Einfluss der Low-Protein-Aufnahme während der Schwangerschaft auf die Expression der embryonalen Nieren-MicroRNA und in Nephron-Vorläuferzellen des männlichen Fötus

edmund.chen@wecistanche.com

Einführung

Der Mangel an Nährstoffen kann in verschiedenen Phasen der fötalen Entwicklung zu Signalveränderungen in zentralen Signalwegen führen, die im Erwachsenenalter zu irreversiblen Organ- und Systemstörungen führen können [1]. Fetale Programmierung bezieht sich auf jede Verletzung während der Entwicklung, die langfristige Auswirkungen auf die Struktur oder Funktion eines Organismus hat [2]. Störungen in der fetalen Programmierung führen zu einem niedrigen Geburtsgewicht, weniger Nephronen und einem erhöhten Risiko für kardiovaskuläre undNieren-Störungen im Erwachsenenalter [3–6]. Studien von anderen Autoren und uns haben ein geringeres Geburtsgewicht, 28 Prozent weniger Nephrone und eine Reduzierung gezeigtNieren-Salzausscheidung, chronischNierenversagenund arterielle Hypertonie bei gestationsbedingter Low-Protein (LP)-Zufuhr im Vergleich zu Standard (NP)-Proteinzufuhr bei Nachkommen im Erwachsenenalter [3–7]. Die Nephrogenese beinhaltet eine strenge Kontrolle der Genexpression, der Proteinsynthese und des Gewebeumbaus. Studien haben gezeigt, dass die Anzahl der Nephrone durch die Wechselwirkungen zwischen Ureterknospe (UB) und Metanephros-Mesenchym (MM)-Vorläuferzellen bestimmt wird [8–10]. Signale von MM induzieren ein UB-stimuliertes Wachstum und eine Verzweigung des Tubulussystems. Die MM-Proliferation und -Differenzierung wiederum, die eine mesenchymale Kappe (CM) bildet, wird durch UB-Enden vermittelt [11].

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENERKRANKUNGEN VERBESSERN

Es besteht ein ernsthaftes Interesse an der Rolle epigenetischer Veränderungen in Bezug auf die langfristigen Auswirkungen von pränatalem Stress auf die fetale Entwicklung [12]. MicroRNAs (miRNAs) sind genomkodierte kleine nichtkodierende RNAs mit einer Länge von etwa 22 Nukleotiden und spielen eine wesentliche Rolle bei der posttranskriptionellen Regulation der Zielgenexpression [13–16]. miRNAs steuern die Genexpression posttranskriptionell, indem sie die mRNA-Translation oder -Stabilität im Zytoplasma regulieren [17, 18]. Funktionelle Studien weisen darauf hin, dass miRNAs an kritischen biologischen Prozessen während der Entwicklung und in der Zellphysiologie beteiligt sind [13, 16]. Veränderungen in ihrer Expression wurden in mehreren Pathologien beobachtet [16, 19]. Somit hat die Charakterisierung von miRNAs dazu beigetragen, die Genregulation und Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose zu verstehen und pathophysiologische Störungen zu erklären, einschließlichNiereErkrankungen [20–22]. Studien haben das während berichtetNiereontogenetische miRNAs sind für die Nephronentwicklung unverzichtbar [23–26]. Darüber hinaus reduziert die Unterexpression einiger miR-NAs in MM-Vorläuferzellen die Zellproliferation, was zu einer frühen Differenzierung führt und folglich die Anzahl der Nephrone verringert [27, 28]. Dieses Phänomen ist durch erhöhte Apoptose und hohe Bim-Expression in Vorläuferzellen gekennzeichnet [27]. Somit modulieren miRNAs das Gleichgewicht zwischen Apoptose und Proliferation dieser metanephrischen Primärzellen [29].

Wir stellten die Hypothese auf, dass unbekannte epigenetische Veränderungen und miRNA-Expressionsprofile damit verbunden sindNiereEntwicklungsstörungen bei maternal proteineingeschränkten Nachkommen. Daher zielten wir darauf ab, Muster von miRNA und vorhergesagter Genexpression im Fötus zu bewertenNieream 17. Tag der Trächtigkeit (17-DG) proteinbeschränkte männliche Nachkommen, um molekulare Signalwege und daran beteiligte Störungen zu identifizierenNieren-Zellproliferation und Differenzierung währendNiereEntwicklung.

Schlüsselwörter:Nierenversagen; renale tubuläre; Nierenerkrankungen; Nierenentwicklung; Niere

