Auswirkungen einer hohen Salzaufnahme auf ein natürliches Darmökosystem bei Wildlingsmäusen

Abstrakt: Der Holobiont von Säugetieren beherbergt eine komplexe und voneinander abhängige wechselseitige Darmbakteriengemeinschaft. Es ist bekannt, dass Veränderungen in der Zusammensetzung dieses Bakterienkonsortiums ein Schlüsselelement für die Gesundheit, Immunität und Krankheit des Wirts sind. Neben vielen anderen Faktoren sind Ernährungsgewohnheiten ausschlaggebende Faktoren für eine mögliche Störung der gegenseitigen Interaktion zwischen Bakterien und Wirt. In diesem Zusammenhang haben wir zuvor gezeigt, dass eine salzreiche Ernährung (HSD) zu einem dysbiotischen Zustand der Darmmikrobiota der Maus führt, der durch eine Abnahme oder Erschöpfung bekannter gesundheitsfördernder Darmbakterien gekennzeichnet ist. Allerdings besitzen konventionelle Labormäuse (CLM) aufgrund einer kontrollierten und desinfizierten Umgebung im Vergleich zu Wildmäusen eine weniger vielfältige Darmmikrobiota, was zu schlechten translationalen Ergebnissen für Darmmikrobiomstudien führt, da eine verringerte Diversität der Darmmikrobiota möglicherweise nicht in der Lage ist, die komplexe Wechselwirkung abzubilden Netzwerke des Mikrobioms. Hier untersuchten wir den HSD-Effekt auf die Darmmikrobiota bei CLM im Vergleich zu Wildlingsmäusen, die ein natürliches Darmökosystem beherbergen, das der Situation beim Menschen eher nachahmt. Mäuse wurden entweder mit Kontrollfutter oder HSD behandelt und die Darmmikrobiota wurde mithilfe von Amplikon-basierten Methoden, die auf das ribosomale 16S-Gen abzielen, profiliert. Im Einklang mit früheren Erkenntnissen zeigten unsere Ergebnisse, dass HSD einen signifikanten Verlust der Alpha-Diversität und eine umfassende Modulation der Darmmikrobiota-Zusammensetzung bei CLM verursachte, was durch die Abnahme potenziell nützlicher Bakterien aus dem Firmicutes-Stamm wie den Gattungen Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, Anaerovorax und gekennzeichnet ist Zunahme von Akkermansia und Parasutterella. HSD-behandelte Wildlingsmäuse zeigten jedoch nicht die gleichen Veränderungen in Bezug auf Alpha-Diversität und Verlust von Firmicutes-Bakterien wie CLM, und ganz allgemein zeigten Wildlinge nach HSD nur geringfügige Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota. In Übereinstimmung damit deutete die 16S-basierte Funktionsanalyse nur auf größere Verschiebungen der ökologischen Funktionen der Darmmikrobiota bei CLM im Vergleich zu Wildlingsmäusen bei HSD hin. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass reichhaltigere und aus der Wildnis stammende Darmmikrobiota resistenter gegen diätetische Eingriffe wie HSD sind als Darmmikrobiota von CLM, was wichtige Auswirkungen auf die zukünftige translationale Mikrobiomforschung haben könnte.

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Schlüsselwörter: Mikrobiom; salzreiche Ernährung; Immunität; Wildling

