CSD hin, die für Lymphozyten spezifisch sind. Bisher wurden die chemischen Eigenschaften dieser Bestandteile nicht aufgeklärt. In dieser Studie untersuchten wir die chemischen Eigenschaften der aktiven Bestandteile in CSD. Beide oben erwähnten Aktivitäten in B-Zelllinien wurden durch die Autoklavenbehandlung von CSD nicht inaktiviert. Unter Verwendung von Gelfiltrationssäulenchromatographie fanden wir heraus, dass die Peaks der aktiven Fraktionen in verschiedenen Fraktionen konzentriert waren. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass es mindestens 2 Arten von aktiven Bestandteilen in CSD gibt, und sie können Polysaccharide sein, da sie wasserlösliche Bestandteile mit hohem Molekulargewicht und thermostabil sind.

Schlüsselwörter: Cistanche Salsa, hohes Molekulargewicht, IgM, Wachstumshemmung.

Einführung

Cistanche-Salsa(CA Meyer) G.Beck, Orobanchaceae ist eine parasitäre Pflanze, die in Japan als orientalisches Heilmittel verwendet wird. In China ist diese Pflanze eine wichtige traditionelle Medizin, die zur Behandlung von Niereninsuffizienz und Neurasthenie eingesetzt wird. Durch In-vitro-Studien haben wir bereits über die Auswirkungen von C. salsa auf das Immunsystem berichtet. Zuerst. Wir haben gezeigt, dass C. salsa-Extrakt die Produktion von IgM und IgG in menschlichen Lymphknoten-Lymphozyten verstärkt. Zweitens zeigten wir, dass C.-Salsa-Dialysat (CSD), das unter Verwendung einer Dialysemembran mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 3,500-Da hergestellt wurde, die IgM-Produktion in der menschlichen B-Zelllinie BALL-1 verstärkte; außerdem induzierte es in geringem Maße die Zellproliferation.2 Darüber hinaus hat CSD eine gegenteilige Wirkung, indem es eine Wachstumshemmung, begleitet von Apoptose, in der menschlichen Burkitt-Lymphom-Zelllinie Namalwa induziert.3) Diese Ergebnisse legen nahe, dass diese Wirkung von CSD damit zusammenhängt die Aktivierung von B-Zellen, während die Apoptose aus dem Fehlen anderer Signale resultierte, die für die B-Zell-Differenzierung erforderlich sind, wie Zytokine und Zell-Zell-Kontakt; Die chemischen Eigenschaften von CSD wurden jedoch in keiner der früheren Studien aufgeklärt. Daher untersuchten wir in dieser Studie die chemischen Eigenschaften der aktiven Bestandteile in CSD.

Materialen und Methoden

CSD wurde nach der gleichen Methode in unserer vorherigen Studie hergestellt. CSD wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 20 mg/ml gelöst. Die hergestellte Lösung (0,8 ml) wurde vor dem Auftragen durch einen Filter (0,22 um) geleitet und dann mit der gleichen Lösung durch Säulen eluiert, die TOYOPEARL HW-40F enthielten (1,0×96,5 cm; Tosoh Corp., Japan),TOYOPEARL HW-55F(1,0 × 98,0 cm; Tosoh Corp.,Japan) , und Sephacryl S-400HR(1,0×98,0 cm; GE Healthcare UK Ltd., England); und 1 ml (30 Tropfen) Fraktionen wurden dann gesammelt. Um das Hohlraumvolumen der Gele und das ungefähre Molekulargewicht (MW) der fraktionierten Bestandteile zu bestimmen, wurde blaues Dextran (BD) (Sigma-Aldrich Japan KK, Japan); und Dextrane mit bekanntem MW, erhalten von Leuconostoc spp. (Sigma-Aldrich Japan KK, Japan), dh mit MW2, 000 kDa (D1), 500 kDa (D2), 70 kDa (D3) und 6 kDa (D4); und Cyanocobalamin (VB12, MW: 1355,4) (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japan) verwendet. Der Gesamtzucker- und Proteingehalt jeder Fraktion wurde unter Verwendung des Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bzw. des Lowry-Verfahrens mit dem PIERCE TM -Bicinchoninsäuren (BCA)-Protein-Assay-Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) bestimmt. Als jeweilige Standards wurden Glukose und Rinderserumalbumin verwendet. Weiterhin wurde die Extinktion bei 320 nm (A:20) jeder Fraktion gemessen. Die Elutionspeaks von blauem Dextran und Cyanocobalamin wurden durch ihren Extinktionswert bei 260 nm bestimmt, und die Peaks von Dextranen mit bekanntem MW wurden unter Verwendung des Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens bestimmt. CSD wurde bei 120 Grad für 20 Minuten autoklaviert, um seine Thermostabilität zu bewerten. In Bioassays wurden die Zellkultur und die Messung von IgM nach der gleichen Methode wie in unserer vorherigen Studie durchgeführt.