Material und Methodik

Tier und ErnährungDie Experimente wurden wie zuvor ausführlich beschrieben [5, 6] an gleichaltrigen weiblichen und männlichen Ratten von geschwisterverpaarten Wistar-HanUnib-Ratten (250–300 g) durchgeführt, die aus einem von CEMIB/UNICAMP gelieferten Zuchtbestand stammten , Campinas, SP, Brasilien. Die Umgebung und die Unterbringung boten die richtigen Bedingungen für das Management ihrer Gesundheit und ihres Wohlbefindens während des experimentellen Verfahrens. Unmittelbar nach dem Absetzen im Alter von drei Wochen wurden die Tiere unter kontrollierten Temperatur- (25°C) und Lichtbedingungen (07:00–19:00 Uhr) mit freiem Zugang zu Leitungswasser und Standard-Labornagerfutter (Purina Nuvital , Curitiba, PR, Brasilien: Na-Plus-Gehalt: 135 ± 3 μEq/g, K-Plus-Gehalt: 293 ± 5 μEq/g), für 12 Wochen vor der Zucht. Das Institutional Ethics Committee on Animal Use an der São Paulo State University (#446-CEUA/UNESP) genehmigte das Versuchsprotokoll und die allgemeinen Richtlinien des Brasilianischen College für Tierversuche wurden während der gesamten Untersuchung befolgt. Als Tag 1 der Schwangerschaft wurde der Tag bezeichnet, an dem der Vaginalabstrich Spermien aufwies. Dann wurden die Muttertiere während der gesamten Trächtigkeit ad libitum mit einem isokalorischen Nagetier-Laborfutter entweder mit Standard-Proteingehalt [NP, n=36] (17 Prozent Protein) oder niedrigem Proteingehalt [LP, n=51 gehalten. ] (6 Prozent Eiweiß). Die maternale Futteraufnahme von NP und LP wurde täglich bestimmt (anschliessend auf das Körpergewicht normalisiert) und das Körpergewicht der Muttertiere in beiden Gruppen wöchentlich erfasst. Am 17. Trächtigkeitstag (17-DG) wurden die Muttertiere mit Ketamin (75 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) anästhesiert und der Uterus freigelegt. Die Föten wurden entfernt und sofort durch Enthauptung eingeschläfert. Die Föten wurden gewogen und der Schwanz und die Gliedmaßen wurden zur Geschlechtsbestimmung gesammelt. Die Metanephros wurden für Next Generation Sequencing (NGS), RT-qPCR und immunhistochemische Analysen gesammelt.

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENVERSAGEN VERBESSERN

GeschlechtsbestimmungDie vorliegende Studie wurde nur an männlichen 17-DG-Nachkommen durchgeführt, und die Geschlechtsbestimmung wurde durch konventionelle Sry-PCR-Sequenzanalyse (Polymerase-Kettenreaktion) bestimmt. Die DNA wurde durch enzymatische Lyse mit Proteinase K und Phenol-Chloroform extrahiert. Zur Reaktion wurde der Master Mix Colorless – Promega verwendet, mit den Zyklusbedingungen des Herstellers. Die Integrated DNA Technologies (IDT) synthetisierten die Primer mit den folgenden Sequenzen: Vorwärts: 5'-TACAGCTCTGAGGACATATTA-3' Rückwärts: 5'-GCACTTTAACCCTTCGATTAG-3'.

Gesamt-RNA-ExtraktionRNA wurde aus NP (n=4) und LP (n=4) ganz extrahiertNierenunter Verwendung von Trizol-Reagenz (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Gesamt-RNA-Menge wurde durch die Extinktion bei 260 nm unter Verwendung eines nanoVue-Spektrophotometers (GE Healthcare, USA) bestimmt. Die RNA-Integrität wurde durch den Erhalt einer RNA-Integritätsnummer – RIN > 8 mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Deutschland) [30] sichergestellt.

miRNA-Seq und DatenanalyseDie Sequenzierung wurde auf der MiSeq-Plattform (Illumina) durchgeführt. Das Protokoll folgte den Anweisungen des Herstellers, verfügbar inKurz gesagt umfasst die Sequenzierung den Aufbau einer Bibliothek, und dazu wurde 1 ug Gesamt-RNA verwendet. In diesem Schritt werden die Adapter angeschlossen, die 3' und 5'. Nach Ligation von Adaptern wurde eine reverse Transkriptionsreaktion durchgeführt, um cDNA zu erzeugen. Sie wurde dann durch eine Standard-PCR-Reaktion amplifiziert, die Primer verwendet, die einen Sequenzindex zur Probenidentifizierung enthalten – diese cDNA-Bibliothek, die einer Agarose-Gelelektrophorese zur miRNA-Isolierung unterzogen wurde. Nach der Quantifizierung wurde die Bibliothekskonzentration mit 10 nM Tris-HCl, pH 8,5, auf 2 nM normalisiert, und die Transkriptomsequenzierung wurde mit dem MiSeq Reagent Kit v2 (50 Zyklen) durchgeführt.

Die Datenanalyse wurde in Zusammenarbeit mit Tao Chen, Ph.D. von der Abteilung für genetische und molekulare Toxikologie, National Center for Toxicological Research, Jefferson, AR, USA. Die Daten aus Next Generation Sequencing (NGS) von miRNAs wurden im FASTA-Format generiert und in BaseSpace.com (Illumina, USA) importiert. Die Datenqualität wurde mit der vom Hersteller (Illumina) entwickelten Software Base Calling CASAVA evaluiert. Die Analysen wurden durch BaseSpace miRNA Analysis (von der University of Turin, Kanada) und die Sequenzkartierung verschiedener miRNAs durch Small RNA (Illumina, USA) für das Rattengenom durchgeführt. Die differentiell exprimierte miRNA-Studie wurde mit der Ingenuity Pathway Analysis Software (Ingenuity, USA) analysiert.