1. Einleitung

Der Darm von Säugetieren wird von einer komplexen und vielfältigen Bakteriengemeinschaft besiedelt, die zusammen mit dem Wirt eine empfindliche symbiotische Beziehung eingeht [1,2]. Diese Bakteriengemeinschaft übt viele für den Wirt nützliche Funktionen aus, darunter metabolische, immunmodulierende und trophische Funktionen [3–7], und die Zusammensetzung der Darmmikrobiota kann sich im Laufe des Lebens entsprechend den spezifischen Bedürfnissen und der Physiologie des Wirts ändern [1,8, 9]. Viele vorteilhafte Funktionen von Bakterien, die die Darmgesundheit fördern, werden durch Metaboliten aus der anaeroben Fermentation vermittelt [10–13] und dysbiotische Zustände können die Gesundheit des Wirts erheblich beeinträchtigen [2,11,14,15]. Die wachsende Besorgnis über die Auswirkungen des Lebensstils auf die Gesundheit hat zu einem erhöhten wissenschaftlichen Interesse an der Beteiligung von Darmmikrobiota und ihren translationalen Auswirkungen geführt [16,17]. Tatsächlich wird die Darmmikrobiota sowohl durch extrinsische (z. B. Lebensstil, Ernährung und medizinische Behandlungen) als auch intrinsische (z. B. Wirtsgenetik, Immun- und Stoffwechselregulationen) Faktoren geprägt [8,18–20]. Es ist allgemein anerkannt, dass extrinsische Elemente wirkungsvolle Effekte hervorrufen können, wobei die Ernährung einer der Hauptfaktoren für die Beeinflussung der Zusammensetzung und Funktion der Darmmikrobiota ist [1,2,21]. Es ist bekannt, dass westliche Nahrungsbestandteile wie eine hohe Salzaufnahme die Homöostase des Wirts beeinträchtigen, indem sie das Immunsystem beeinträchtigen und die Darmmikrobiota verändern und Krankheiten verursachen [18,22–37]. In der Darmmikrobiota von Mäusen ist eine salzreiche Ernährung (HSD) mit der Reduzierung gesundheitsfördernder Bakterien verbunden, die bekanntermaßen als Produzenten kurzkettiger Fettsäuren (SCFA) bekannt sind, wie Lactobacillus spp., Bifidobacterium, Blautia und Faecalibaculum [28, 29,38–41], neben einer Zunahme der Häufigkeit von Akkermansia, einem weiteren opportunistischen SCFA-Produzenten, der in verschiedenen Modellsystemen nachweislich die Immunität und Krankheit des Wirts beeinflusst [42,43]. Maustiermodelle werden häufig verwendet, um zu untersuchen, wie Ernährungsfaktoren die Darmmikrobiota, das Immunsystem und Krankheiten beeinflussen können [29,44–46]. Obwohl die Verwendung konventioneller Labormäuse (CLM) für viele Studien immer noch eine gültige Option ist, gelingt es ihr manchmal nicht, Anwendungen, die sich auf Darmmikrobiota konzentrieren, richtig umzusetzen [47–49]. Beispielsweise wurde gezeigt, dass immunologische und metabolomische Untersuchungen an Mausmodellen für entzündliche Darmerkrankungen (IBD) und Fettleibigkeit die translationalen Ergebnisse von Darmmikrobiota-Studien nur schlecht vorhersagen können [50]. Dies könnte auf viele inhärente Unterschiede in diesen Modellsystemen zurückzuführen sein, wie z. B. unterschiedliche Darmanatomie, Genetik und Physiologie [16,50]. Ein weiteres Problem bei der Verwendung von CLM zur Untersuchung von Mikrobiota-Immun-Wechselwirkungen ist jedoch die Domestikation der Darmbakterienzusammensetzung bei CLM, was sich in der Verringerung der Komplexität und Widerstandsfähigkeit der CLM-Darmmikrobiota im Vergleich zu Wildmäusen widerspiegelt [51]. Dem Bedarf an sanitären und kontrollierten Umgebungen steht eine geringere Präsenz potenzieller Krankheitserreger und Parasiten gegenüber, was vermutlich zu einem weniger „gebildeten“ Immunsystem bei CLM im Vergleich zu Wildmäusen führt [51–53]. Um dieses Problem anzugehen, wurde das Wildling-Mausmodell durch Embryotransfer von C57BL/6-Mäusen in Wildmäuse entwickelt, um eine Darmmikrobiota wilder Herkunft zu erhalten und das Translationsproblem immunologischer Darmmikrobiota-Studien zu überwinden (54). Jüngste Studien mit diesem Mausmodell zeigten bessere Ergebnisse bei der Vorhersage des translationalen Werts experimenteller Immuntherapien im Vergleich zu CLM [54,55]. Darüber hinaus waren die Darmmikrobiota von Wildlingen im Vergleich zu CLM resistenter und widerstandsfähiger gegenüber einer Antibiotikabehandlung und einer fettreichen Ernährung, vergleichbar mit der komplexeren Situation beim Menschen [54,55]. Trotz der nachgewiesenen Auswirkungen von HSD auf die Darmmikrobiota, das Immunsystem und verschiedene Krankheitsmodelle bei CLM sind die Auswirkungen einer hohen Salzaufnahme auf natürliche, aus der Wildnis stammende Darmmikrobiota unbekannt. In dieser Studie untersuchten wir die Wirkung von HSD auf verschiedene Zusammensetzungen des Darmbakterien-Ökosystems und die prädiktiven Funktionen von CLM im Vergleich zu Wildlingsmäusen.

2. Materialien und Methoden

2.1. Tiere und Ernährung

Wildtyp-C57BL/6-Mäuse (7–8 Wochen alte Weibchen, n=20) wurden von Charles River gekauft und unter standardisierten Bedingungen in der Tierhaltung der Universität Hasselt gehalten. Wildling-Mäuse (genetischer C57BL/6-Hintergrund, Männchen n=12 und Weibchen n=11) [54] wurden in der Tierhaltung von UHasselt unter standardisierten Bedingungen gehalten. Tierversuche wurden von der Ethikkommission für Tierversuche (ECAE) der Universität Hasselt genehmigt (ID201618A4V1, ID202235). Die Mäuse wurden in einem temperaturkontrollierten Raum (21–23 °C) mit einem 12:12-Stunden-Hell/Dunkel-Licht-Zyklus gehalten (4 Mäuse/Käfig). Die folgenden gereinigten Diäten wurden von Ssniff (Soest, Deutschland) gekauft: 0,5 % NaCl/Kontrolldiät (E15430-04) und 4 % NaCl/HSD (E15431-34). Für HSD wurden die Tiere zusätzlich zu E15431-34 mit 1 % NaCl im Trinkwasser gefüttert, wie in [28] beschrieben. CLM-Mäuse waren gleichmäßig auf die Kontrollgruppe (n=10) und die HSD-Gruppe (n=10) verteilt. Bei den Wildlingmäusen waren männliche und weibliche Individuen ebenfalls gleichmäßig in der Kontroll- und der HSD-Ernährungsgruppe verteilt (6 Männchen zur Kontrolle, 6 Männchen zur HSD, 5 Weibchen zur Kontrolle und 6 Weibchen zur HSD).