Cistanche-Salsa-Extrakt

Resultate und Diskussion

Abbildung 1 zeigt die Chromatogramme der Gelfiltrationssäule von CSD auf HW-40F. Aus Fig. 1a wurde das MW der aktiven Bestandteile basierend auf dem Dextran-Marker D4 auf mehr als 6 kDa geschätzt. Darüber hinaus wurden beide CSD-Aktivitäten, dh die Steigerung der IgM-Produktion und die Induktion der Wachstumshemmung, durch die Autoklavenbehandlung nicht inaktiviert (Abbildung 2), obwohl einige Bestandteile aggregierten und verloren gingen, nachdem CSD durch das 0 geleitet wurde.{{6} } äh Filter. Die Elutionsmuster von CSD und autoklaviertem CSD waren fast identisch, jedoch war die relative Aktivität der Steigerung der IgM-Produktion in autoklaviertem CSD geringer als bei unbehandeltem CSD. Einige der Gründe scheinen darin zu liegen, dass die Aggregate die aktiven Bestandteile enthielten oder einige der aktiven Bestandteile inaktiviert waren. Die Ergebnisse der Chromatographie auf HW-55F zeigten das mögliche Vorhandensein von 2 Arten von immunmodulatorischen Faktoren: der erste, konzentriert in fr. Nr.32. war ein hochmolekularer aktiver Bestandteil (HCS), der die IgM-Produktion steigern konnte, während der zweite, konzentriert in fr. Nr. 50, war ein Wirkstoff mit mittlerem Molekulargewicht (MCS), der die Zellproliferation hemmen konnte (Abbildung 3). Jedoch waren die sowohl für HCS als auch für MCS (Fr. Nr. 32 bzw. 50) erhaltenen Peaks nicht so scharf wie die der Dextrane mit bekanntem MW (Daten nicht gezeigt). Diese Beobachtungen weisen auf die Möglichkeit hin, dass während der CSD-Zubereitung künstlich erzeugte Nebenprodukte, Polymere von Wirkstoffen, die leicht zerstört werden und aus mehreren Einheiten bestehen, oder verschiedene Wirkstoffe mit unterschiedlichen ursprünglichen MWs vorhanden sind. Die Elutionsmuster auf den Chromatogrammen zeigen, dass es nicht einfach ist, reine Bestandteile von HCS und MCS zu erhalten, da es anscheinend verschiedene Bestandteile gibt, die leicht unterschiedliche MWs haben, wie oben erwähnt. Obwohl beide Mischungen aktiver Bestandteile sind, scheint es, dass HCS Bestandteile mit einem MW von mehr als 70 kDa umfasst, während MCS solche mit einem MW von mehr als 6 kDa umfasst. HCS wurde auf HW-55F in einer Fraktion eluiert, die außerhalb des Trennbereichs lag. Auf Sephacryl-S400 wurde ein Teil von HCS (fr. Nr. 36) in derselben Fraktion wie der D1-Marker eluiert, der ein MW von 2, 000 kDa hat (Fig. 4). Im Allgemeinen werden Polysaccharide und Proteine ​​als wasserlösliche Bestandteile mit hohem MW in Pflanzenextrakten berücksichtigt. Da fast alle funktionellen Proteine ​​durch Hitzebehandlung inaktiviert werden, scheinen sie Polysaccharide zu sein. Park et. Al. berichteten über das thermostabile zytotoxische kleine Protein namens Viscotoxin, das aus Mistelextrakt (Viscum album L., Viscaceae) hergestellt wird.4 Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Viscotoxine die immunmodulatorische Aktivität menschlicher natürlicher Killerzellen verstärken.5In Abbildung 3 ist das MCS, das hat ein niedrigeres MW, zeigt einen höheren Proteingehalt. In Anbetracht dieser Tatsachen kann MCS ein proteingebundenes Polysaccharid8 oder ein thermostabiles Protein wie die Viscotoxine sein. Diese Ergebnisse zeigen, dass die 2 aktiven Bestandteile Polysaccharide sein können. Andernfalls könnten die MCS thermostabile Proteine ​​sein.

Verweise

1) Deng, M., Zhao, JY, Ju, XD, Tu, PF, Jiang, Y., Li, ZB: Schutzwirkung von Tubulosid B auf TNF-alpha-induzierte Apoptose in neuronalen Zellen. Acta Pharmacol. Sin.,25, 1276-1284,2004.

2) Maruyama, S., Yamada, K., Tachibana, H.:Cistanche-Salsa-Extrakterhöhte IgM-Produktion in der menschlichen B-Zelllinie BALL-1.J. Trad. Med.,24,209-211,2007.

3) Maruyama, S., Yamada, K., Tachibana, H.:Cistanche-SalsaExtrakt induzierte Apoptose in der humanen Burkitt-Lymphom-Zelllinie Namalwa. J. Trad. Med.,25,24-27,2008.

4) Parken. JH, Hyun, CK, Shin HK: Zytotoxische Wirkungen der Komponenten in hitzebehandelter Mistel (Viscum album).Cancer Let, 139, 207-213,1999.

5) Tabasco, J., Pont, F., Fournic, JJ, Vercellone, A.: Mistel-Viscotoxine erhöhen die durch natürliche Killerzellen vermittelte Zytotoxizität. Eur.J. Biochem., 269, 2591-2600, 2002.

6) Fisher, M., Yang, LX: Antikrebswirkungen und -mechanismen von Polysaccharid-K (PSK): Implikationen der Krebsimmuntherapie.Anticancer Res.,22,1737-1754,2002.

Cistanche-Ergänzungen