miRNA-ExpressionsvalidierungFür die miRNA (miR{{0}}p, -144-3p, -298-5p, let-7a{{ 4}}p, -181a-5p, -181c-3p und -199a-5p) Ausdrucksanalyse. Kurz gesagt, 450 ng RNA wurden ohne Voramplifikation unter Verwendung des TaqMan1 Micro RNA Reverse Transcription Kit gemäß den Richtlinien des Herstellers revers transkribiert. Komplementäre DNA (cDNA) wurde unter Verwendung von TaqMan MicroRNA Assays (Life Technologies, USA) mit TaqMan1 Universal PCR Master Mix, No AmpErase1 UNG (2x) auf dem StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied BiosystemsTM) gemäß den Anweisungen des Herstellers amplifiziert. Die Datenanalyse wurde unter Verwendung der relativen Genexpression durchgeführt, die unter Verwendung der vergleichenden Quantifizierungsmethode (Pfaffl, 2001) bewertet wurde. Basierend auf der Stabilitätsanalyse wurden die U6-snRNA und die U87-scaRNA als Referenzgen verwendet. Alle relativen Quantifizierungen wurden unter Verwendung der DataAssist-Software, v 3.0, unter Verwendung der ΔΔCT-Methode ausgewertet. miRNA-Daten wurden gemäß den MIQE-Richtlinien generiert [31].

CISTANCHE WIRD DIE NIEREN-/NIERENFUNKTION VERBESSERN

RT-qPCR vorhergesagter ZielgeneFür die cDNA-Synthese wurde das High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, USA) verwendet. Die RT-qPCR-Reaktionen für Bax, Bim, Caspase-3, Collagen 1, GDNF, PCNA, TGF -1, Bcl-2, Bcl-6, c-Myc, c -ret, Cyclin A, Map2k2, PRDM1, Six-2, Ki-67, MTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2, NOTCH1 und das IGF1-Gen wurden von SYBR Green Master Mix (Life Technologies, USA) durchgeführt ), bereitgestellt von IDT1 Integrated DNA Technologies (Tabelle 1). Die Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 20 μl unter Verwendung von 2 μl cDNA (1:30 verdünnt), 10 μl SYBER Green Master Mix (Life Technologies, USA) und 4 μl jedes spezifischen Primers (5 nM) durchgeführt. Amplifikation und Nachweis wurden mit dem StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied BiosystemsTM) durchgeführt. Ct-Werte wurden unter Verwendung der ΔΔCt-Methode mit Nachkommen-Metanephros-Daten, die mit GAPDH als Referenzgen normalisiert wurden, in relative Expressionswerte umgewandelt [32].

Immunhistochemie,Der Fötus (n {{0}} pro Gruppe) wurde entfernt und sofort in 4 % Paraformaldehyd (0,1 M Phosphat, pH 7,4) fixiert. Die Materialien wurden dehydriert, diaphanisiert und in Paraplast eingeschlossen, und die Blöcke wurden in Abschnitte mit einer Dicke von 5- μm geschnitten. Histologische Schnitte wurden entparaffiniert und für Immunfluoreszenz und Immunoperoxidase verarbeitet. Die Abschnitte waren

mit einer Blockierungslösung (8 Prozent fötales Rinderserum, 2,5 Prozent Rinderalbumin und 2 Prozent Magermilchpulver in PBS) inkubiert. Anschließend mit dem primären Antikörper (Anti-Six-2), verdünnt in PBS mit 1 % Magermilch, über Nacht im Kühlschrank fixieren. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Schnitte mit einem spezifischen Sekundärantikörper, der mit dem Fluorophor Alexa 488 konjugiert und im gleichen Puffer mit 1 Prozent Milch verdünnt war, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach aufeinanderfolgenden Waschungen mit PBS wurden die Objektträger mit Deckgläsern unter Verwendung des fluoreszierenden Montagemediums Vectashield (Vector Laboratories, Inc. Burlingame) befestigt. Die Fluoreszenz in der Probe wurde durch konfokale Lasermikroskopie nachgewiesen. Die Bilder wurden unter Verwendung des Focus Imagecorder Plus-Systems erhalten. Für die Proteine ​​c-Myc, Ki-67, Bcl-2, TGF -1, -catenin, ZEB1, ZEB2, Caspase 3 gespalten, Cyclin A und WT1 wurde eine Immunhistochemie durchgeführt. Die Objektträger wurden hydratisiert und nach 5-minütigem Waschen in PBS, pH 7,2, wurde die antigene Rückgewinnung mit Citratpuffer, pH 6,0 für 25 Minuten im Schnellkochtopf durchgeführt. Die Objektträger wurden in PBS gewaschen. Anschließend wurde eine endogene Peroxidase-Blockade mit Wasserstoffperoxid und Methanol für 10 Minuten im Dunkeln durchgeführt. Die Schnitte wurden erneut in PBS gewaschen. Dann folgte die Blockierung der unspezifischen Bindung, und die Objektträger wurden mit einer Blockierungslösung (5 % Magermilchpulver in PBS) für 1 Stunde inkubiert. Die Schnitte wurden mit dem primären Antikörper (Tabelle 2), verdünnt in 1 Prozent BSA, über Nacht im Kühlschrank inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Schnitte 2 Stunden lang bei Raumtemperatur dem spezifischen sekundären Antikörper ausgesetzt. Die Objektträger wurden mit PBS gewaschen. Die Schnitte wurden mit DAB (3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid, Sigma – Aldrich CO1, USA) freigelegt. Nach sukzessivem Waschen in fließendem Wasser wurden die Objektträger mit Hämatoxylin gegengefärbt, dehydriert und mit einem Deckglas unter Verwendung von Entellan1 fixiert. Die Bilder wurden unter Verwendung des Fotomikroskops (Olympus BX51) oder eines konfokalen Zeiss LSM 780- NLO auf einem Axio Observer Z.1-Mikroskop (Carl Zeiss AG, Deutschland) vom National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell erhalten Biologie (INFABIC) an der Staatlichen Universität Campinas.