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2.2. DNA-Extraktion

Die mikrobielle DNA-Extraktion wurde wie in [28] beschrieben unter Verwendung eines modifizierten Protokolls des QIAmp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) durchgeführt. Kurz gesagt, Kotpellets wurden zu einem 2- ml Eppendorf gegeben, der 0,5 mm Glaskügelchen und 1,5 ml Lysepuffer (ASL) (Qiagen, Hilden, Deutschland) enthielt. Zur mechanischen Homogenisierung der Pellets wurde Perlenschlagen eingesetzt. Die vollständige Extraktion wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers mit geringfügigen Änderungen (Verlängerung der Proteinase-K-Inkubationszeit auf 2 Stunden bei 70 °C) durchgeführt. Die DNA-Konzentrationen wurden mit einem NanoDrop ND-1000-Spektrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) bewertet und vor der 16S-rRNA-Genamplifikation bei –20 °C gelagert.

2.3. 16S-rRNA-Genamplifikation und -sequenzierung

Die 16S-rRNA-Gensequenz wurde unter Verwendung eines für die V4-Region spezifischen Primers (F515/R806) amplifiziert, wie zuvor beschrieben [56]. Kurz gesagt wurden 25 ng DNA pro PCR-Reaktion (30 µL) (KAPA HiFi HotStart ReadyMix, Roche, Basel, CH, USA) der anfänglichen Denaturierung für 30 s bei 98 °C verwendet, gefolgt von 25 Zyklen (10 s bei 98 °C). C, 20 s bei 55 ◦C und 20 s bei 72 ◦C). Die Reaktionen wurden dreifach durchgeführt, pro Probe gepoolt und mit einem Reinigungssystem auf Magnetkügelchenbasis (Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter, Brea, CA, USA) gereinigt. Die Bibliotheksvorbereitung wurde durch eine PCR mit begrenztem Zyklus durchgeführt, um die indizierte Bibliothek mithilfe der Nextera-Technologie (Nextera XT Index Kit, Illumina, San Diego, CA, USA) zu erhalten, gefolgt von einem zweiten Reinigungsschritt mit AMPure XP-Magnetkügelchen. Indizierte Proben wurden dann auf die gleiche Konzentration von 4 nM normalisiert, gepoolt und auf einer Illumina MiSeq-Plattform PE300 mit einem 2 × 300 bp Paired-End-Protokoll gemäß dem Firmenprotokoll (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) sequenziert.

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2.4. Verarbeitung und statistische Analyse von 16S-rRNA-Gensequenzierungsdaten