Morphologische QuantifizierungParaffin 5 μmNiereSchnitte wurden unter Verwendung der CellSens Dimension-Software von einem Fotomikroskop (Olympus BX51) analysiert. DasNiereAuf die Schnitte wurde zugegriffen, um den nephrogenen Bereich, CM- und UB-Protein und Zellzahl, Hämatoxylin-Eosin-Färbung in 17-DG LP-Föten (n=5) im Vergleich zu gleichaltrigen NP-Nachkommen (n {{4 }}) von verschiedenen Müttern. Wir quantifizierten alle CM und UB jedes analysierten Metanephros (4NP und 4LP von verschiedenen Müttern), und eine statistische Analyse wurde durch einen t-Test durchgeführt, und die Werte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Der p�0.05 wurde als signifikant angesehen. GraphPad Prism v01 Software, Inc., USA, wurde für die statistische Analyse und Abbildungskonstruktion verwendet.

statistische AnalyseDer t-Test wurde verwendet, und die Werte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. P�0.05 wurde als signifikant angesehen. GraphPad Prisma v. 01-Software (GraphPad Software, Inc., USA) wurde für die statistische Analyse und Figurenkonstruktion verwendet.

Ergebnisse

Expression von miRNAs durch miRNA-SeqVerständnis der mikroRNA-Veränderungen im Zusammenhang mit mütterlichem niedrigem ProteingehaltNieren-Programmierung führten wir den Ausdruck einer globalen miRNA-Profilanalyse durch. Es wurden 44 deregulierte miRNAs (p=0,05) identifiziert, von denen 19 bzw. 25 miRNAs herauf- oder herunterreguliert waren (Tabelle 3). Die am stärksten exprimierten miRNAs und ihre Funktionen, Wege und Netzwerke wurden mit Ingenuity Software identifiziert (Tabelle 4).

Validierung der miRNA-ExpressionBei den Tieren der LP-Gruppe waren Let-7a-5p, miR-181a-5p, miR-181c-3p hochreguliert, während miR-127-3p, miR-144-3p und miR-199a-5p im Vergleich zu NP-Tieren herunterreguliert waren. Die Ergebnisse zeigen keinen Unterschied in der miR-298-Expression, wenn man beide Gruppen vergleicht (Abb. 1). Tabelle 5 zeigt die Werte, die durch miRNAs-Sequenzierung mit den RT-qPCR-Validierungsdaten erhalten wurden. Obwohl bei LP im Vergleich zu NP-Nachkommen ein signifikanter Unterschied in der miRNA-Expression beobachtet wurde, war die Faltungsänderung (Fold Change, FC) der validierten miRNAs bei beiden Techniken ähnlich.

miRNA-Genziele

Die Expressionsgene vorhergesagter Ziele verschiedener miRNA wie Six-2, Bcl-2, PRDM1, Cyclin A, PCNA, GDNF, Collagen 1, Caspase 3 und Bim in LP unterschieden sich nicht signifikant von NP Fötus. Die Genexpression von Bax, TGF -1 Bcl-6, c-ret, Map2k2, Ki-67, mTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2 und IGF1 war jedoch im {{15 }}DG LP-Gruppe im Vergleich zu altersangepassten Kontrollen. Umgekehrt waren c-Myc und NOTHC1 bei mütterlichen proteinbeschränkten Nachkommen herunterreguliert (Abb. 2).

Körpermasse des Fötus und Metanephros-MorphometrieDie Körpermasse von 17-DG LP unterschied sich nicht von den gleichaltrigen NP-Nachkommen. Das Metanephros-Mesenchym von LP zeigte jedoch eine um 7,6 Prozent reduzierte Fläche und eine um 29 Prozent reduzierte Kortexdicke als die NP-Gruppe (Abb. 3).ImmunhistochemieIn der vorliegenden Studie zeigte der LP-Fötus eine signifikante Verringerung (etwa 69 Prozent) der Six-2-Cap-Fluoreszenz als die NP-Nachkommen (Fig. 4).

Die Six-2-Immunoperoxidase-Analyse zeigte eine reduzierte Zellzahl (14 Prozent) in LP CM von assoziiert mit 28 Prozent reduzierten Six-2-plus-Zellen relativ zur Kappenfläche im Vergleich zu NP-Nachkommen (Fig. 4). Die vorliegende Studie zeigte auch eine signifikante prozentuale Reduktion von c-Myc CM- und UB-immungefärbten Zellen (weniger als 14 Prozent) bei LP im Vergleich zu NP-Nachkommen (Abb. 4). Außerdem war der Prozentsatz der Ki-67-markierten Fläche in CM bei LP-Föten um 48 Prozent geringer als bei NP-Föten, während Bcl-2- und gespaltene Caspase-3-Immunreaktivität sich nicht von beiden Gruppen unterschieden (Abb 5 und 6). Die vorliegende Studie zeigte auch eine signifikante prozentuale Reduktion von c-Myc CM- und UB-immungefärbten Zellen (weniger als 14 Prozent) bei LP im Vergleich zu NP-Nachkommen (Abb. 4). Außerdem war der Prozentsatz der Ki-67-markierten Fläche in CM um 48 Prozent geringer in LP im Vergleich zu NP-Föten, während die Immunreaktivität von Bcl-2 und gespaltener Caspase-3 sich nicht von beiden Gruppen unterschied (Abb 5 und 6). Andererseits waren bei LP die mit CM und UB-Catenin markierten Bereiche um 154 bzw. 85 Prozent erhöht, verglichen mit denen, die bei NP-Nachkommen verfügbar waren ( 7 ). Gleichzeitig nahm die Verteilung der mTOR-Immunreaktivität bei LP CM (139 Prozent) und UB (104 Prozent) auch einen signifikant größeren Bereich ein als beim NP-Fötus (Abb. 7). Bei den LP-Nachkommen war die TGF--1-Färbung in den UBS-Zellen erhöht (etwa 30 Prozent), während bei den CM-Zellen die immungefärbten Zellen sich nicht von der NP-Gruppe unterschieden (Fig. 8). Die ZEB1-Metanephros-gefärbten, in den CM-Kernzellen lokalisierten Zellen erhöhten LP im Vergleich zum NP-Fötus um 30 Prozent (Fig. 8). Gleichzeitig war die ZEB2-Immunfluoreszenz, obwohl sie in ganzen Metanephros-Strukturen vorhanden war, in beiden Versuchsgruppen ähnlich (Fig. 8). Die aktuelle Studie berücksichtigt miRNA- und mRNA-Expression und Proteine

Diskussion

Das Wissen über zelluläre und molekulare Mechanismen der Nephrogenese hat zugenommen [33–37]. Allerdings sind viele regulatorische Faktoren und Signalwege daran beteiligtNieren-Ontogenese bleiben unklar [38]. miRNAs spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Genexpression währendNieren-Entwicklung [25, 39–41]. Nach unserem Wissen wurden keine miRNA- und mRNA-Expressionsanalysen in mütterlichen LP-Aufnahme-17-männlichen DG-Mesenchymzellen durchgeführt. Wir schlagen einen neuen molekularen Mechanismus vor, der an der Hemmung der frühen Nephrogenese beteiligt ist, was zu einer reduzierten Anzahl von Nephronen führt. Wir verwendeten NGS, um die miRNA-Expression zu bewerten, und fanden heraus, dass 19 miRNAs in 17- DG LP im Vergleich zu NP-Metanephros hoch- und 25 herunterreguliert waren. Unter den Top 10 der deregulierten miRNAs haben wir 7 miRNAs mit biologischen Zielen ausgewählt, die an Proliferation, Differenzierung und zellulärer Apoptose beteiligt sind. Sowohl die miRNA-Seq- als auch die TaqMan-Datenanalyse zeigten konsistente und spezifische Veränderungen in der miRNA-Expression bei LP-Tieren im Vergleich zu altersangepassten Kontroll-NP-Tieren.

Die miR-181-Familie besteht aus vier hochkonservierten Mitgliedern, nämlich miR-181a, miR-181b, miR-181c und miR-181d [ 42]. In neoplastischen Zellen wirkt miR-181a als Tumorsuppressor, indem es die Zellproliferation und -migration hemmt und die Zellapoptose induziert [43]. Diese Studie zeigte eine erhöhte Expression von miR-181a-5p in 17-DG LP im Vergleich zu gleichaltrigen NP-Nachkommen. Obwohl die Caspase-mRNA-Expression unverändert war, deutet ein zweifacher Anstieg des Bax/Bcl-2-mRNA-Verhältnisses in LP im Vergleich zu NP-Nachkommen auf eine erhöhte Apoptose in der CM hin, was darauf hinweist, dass die Apoptose posttranskriptional reguliert wird. Studien haben gezeigt, dass die BCL-Familie die Freisetzung von Cytochrom aus den Mitochondrien fördert und dann die Aktivierung von Casp3 hemmt, wodurch die zelluläre Apoptose gehemmt wird [44]. Liet al. verwendeten ein akutes Lungenverletzungsmodell, um zu zeigen, dass überexprimiertes miR-181a mit einem verringerten Bcl-2-Proteinspiegel zusammenhängt; umgekehrt erhöhte die miR-181a-Hemmung die Bcl-2-Spiegel [45]. Diese Studie bestätigte die Ergebnisse von Lv et al., die zeigten, dass miR-181c die Expression von Six-2 und die Zellproliferation negativ reguliert, parallel zum Verlust des mesenchymalen Zellphänotyps währendNiereEntwicklung bei LP-17-DG-Nachkommen [25].