Rohsequenzen wurden mit einer QIIME 2-Pipeline [57] verarbeitet. Nach der Längen- und Qualitätsfilterung (Standardparameter) wurden die Lesevorgänge gefiltert und mithilfe von DADA2 operativen taxonomischen Einheiten (OTUs) zugeordnet (58). Die taxonomische Zuordnung wurde mit dem VSEARCH-Algorithmus (https://github.com/torognes/vsearch; abgerufen am 9. November 2022) und der Silva-Datenbank v128 (https://www.arb-silva.de) durchgeführt /; abgerufen am 9. November 2{{40}}22). Die ASV-Tabelle wurde dann durch Verdünnung in einer Tiefe von 6,147 normalisiert, sodass jede Probe das Plateau am Ende der Verdünnungskurve erreichte. Die Alpha-Diversität wurde anhand von zwei verschiedenen Metriken bewertet: OTUs-Reichtum (beobachtet), Chao1, Shannon, Simpson, Inverse Simpson (InvSimpson) ökologische Indizes. Für die Beta-Diversität wurden Bray-Curtis-Unähnlichkeit, Jaccard-Ähnlichkeit sowie gewichtete und ungewichtete UniFrac-Metriken [59] berechnet und mithilfe der Prinzipkoordinatenanalyse (PCoA) grafisch dargestellt, um den tatsächlichen Abstand zwischen den Proben zu visualisieren. Um die OTU-Zähltabelle zu normalisieren, wurde die Verdünnung in einer Tiefe von 6305 Sequenzen pro Probe 100 Mal durchgeführt. Die aus der OTU-Taxonomiezuweisung erhaltene Ausgabe als Taxonomietabelle wurde verwendet, um die normalisierte OTU-Tabelle in Tabellen für die Taxonomiestufen L2 (Stamm), L5 (Familie) und L6 (Gattung) zusammenzufassen. Statistische Analysen wurden mit R (https://www.R-project.org/; abgerufen am 25. November 2022; Version 4.2.0) durchgeführt. Das R-Paket „vegan“ (Version 2.6-4) [60] wurde verwendet, um Beta-Diversitätsmetriken zu generieren, um Zusammensetzungsunterschiede von Gruppen durch PCoA oder durch Hauptkomponentenanalyse (PCA) zu vergleichen. Pakete und Datentrennung wurden durch Permutationstest mit Pseudo-F-Verhältnissen (Funktion „Adonis“ in „vegan“) getestet. Die Trennung hinsichtlich der Beta-Diversität zwischen Gruppen wurde durch permutationelle multivariate Varianzanalyse unter Verwendung von Distanzmatrizen (PERMANOVA, Funktion „Adonis“ in „vegan“) getestet, während Unterschiede für die Streuung innerhalb der Gruppen durch den multivariaten Homogenitätstest der Gruppenstreuung (PERMDISP) getestet wurden , Funktion „betadisper“ in „vegan“). Taxa, die nicht in mindestens 4 Proben vorhanden waren, wurden von der Analyse ausgeschlossen. Unterschiede in der relativen Häufigkeit der Taxa wurden zunächst mit dem vorläufigen Kruskal-Wallis-Test zwischen vier Gruppen und dann mit dem Wilcoxon-Test zwischen den folgenden Vergleichspaaren weiter ausgewertet: CLM-Kontrolle vs. CLM-HSD, Wildling-Kontrolle vs. Wildling-HSD, CLM-Kontrolle vs. Wildling-Kontrolle, CLM HSD vs. Wildling HSD. Zur Bewertung der taxonomischen Unterschiede zwischen Wildling und CLM wurde Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe: https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/; abgerufen am 25. November 2022) verwendet, um die Hauptmerkmale auf Gattungsebene zu unterscheiden [ 61]. Die LEfSe-Ergebnisse wurden dann als Balkendiagramm mit einem LDA-Score-Schwellenwert (Linear Discriminant Analysis) von mehr als 1,0 angezeigt. Bei Bedarf wurden die p-Werte mehrerer Vergleiche nach der Benjamini-Hochberg-Methode angepasst. Eine Falscherkennungsrate (FDR) kleiner oder gleich 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen: * p Kleiner oder gleich 0,05; ** p Kleiner oder gleich 0,01; *** p Kleiner oder gleich 0,001. Funktionelle Unterschiede zwischen Mikrobiomen mit unterschiedlichem NaCl-Gehalt in der Nahrung (0,5 % und 4 % NaCl-Nahrungsmittelgehalt) wurden mit PICRUSt2 analysiert, einem Bioinformatik-Softwarepaket zur Vorhersage des funktionellen Metagenomgehalts aus 16s-rDNA-Gensequenzierungsdaten (https://huttenhower.sph). harvard.edu/picrust/; abgerufen am 29. November 2022; PICRUSt2 2.4.1) [62]. Die PICRUSt2-Pipeline wurde unter Verwendung von Standardparametern auf repräsentative Sequenzen und ihre Häufigkeitstabelle aus DADA2 angewendet (https://github.com/picrust/picrust2/wiki/Full-pipeline-script; Zugriff am 29. November 2022). Aus der vollständigen Pipeline-Ausgabe wurden metagenomische Vorhersagen für KEGG-Orthologie und MetaCyc-Pfade als Tabellen erstellt, mit Vorhersagefunktionen als Zeilen und Proben als Spalten, und zum Vergleich der Darmmikrobiotafunktionen bei Wildlingen und CLM nach HSD-Regime verwendet. Für die weitere Analyse des HSD-Verbrauchs in den beiden Modellen wurden Vorhersagefunktionen der mikrobiellen Gemeinschaft ausgewählt, die am meisten zur Variation zwischen Wildling und CLM nach erster (PC1), zweiter (PC2) und dritter Hauptkomponente (PC3) beitrugen. Die Matrix mit den Vorhersagefunktionshäufigkeiten wurde dann normalisiert, in Centered Log Ratio (CLR)-Werte umgewandelt und das Log2Mean-Verhältnis berechnet (HSD/Kontrolle) sowohl für Wildling als auch für CLM. Abschließend wurden die log2mean-Verhältnisse zwischen den Gruppen mittels Wilcoxon-Test verglichen und als Keilschriftdiagramm dargestellt. Unterschiede zwischen Gruppen wurden in R-Software mithilfe von Wilcoxon-Test- und Kruskal-Wallis-Testfunktionen statistisch verglichen und p-Werte nach der Holm- oder Benjamini-Hochberg-Methode angepasst.

3. Ergebnisse

3.1. HSD beeinflusst die Vielfalt und Zusammensetzung der CLM- und Wildling-Darm-Mikrobiota

Um die Auswirkungen von HSD auf ein aus der Wildnis stammendes mikrobielles Darmökosystem bei Mäusen zu untersuchen, haben wir Wildmäusen und CLM HSD oder Kontrollnahrung verabreicht. Die Mäuse wurden zwei Wochen lang auf Diät gehalten und die Zusammensetzung der Darmmikrobiota im Stuhl wurde anschließend durch 16S-RNA-Gensequenzierung aus am Tag 14 gesammelten Stuhlpellets untersucht (Abbildung 1A). In Übereinstimmung mit einem früheren Bericht wurden keine starken Unterschiede hinsichtlich des Körpergewichts zwischen Kontroll- und HSD-Gruppen von CLM- und Wildling-Mäusen festgestellt [29]. Um die unterschiedliche Darmmikrobiota zwischen den beiden Modellen CLM und Wildling-Mäusen zu Studienbeginn zu beurteilen, haben wir die Alpha-Diversität (Observed oder Richness, Chao1-, Shannon-, Simpson- und Inverse-Simpson-Indizes), Beta-Diversität (Bray-Curtis-Unähnlichkeit) und die Hauptdiversität geschätzt taxonomische Unterschiede. Im Einklang mit früheren Studien [54] war die Mikrobiota des Wildlingsdarms durch einen größeren mikrobiellen Reichtum (Abbildung 1B, alle Alpha-Diversitätsindizes) sowie eine ausgeprägtere und heterogenere mikrobielle Zusammensetzung als CLM gekennzeichnet (Abbildung 1C, PERMANOVA p {{9}) }.001 & PERMDISP p=0.0009, Wildling vs. CLM; und Abbildung S1). In Bezug auf die mikrobiellen Signaturen wurden die Darmmikrobiota von CLM- und Wildling-Mäusen durch verschiedene Bakterientaxa charakterisiert (Abbildung S1). Im Einklang mit Rosshart et al. [54] Bakterientaxa von Wildlingsmäusen gehören zu Intestinomonas, Desulfovibrio, Tuzzerella, Oscillobacter, Orodibacter und der pathogenen Gattung Helicobacter, die das aus der Wildnis stammende, nicht domestizierte Profil dieses Modells charakterisierte (Abbildung S1).