Xianget al. gezeigt, dass eine erhöhte miR-144-Expression unterdrücktNieren-Karzinomproliferation, was zu einer kürzeren G2/M-Phase führt. Darüber hinaus haben Xiang et al. zeigten, dass eine Überexpression von miR-144 die mTOR-Gen- und Proteinexpression hemmt [46]. Nijlandet al. zeigten, dass eine Erhöhung der mTOR-Signalgebung entscheidend für die Bestimmung der Anzahl von Nephronen in Embryonen ist, deren Mütter einer Nährstoffrestriktion unterzogen wurden [47]. Säugetier-Target des Rapamycin-Komplexes 1 (mTORC1) ist essentiell für die Embryonalentwicklung; wie dieser Komplex das Gleichgewicht zwischen Wachstum und Autophagie unter physiologischen Bedingungen und Umweltstress reguliert, ist jedoch unbekannt [48]. Daher kann die mTOR-Signalgebung an zellulären Reaktionen bei Tieren beteiligt sein, die während der Trächtigkeit einer LP-Aufnahme ausgesetzt waren; bei der Wahrnehmung, Induktion und Beendigung der Autophagie; und als Reaktion auf die intrazelluläre Nährstoffverfügbarkeit [46]. Hypothetisch kann während einer schweren Proteinrestriktion eine reduzierte Expression von miR-144-3p mit einer erhöhten mTOR-Expression einhergehen, etwa 139 Prozent bzw. 104 Prozent in CM-Zellen und UB, um den Verlust von Nephronen in den {{ 11}}DG LP-Nachkommen Chen et al. definierten miR-127 als einen neuen Regulator der Zellseneszenz durch Bcl-6 [49]. Panet al. berichteten, dass eine Unterexpression von miR-127 mit einer erhöhten Zellproliferation in Leberzellen korreliert [50]. Diese Studie zeigte eine Abnahme der Zellproliferation und eine signifikante Reduktion von Zellen, die positiv für Ki-67 markiert waren, im CM von proteineingeschränkten Tieren. Darüber hinaus wurde eine Verringerung der nephrogenen Fläche und Proliferation bei LP-Nachkommen beobachtet, was mit den Ergebnissen von Menendez-Castro et al. bei 8,4 Prozent proteinbeschränkter Nachkommenschaft [51, 52]. Somit könnte eine erhöhte Ki-67- und Bcl-6-mRNA-Expression, begleitet von einer verringerten miR-127-3p-Expression in der 17-DG LP-Kappe, mit aufrechtzuerhaltenden Gegenregulationsmechanismen in Verbindung gebracht werden Proliferation.

Sunet al. zeigten, dass die Überexpression von miR-199a-5p die zystische Zellproliferation reduziert und Apoptose induziert, zusätzlich zur Kontrolle des Zellzyklus [53]. In dieser Studie ist die Expression von miR-199a-5p in 17-DG reduziert. LP wird von einer erhöhten Transkription von Ki-67, einem Zellproliferationsmarker, und Map2k2 begleitet ist mit einer verringerten Ki-67-Reaktivität bei LP 17-DG-Metanephros verbunden. Somit fördert die Schwangerschaftsunterernährung die Differenzierung durch einen posttranskriptionellen Mechanismus. Bemerkenswerterweise zeigen unsere Ergebnisse eine repressive Rolle der Zinkfinger-E-Box-bindenden Homöobox 1 (ZEB1), einem EMT-Induktor, der die Pluripotenz der Stammzellen während der embryonalen Stammzelldifferenzierung aufrechterhält. -Catenin ist dafür bekannt, dass es die nukleäre ZEB1-Transkription aktiviert, was zu einer ZEB1-Expression führt [34]. Der TGF-Signalweg, einer der am besten untersuchten Wege, kann EMT während der Embryonalentwicklung induzieren. Mehrere TGF-ähnliche Liganden sind für die embryonale Entwicklung erforderlich. Jedoch hängen nicht alle TGF -vermittelten Wirkungen auf EMT von ZEB1/2 ab, Knockout-Zellen können die Expression der mesenchymalen Gene Fibronectin und N-Cadherin induzieren. Allerdings wird E-Cadherin nicht mehr herunterreguliert und es werden auch Aktinfasern gebildet [54]. Karneret al. berichtete das währendNieren-Entwicklung, das Wnt9b/-catenin

Der Signalweg, der sowohl in UB als auch in CM exprimiert wird, ist sowohl für die Erneuerung als auch für die Differenzierung von Nephron-Vorläuferzellen erforderlich, da er für die Bildung von Nephronen während der Embryogenese unerlässlich ist [55]. Der evolutionär konservierte Wnt9b/-catenin-Weg spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Organen, Geweben und der Reparatur von Verletzungen in vielzelligen Organismen. Eine Studie zeigte, dass c-Myc ein Transkriptionsziel von -catenin ist, das die Proliferation und Differenzierung vonNieren-tubuläres Epithel [56]. Die Expression von -catenin auf Gen- und Proteinebene nahm während der untersuchten Zeiträume von zuNieren-Entwicklung beim 17-DG LP-Fötus. Panet al. berichteten, dass Myc mit -catenin kooperiert, um die Erneuerung von Nephron-Vorläuferzellen zu fördern [10]. Hier zeigte LP im Vergleich zu gleichaltrigen NP-Nachkommen eine geringere c-Myc-Expression. Daher haben diese Tiere möglicherweise eine geringere Reserve an erneuerbaren Zellen, die für die Proliferation und das Überleben erforderlich sind, und können die geringere Anzahl von Nephronen im LP-Modell widerspiegeln. Darüber hinaus,

Wnt/-catenin- und Notch-Signalwege können die Regulation der Six-2-Expression koordinieren und sind an der Herunterregulierung der Six-2-Expression in Nephron-Vorläuferzellen beteiligt. Studien haben gezeigt, dass niedrige Mengen an -catenin erforderlich sein könnten, um die Six-2-Expression und CM-Vorläuferzellen im undifferenzierten Zustand zu halten; darüber hinaus bestimmen erhöhte Spiegel von -Catenin das Schicksal der Nephron-Vorläuferzellen [57, 58]. Daher stellen wir die Hypothese auf, dass eine reduzierte cMyc- und Notch-Signalgebung, begleitet von einer erhöhten -catenin-Expression, die Six-2-Expression um 28 % bei 17-DG LP-Nachkommen reduzierte und mit einer frühen CM-Zelldifferenzierung und einer reduzierten Stammzell- und Stammzelldifferenzierung korrelierte Nephronzahl im Erwachsenenalter. Darüber hinaus können unsere Daten bestätigen, dass in MM-Zellen der LP-Nachkommen die erhöhte Let-7a-5p- und -catenin-Expression und das reduzierte Notch-Signal c-Myc, Six-2 modulieren können, und Ki-67-Expression, was zu einer Verringerung der Selbsterneuerung von Vorläuferzellen führt. Die Depletion der verbleibenden CM-Vorläuferzellen führt zu einer Verringerung der Nephronzahlen und der Entwicklung einer arteriellen Hypertonie undNieren-Störungen im Erwachsenenalter (Abb. 10). In Übereinstimmung mit denen von Boivin et al. zeigen unsere Ergebnisse, dass erhöhtes CM-Catenin das UB-Wachstum und die Nephrogenese stört [59]. Studien haben gezeigt, dass der Glia-abgeleitete neurotrophe Faktor des Wachstumsfaktors (GDNF), ein entscheidender Regulator des UB-Wachstums, Signale durch den c-Ret-Tyrosinkinaserezeptor und den Gfra1-Korezeptor sendet [60, 61]. In 17-DG LP-Nachkommen, ein bedeutender

eine Erhöhung der mRNA, die den c-Ret-Rezeptor codiert, würde theoretisch zu einem Anstieg des UB-Wachstums führen. In dieser Studie war die GDNF-Expression jedoch unverändert, was darauf hindeutet, dass trotz eines Anstiegs der cRet-mRNA die UB-Verzweigung reduziert war. Zuvor beobachteten wir eine Reduktion der Harnleiterknospenzweige um 28,3 Prozent nach 14,5 Tagen Trächtigkeitsproteinrestriktion [4], was mit einer 28-prozentigen Reduktion der Six-2-Markierung von MM-Zellen trotz unveränderter GDNF assoziiert sein könnte Transkription. -Catenin interagiert wahrscheinlich mit dem c-ret-Rezeptor und wird zum Kern der UB-Zelle transportiert, fördert die TGF--1-Expression in Epithelzellen, hemmt die UB-Verzweigung und verursacht eine vorzeitige Differenzierung der CM-Vorläuferzelle, wie in {{11} }DG LP-Nachkommen [62–64]. Daher ist GDNF bei der Vermittlung von mesenchymalen Signalen an die Ureterknospe möglicherweise nicht wesentlich; Der Mechanismus muss jedoch noch aufgeklärt werden. Tatsächlich haben wir gezeigt, dass MM von 17-DG LP-Nachkommen eine spezifische Zunahme der miRNA-Expression von Let-7 zeigte, was zu einer signifikanten Beeinträchtigung führteNiereEntwicklung, wodurch die modulatorische Rolle dieser Gene im Entwicklungstiming der Nephrogenese bestätigt wird [65].