Abbildung 1. HSD-Auswirkungen auf die Bakterienzusammensetzung von CLM (n=10/Gruppe) und Wildling-Mäusen (n=11 für Wildling-Strg und n=12 für Wildling-HSD). (A) Experimentelles Design. C57BL/6 CLM- oder Wildling-Mäuse wurden mit 0,5 % NaCl (Kontrolle, Strg) oder 4 % NaCl mit hohem Salzgehalt (HSD) gefüttert und der Darm wurde durch 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung charakterisiert. (B) Indizes für die Alpha-Diversität der fäkalen Darmmikrobiota von CLM und Wildlingen; Von links nach rechts werden die folgenden Indizes angezeigt: Observed (OUT richness), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson (Inverse Simpson). Unterschiede zwischen den Gruppen werden statistisch durch den Wilcoxon-Test ausgewertet. (C) Hauptkoordinatenanalysediagramm der Beta-Diversitäts-Ordination aus der Bray-Curtis-Unähnlichkeitsmetrik zwischen CLM vs. Wildling (oben), CLM-Kontrolle vs. CLM-HSD (unten links) und Wildling-Kontrolle vs. Wildling-HSD (unten rechts); Trennung und Homogenität zwischen Gruppen wurden durch PERMANOVA- bzw. PERMDISP-Tests berechnet. * p Kleiner oder gleich 0.05; ** p Kleiner oder gleich 0.01; **** p Kleiner oder gleich 0.0001. Abbildung 1. HSD-Auswirkungen auf die Bakterienzusammensetzung von CLM-Mäusen (n=10/Gruppe) und Wildling-Mäusen (n=11 für Wildling-Strg-Mäuse und n=12 für Wildling-HSD). (A) Experimentelles Design. C57BL/6 CLM- oder Wildling-Mäuse wurden mit 0,5 % NaCl (Kontrolle, Ctrl) oder 4 % NaCl mit hohem Salzgehalt (HSD) gefüttert und der Darm wurde durch 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung charakterisiert. (B) Indizes für die Alpha-Diversität der fäkalen Darmmikrobiota von CLM und Wildlingen; Von links nach rechts werden die folgenden Indizes angezeigt: Observed (OUT richness), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson (Inverse Simpson). Unterschiede zwischen den Gruppen werden statistisch durch den Wilcoxon-Test ausgewertet. (C) Hauptkoordinatenanalysediagramm der Beta-Diversitäts-Ordination aus der Bray-Curtis-Unähnlichkeitsmetrik zwischen CLM vs. Wildling (oben), CLM-Kontrolle vs. CLM-HSD (unten links) und Wildling-Kontrolle vs. Wildling-HSD (unten rechts); Trennung und Homogenität zwischen Gruppen wurden durch PERMANOVA- bzw. PERMDISP-Tests berechnet. * p Kleiner oder gleich 0,05; ** p Kleiner oder gleich 0,01; **** p Kleiner oder gleich 0,0001.

HSD führte zu einer signifikanten Verringerung der Bakterienvielfalt (Abbildung 1B, alle Alpha-Diversitätsindizes) sowie zu einer signifikanten mikrobiellen Verschiebung in der Zusammensetzung von CLM (Abbildung 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0 .1, CLM Ctrl vs. CLM HSD). Im Gegensatz dazu war die Darmmikrobiota von Wildlingsmäusen durch eine höhere Diversität bei HSD gekennzeichnet (Abbildung 1B, Observed & Chao1-Indizes), abweichend von CLM, und sie waren auch durch eine weniger ausgeprägte Verschiebung der mikrobiellen Zusammensetzung bei HSD im Vergleich zu CLM gekennzeichnet (Abbildung 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0.5, Wildling Strg vs. Wildling HSD).

3.2. Die mikrobielle Zusammensetzung des Darms von Wildling-Mäusen ist resistenter gegen HSD als gegen CLM

Unterschiede in der Bakterienzusammensetzung zwischen Wildling und CLM wurden weiter taxonomisch charakterisiert. Auf Phylum-Ebene waren die Phyla mit der höchsten Häufigkeit im Hinblick auf die relative Häufigkeit: Firmicutes (CLM: 52 ± 12 %, Wildling: 32 ± 34 %), Bacteroidota (CLM: 24 ± 23 %, Wildling: 57 ± 19 %), Actinobacteriota (CLM: 1{{10}} ± 7 %, Wildling: 0,7 ± 1,3 %) und Verrucomicrobiota (CLM: 24 ± 23 %, Wildling: 0 %/nicht nachgewiesen) (Abbildung 2). Das Darmmikrobenprofil zeigte weitere unterschiedliche Häufigkeiten für alle Phyla, die in Stuhlproben zwischen Wildlingsmäusen und CLM nachgewiesen wurden (Abbildung 2). Insbesondere die Kernmikrobiota-Phyla Firmicutes, Bacteroidota und Verrucomicrobiota unterschieden sich deutlich zwischen den beiden Modellen (Abbildung 2). Genauer gesagt wurde auf Familienebene bei den meisten zuvor als HSD-empfindlich gemeldeten Bakterien, darunter Lactobacillaceae, Clostridiaceae, Peptostreptococcaceae und Akkermansiaceae, ein unterschiedlicher Beitrag bei Wildling- und CLM-Darmmikrobiota beobachtet (Abbildung 3). Dementsprechend wurden auf Gattungsebene ähnliche Trends zwischen Wildling- und CLM-Proben für die Hauptmitglieder der oben genannten Familien bestätigt; unter diesen waren Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, Faecalibaculum und Akkermansia die repräsentativsten (Abbildungen S1 und 4). Um die Auswirkungen von HSD auf CLM und die Mikrobiota-Zusammensetzung des Wildlingsdarms weiter zu charakterisieren, haben wir auch die Auswirkungen des Ernährungsplans auf verschiedenen Klassifizierungsebenen analysiert. Auf Phylum-Ebene waren HSD-behandelte CLM-Darmmikrobiota durch eine signifikante Erschöpfung von Firmicutes und eine Anreicherung von Verrucomicrobiota gekennzeichnet (Abbildung 2), aber keiner der Hauptphyla war in Wildlingsproben von HSD betroffen (Abbildung 2). Auf Familienebene war die CLM-Darmmikrobiota durch eine signifikante Verarmung an Milchsäure produzierenden Bakterien wie Lactobacillaceae sowie an SCFA-Produzenten wie Peptostreptococaceae und Clostridiaceae gekennzeichnet (Abbildung 3). Darüber hinaus beobachteten wir bei HSD-gefüttertem CLM einen Anstieg bei Akkermansiaceae, Sutterellaceae, Defluvitaleaceae und Eggerthellaceae (Abbildung 3). Im Gegensatz dazu betraf HSD verschiedene Bakterienfamilien in der Mikrobiota des Wildlingsdarms, darunter die beiden häufig vorkommenden Muribaculaceae und Prevotellaceae, die beide durch HSD vermehrt wurden (Abbildung 3). Zu den bakteriellen Modulationen, die am meisten zum HSD-Effekt bei CLM beitrugen, gehörten die Zunahme der Gattungen Akkermansia, Parasutterella und Enterorhabdus sowie die Abnahme von Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, (Eubacterium) oxidoreducens-Gruppe, Muribaculum und Anaerovorax (Abbildung 4). Mit Ausnahme von Roseburia war keine der oben genannten Gattungen von HSD in der Mikrobiota des Wildlingsdarms betroffen, während die Gattung Anaerovorax eine entgegengesetzte Tendenz zu der von CLM zeigte (Abbildung 4).

Abbildung 2. HSD-Effekt auf bakterielle Phyla aus Darmmikrobiota von CLM (n=10/Gruppe) und Wildling-Mäusen (n=11 für Wildling-Strg und n=12 für Wildling-HSD). Die Gesamtzusammensetzung in Bezug auf die relative Häufigkeit der Phyla wird im Balkendiagramm für jedes Individuum (oben) und im Boxplot für bestimmte Phyla (unten) dargestellt. Statistische Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mittels Wilcoxon-Test durchgeführt. * p Kleiner oder gleich 0.05; ** p Kleiner oder gleich {{10}}.01; *** p Kleiner oder gleich 0,001; **** p Kleiner oder gleich 0,0001.

Abbildung 3. Auswirkungen des Verzehrs salzreicher Nahrung auf die Bakterienfamilien von CLM (n=10/Gruppe) und Wildling-Mäusen (n=11 für Wildling-Strg und n=12 für Wildling-HSD). Die Gesamtzusammensetzung auf Familienebene wird durch ein Balkendiagramm pro Person (oben) und ein Boxdiagramm für bestimmte Familien (unten) dargestellt. Statistische Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mittels Wilcoxon-Test durchgeführt. * p Kleiner oder gleich 0.05; ** p Kleiner oder gleich {{10}}.01; *** p Kleiner oder gleich 0,001; **** p Kleiner oder gleich 0,0001.

Abbildung 4. Veränderungen in den Bakteriengattungen bei CLM-Mäusen (n=10/Gruppe) und Wildling-Mäusen (n=11 für Wildling-Strg und n=12 für Wildling-HSD). Der Gesamtbeitrag zur relativen Häufigkeit auf Gattungsebene wird als kreisförmiges Balkendiagramm für jedes Individuum (oben) und als Boxplot für bestimmte Gattungen (unten) dargestellt. Statistische Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mittels Wilcoxon-Test durchgeführt. * p Kleiner oder gleich 0.05; ** p Kleiner oder gleich 0.01; *** p Kleiner oder gleich 0,001; **** p Kleiner oder gleich 0,0001.