In ersten Studien zum insulinähnlichen Wachstumsfaktor (IGF) wurde die vorherrschende Rolle von IGF-1 und -2 beim fötalen Wachstum durch zahlreiche, aber meist indirekte Beweise aufgeklärt. Es wurde festgestellt, dass IGFs als Proliferations- und Differenzierungsfaktoren in kultivierten fötalen Zellen und Präimplantationsembryos wirken. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass IGFs von kultivierten fötalen Zellen und Explantaten in vitro sezerniert werden [66]. Wachstumsfaktoren, einschließlich IGF, können einen teilweisen oder vollständigen epithelial-mesenchymalen Übergang bewirken. Die Aktivierung von IGF-Wegen führt zur Hochregulierung von EMT durch Induktion der ZEB1-Expression [67]. Obwohl mehrere Kandidaten für Wachstumsfaktoren beteiligt sindNiereEntwicklung, ob sie an der Nephrogenese beteiligt sind, ist unbekannt. Unterschiedliche Wachstumsfaktoren können zu unterschiedlichen Zeiten erforderlich sein. Einige Wachstumsfaktoren können in diesem Zusammenhang überflüssig sein. Während der Embryonalentwicklung sind aufeinanderfolgende Runden von EMT und MET erforderlich, um spezialisierte Zelltypen zu differenzieren und eine dreidimensionale Struktur zu schaffen. In dieser Studie wurde festgestellt, dass die mesenchymal-epitheliale Interkonvertibilität die Zellplastizität aufrechterhält, was auf das Vorhandensein eines hochgradig induzierbaren Systems unter LP-Bedingungen für den Embryo hindeutet. Die Expression der Let-7-miRNA-Familie wurde ausgiebig in verschiedenen fötalen Geweben untersucht. Der Anstieg der Let-7-miRNA-Expression steht im Zusammenhang mit einer verringerten Proliferation und einem frühen Anstieg der MM-Zelldifferenzierung und folglich einer verringerten Nephronzahl [27, 15, 68–71]. Eine höhere Let-7-Expression wurde in höheren Organismen während der letzten Phase der zerebralen Embryogenese bei Nagetieren nachgewiesen [72, 73]. Nagalakshmi et al. zeigten, dass die Let-7-miRNA-Expression das Schicksal der UB-Epithelzellen vom Vorläufer- zum differenzierten Zustand veränderte [71]. Im Gegensatz dazu haben Yermalovich et al. zeigten, dass die Überexpression von Lin28b, einem RNA-bindenden Protein, mit unterdrückenden Let-7-miRNAs assoziiert ist. Obwohl lin28 und Let-7 bekannte Regulatoren des ontogenetischen Timings bei Wirbellosen sind, ist ihre Rolle bei der Entwicklung von Säugetierorganen nicht verstanden [65]. In dieser Studie könnte die Zunahme der miRNA-Expression von Let-7a-5p im LP-Fötus mit einer verringerten CM-Zellproliferation in Verbindung gebracht werden, was die Nephrogenese im Vergleich zur NP-Gruppe beeinträchtigt. Daher stellen wir die Hypothese auf, dass die Unterdrückung der CM-Zellproliferation und die frühe Beendigung der Nephrogenese, die durch erhöhte Let-7-miRNA verursacht werden, direkt oder indirekt durch die vorübergehend reduzierte Expression von Lin28b in 17-DG LP auftreten können. Dieser Effekt kann erheblich beeinträchtigenNiereEntwicklung in 17-DG LP, was bestätigt, dass dieses Gen das Entwicklungstiming während der Nephrogenese reguliert. In dieser Studie fällt eine erhöhte Let-7a-5p-miRNA-Expression mit einer Abnahme der c-Myc-Expression zusammen. Myc ist währenddessen an Proliferation, Wachstum, Apoptose und Zelldifferenzierung beteiligtNieren-Organogenese [74–76]. Bei den LP-17-DG-Nachkommen war die MM-c-Myc-Genexpression verringert, und die Fläche der CM-c-Myc-Immunreaktivität war um 14 Prozent kleiner im Vergleich zu der bei den NP-Nachkommen. Gleichzeitig wurde eine 14-prozentige Abnahme der CM-Zellzahl beobachtet, um 48-prozentige Ki-67-Immunoreaktivität in LP relativ zu den NP-Nachkommen zu verringern. Übereinstimmend haben Studien gezeigt, dass c-Myc eine wichtige Rolle in der Endphase der UB-Verzweigung und bei der Stimulierung der Proliferation von CM-Vorläuferzellen spielt [74].

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENINFEKTIONEN VERBESSERN

reduziertes Niveau in Stammzellen, wodurch sie in einem undifferenzierten Zustand gehalten werden. In dieser Studie jedoch regulierte die starke Expression von Let-7a-5p-miRNA im CM die c-Myc-Expression herunter, wodurch die Proliferation von Vorläuferzellen und die frühe Zelldifferenzierung im LP 17-DG verringert wurden Nachkommen (Abb. 10). Studien zurNierenvon c-Myc-transgenen Mäusen zeigten eine gleichzeitige Abnahme von c-Myc- und S-ix-2-immunpositiven CM-Zellen, die mit einer reduzierten Stammzellproliferation assoziiert waren [74]. Diese Studie zeigt eine signifikante (28 Prozent) Verringerung von Six-2-positiven Zellen, einer bestimmtenNieren-Stammzellmarker, wie die beobachtete Abnahme der Nephronzahlen, im CM der 17-DG LP-Nachkommen im Vergleich zu den NP-Nachkommen. 2009 haben Fogelgren et al. zeigten, dass die Six-2-Genexpression während der fötalen Ontogenese reduziert ist, wenn sie mit einer verringerten Anzahl von Nephronen, Bluthochdruck und chronischem Bluthochdruck einhergehtNierenversagen[77]. Somit zeigt eine reduzierte Six-2-Genexpression in CM-Vorläuferzellen eine Unterdrückung der signalinduzierten Differenzierung während anNieren-Entwicklung in den 17-DG LP-Nachkommen. Dennoch sollte Redundanz mit Vorsicht verwendet werden – subtile Defekte in der Nephrogenese können bei einer detaillierteren Analyse oder unter anderen Bedingungen offensichtlich werden. Die IGF1-mRNA-Spiegel waren während der Anfangsphase der metanephrischen Entwicklung am höchsten, wobei Transkripte während des gesamten MM nachgewiesen wurden, während ihre Spiegel während der weiteren Entwicklung abnahmen. Allerdings währendNiereEmbryogenese reguliert ein empfindliches Gleichgewicht zwischen nephronfördernden Wachstumsfaktoren (IGF1) und hemmenden Wachstumsfaktoren (TGF -1) die UB-Verzweigung.

Fazit

Obwohl mehrere Autoren die Nephrogenese untersucht haben [34, 37, 78], ist wenig über die Mechanismen bekannt, die die Anzahl der Nephrone bestimmen. Diese Studie zeigt, dass viele MM-Vorläuferzell-miRNAs, -mRNAs und -Proteine ​​in den 17-DG LP-Nachkommen verändert sind, was zu einer verringerten Proliferation und frühen Zelldifferenzierung führt (Abb. 11). Dieses empfindliche Gleichgewicht zwischen Nephron-Vorläufer-Erneuerung und -Differenzierung ist wesentlich fürNiereEntwicklung, da das Versagen, eine ausreichende Anzahl von Nephronen zu erreichen, ein Risikofaktor für chronische istNieren-Störung.