3.3. HSD beeinflusst prädiktive mikrobielle Funktionen bei CLM, jedoch nicht bei Wildling-Mäusen

Die PICRUSt 2-Ausgabe zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen den mikrobiellen Gemeinschaftsfunktionen von Wildling-HSD und unbehandelten Wildling-Mäusen sowohl für KEGG-Orthologie- als auch für MetaCyc-Signalweganmerkungen, mit der einzigen Ausnahme der HSD-induzierten erhöhten Funktion auf dem recG-Gen für eine ATP-abhängige Helikase von die KEGG-Orthologie (Abbildung 5A). Der Einfluss von HSD auf CLM war durch eine signifikante Abnahme der prädiktiven Funktionen für die KEGG-Orthologie gekennzeichnet, darunter das Gen spp (Saccharose-6-phosphatase) und pfkA (Phosphofructokinase 1), die beide am Stärke- und Saccharosestoffwechsel beteiligt sind, was im Einklang steht mit früheren Erkenntnissen [28] (Abbildung 5A). Darüber hinaus war die Darmmikrobiota von HSD-gefüttertem CLM durch verminderte prädiktive Funktionen von Genen gekennzeichnet, die am Membrantransport (feoB für Eisentransport, AB 2P AB 2 Permeaseprotein, AB 2A AB 2 ATP-Bindungsprotein) und der Glutaminbiosynthese (glnA) beteiligt sind. , Transkriptionsregulator der LacI-Familie (lacI, galR) und Transketolase (tktA, tktB) (Abbildung 5A). Für MetaCyc-Wege hat HSD die CLM-Darmmikrobiota erheblich um prädiktive Funktionen erweitert, die mit der Nitratreduktion (Denitrifikationsweg), dem Galactose-Abbau (D-Galactarat-Abbau, Super-Weg des D-Glucarat- und D-Galactarat-Abbaus), dem Phenylpropanoat-Abbau und Fett verbunden sind Säurerückgewinnung, Succinatabbau zu Buttersäure und Aminosäureabbau (aromatischer Aminabbau, L-Leucinabbau) (Abbildung 5B). Darüber hinaus verloren die HSD-Darmmikrobiota in CLM im Einklang mit früheren Erkenntnissen (28) prädiktive Funktionen für die Aminosäurebiosynthese (Superweg der L-Alanin-Biosynthese, L-Lysin-Biosynthese) und die Fermentation gemischter Säuren, wobei zusätzliche neuartige Signaturen wie N- verloren gingen. Acetylglucosamin/N-Acetylmannosamin/N-Acetylneuraminat-Abbau und Desoxyribonukleoside-Abbau (Pyrimidin- und Purin-Abbau, Inosin-5-Phosphat-Biosynthese III) (Abbildung 5B).

Abbildung 5. Fortsetzung

Abbildung 5. Wirkung von HSD auf die prädiktiven metagenomischen Funktionen des Darms in CLM-Darmmikrobiota (n=10/Gruppe) und Wildling-Darmmikrobiota (n=11 für Wildling-Strg und n=12 für Wildling-HSD). PICRUSt2-Ausgabe, dargestellt als Keilschriftdiagramm für die KEGG-Orthologie-Annotation (A) und MetaCyc-Pfade (B), ausgedrückt als log2-Mittelwertverhältnis der Vorhersagefunktionenzählungen zwischen HSD- und Ctrl-Proben. Alle statistischen Vergleiche wurden zwischen Strg- und HSD-Gruppen mittels Wilcoxon-Test durchgeführt.

4. Diskussion

Es ist bekannt, dass die komplexe und vielfältige Mikrobiota des Wildlingsdarms gegenüber bestimmten Krankheitsmodellen [51] und Ernährungsgewohnheiten, wie z. B. einer hohen Fettaufnahme, widerstandsfähiger ist [54,55]. Allerdings hat keine frühere Studie die Auswirkungen einer hohen Natriumaufnahme auf die Darmmikrobiota wilder Mäuse untersucht. Hier haben wir zum ersten Mal untersucht, wie sich HSD im Vergleich zu CLM auf die Darmmikrobiota von Wildlingen auswirkt. Interessanterweise zeigten unsere Ergebnisse, dass das Wildling-Mikrobiom im Vergleich zu CLM resistenter gegen HSD-Störungen sowohl auf der Ebene der Zusammensetzung als auch der prädiktiven Funktion ist. Es ist allgemein bekannt, dass eine hohe Salzaufnahme das Risiko für verschiedene Krankheiten wie Herz-Kreislauf- oder Autoimmunerkrankungen erhöhen kann, indem sie die Zusammensetzung des Darmmikrobioms und die Immunhomöostase verändert [25,29,31,34,63–65]. Im Einklang mit früheren Berichten waren HSD-induzierte Verschiebungen der Darmmikrobiota bei CLM durch signifikante Veränderungen der mikrobiellen Diversität, Zusammensetzung und Vorhersagefunktionen gekennzeichnet (28). Gesundheitsfördernde Bakterien wie die Familie Peptostreptococcaceae und die Gattungen Lactobacillus, Roseburia und Tuzzerella nahmen hinsichtlich der relativen Häufigkeit in CLM ab, während Akkermansia in HSD-Gruppen signifikant zunahm. Wir haben auch höhere relative Häufigkeiten von HSD bei Defluvitaleaceae, Enterorhabdus und Parasutterella festgestellt. Interessanterweise ist die Gattung Parasutterella ein zentraler Bestandteil der Darmmikrobiota sowohl von CLM als auch von Menschen, wo sie sich als Asaccharolytikum und Succinatproduzent verhält [66]. Es ist bekannt, dass sowohl Enterorhabdus aus der Familie der Eggerthellaceae als auch Parasutterella aus der Familie der Sutterellaceae bei Patienten mit IBD angereichert sind [67,68], was ein weiterer Hinweis darauf ist, wie HSD die Krankheitsentwicklung beeinflussen kann. Interessanterweise zeigten Wildlingsmäuse jedoch keine ähnliche Entität HSD-induzierter mikrobieller Verschiebungen wie CLM. Trotzdem nahm die Diversität der Wildlinge bei HSD für beobachtete OTUs und Chao1-Metriken signifikant zu, und nur wenige Taxa waren an der HSD-Störung der Darmmikrobiota von Wildlingen beteiligt, darunter ein Anstieg von Anaerovorax, gepaart mit einem Rückgang von Erysipelatoclostridium, Roseburia und Lachnospiraceae UCG-004-Gattung. Roseburia war die einzige Bakteriensignatur, die HSD-Gruppen im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollen gemeinsam hatten, obwohl HSD-gefütterte CLM im Vergleich zu HSD-gefütterten Wildlingsmäusen immer noch durch eine höhere Häufigkeit dieses Bakteriums gekennzeichnet waren. Bemerkenswert ist, dass Butyrat-produzierende Bakterien wie Roseburia bei Patienten mit Colitis ulcerosa eine geringere relative Häufigkeit aufweisen [69] und diese Verringerung auch mit dem genetischen IBD-Risiko menschlicher Probanden korreliert [70]. Dies steht im Einklang mit früheren Erkenntnissen, bei denen festgestellt wurde, dass Verschiebungen in Bakteriengattungen wie Roseburia oder Lactobacillus mit einem Risiko für Bluthochdruck verbunden sind, das möglicherweise durch eine westliche Ernährung gefördert wird [71]. Die bakterielle Zusammensetzung des Darms hängt auch mit der Darmmotilität und -physiologie zusammen [72].

Vorteile von Cistanche für Männer: Stärkung des Immunsystems

Die Gattung Anaerovorax wurde zuvor bei Mäusen mit abnormaler Darmphysiologie und verminderter Motilität beobachtet [73]; Die Anreicherung von Anaerovorax in HSD bei Wildlingsmäusen könnte jedoch zu einer anderen Rolle dieser Taxa im Zusammenhang mit der Darmhomöostase und der ordnungsgemäßen Funktion führen. Im Einklang mit früheren Erkenntnissen beobachteten wir eine Zunahme der Gattung Akkermansia in der HSD-Gruppe von CLM [28], während die Darmmikrobiota von Wildlingsmäusen von dieser Gattung erschöpft war, was auch mit früheren Studien zu diesem Modell übereinstimmt [51, 53–55]. Obwohl die Gattung Akkermansia aufgrund ihrer positiven Wirkung auf die Verbesserung des immunologischen und metabolischen Profils des Wirts (z. B. bei Fettleibigkeit und Typ-2-Diabetes) ein potenzielles Probiotikum ist (42,74–77), ist die Rolle dieser Gattung aufgrund ihrer negativen Wirkung noch unklar Korrelation mit klinischen Ergebnissen bei Patienten mit Darmkrebs [78], Parkinson-Krankheit [79,80] und Multiple-Sklerose-Patienten [81]. In Übereinstimmung mit unseren früheren Ergebnissen mit MetaCyc-Signalwegen [28] zeigte CLM nach HSD verringerte prädiktive mikrobielle Funktionen im Zusammenhang mit dem Stärke- und Saccharosestoffwechsel für die KEGG-Orthologie. Die geringfügigen Veränderungen in der Darmbakterienzusammensetzung von HSD-gefütterten Wildlingsmäusen führten jedoch nicht zu signifikanten Veränderungen der prädiktiven bakteriellen Funktionen, was darauf hindeutet, dass die aus Wildlingen stammenden Darmmikrobiota und metabolischen/ökologischen Netzwerke viel stabiler sind und sich viel leichter anpassen könnten HSD-induzierte Ernährungsschwankungen im Vergleich zu CLM-Darmökosystemen, die weitere Untersuchungen erfordern. Erwähnenswert ist auch der mögliche Einfluss der Darmpilzgemeinschaft auf das Darmbakteriennetzwerk bei unterschiedlichen Ernährungsgewohnheiten. Frühere Studien haben bereits gezeigt, wie potenzielle Wechselwirkungen zwischen Bakterien und Pilzen an der Homöostase des Wirtsimmunsystems und der Krankheitsentwicklung beteiligt sind [82–85]. In diesem Zusammenhang wird CLM durch ihre im Vergleich zu Wildlingmäusen geringere bakterielle Komplexität weiter eingeschränkt, was die Etablierung einer vielfältigen Darmmykobiota behindern kann [54]. Zukünftige Studien werden mithilfe des Wildling-Modells in der Lage sein, den Beitrag von Darmpilzgemeinschaften zur Darmmikrobiota und Wirtsimmunität zu bestimmen. Zusammenfassend liefert unsere Studie Daten darüber, wie sich eine hohe Natriumaufnahme auf ein natürliches, aus der Wildnis stammendes mikrobielles Darmökosystem im Vergleich zu einer domestizierten Darmbakteriengemeinschaft von CLM auswirkt. Unsere Studie hat gezeigt, dass HSD bakterielle Taxa und Darmmikrobiota bei Wildlingsmäusen nicht in der gleichen Weise beeinflusst wie bei domestizierten Darmmikrobiota aus CLM. Diese Divergenz weist, wie bereits bei anderen Ernährungsregimen oder -zuständen wie fettreichen Diäten festgestellt, darauf hin, dass künftige Forschung in natürlichen Mausmodellsystemen erforderlich ist, um die Auswirkungen von Ernährungseingriffen auf komplexere Darmökosysteme zu rekapitulieren und abzuschätzen. wie beim Menschen.

Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem

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