In-Silico-Analyse eines Drosophila-Parasitoid-Giftpeptids enthüllt die Prävalenz des Kation-Polar-Kation-Clip-Motivs in Knottin-Proteinen Teil 1

Abstrakt:

Als generalistische Schlupfwespen ist Leptopilina heteroatom bei vielen Fruchtfliegenarten der Gattung Drosophila äußerst erfolgreich. Die Parasitoiden produzieren in ihrem Gift spezialisierte extrazelluläre Vesikel (EV)-ähnliche Strukturen mit mehreren Strategien. Die Proteomanalyse identifizierte mehrere immunitätsassoziierte Proteine, darunter das Knottin-Peptid LhKNOT, das die strukturell konservierte Inhibitor-Cystein-Knotenfalte (ICK) enthält, die in Proteinen verschiedener Taxa vorhanden ist. Unsere Struktur- und Docking-Analyse der 36-Restkern-Knottin-Faltung von LhKNOT ergab, dass sie zusätzlich zum Knottin-Motiv selbst auch einen Kation-Polar-Kation (CPC)-Clip besitzt.

Der Inhibitor Cystein ist eine natürliche Substanz, die zur Vorbeugung oxidativer Schäden und zur Förderung des Zellwachstums eingesetzt wird. Im Hinblick auf die Immunität spiegelt sich die Rolle von Cystein hauptsächlich in der Verbesserung der körpereigenen Immunität und der Vorbeugung von Entzündungen und Infektionen wider.

In den letzten Jahren haben immer mehr Studien gezeigt, dass Cystein eine wichtige Rolle im Immunsystem spielen kann. Es kann die Vermehrung von Immunzellen fördern, die Widerstandskraft des Körpers gegen Krankheitserreger stärken und das Infektionsrisiko verringern. Darüber hinaus kann Cystein auch die Produktion freier Radikale reduzieren und die allgemeine Gesundheit des Immunsystems verbessern, wodurch die Immunität des Körpers gestärkt wird.

Obwohl die Wirkung von Cystein auf die Immunität sehr erheblich ist, sollte der Cystein-Inhibitor mit Vorsicht angewendet werden. Da der Hemmstoff Cystein normalerweise zur Behandlung bestimmter Krankheiten wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Arthritis usw. eingesetzt wird, beeinträchtigt er bei Missbrauch die Immunität und führt zu einer Schwächung des körpereigenen Immunsystems, wodurch das Infektionsrisiko steigt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass zwischen dem Inhibitor Cystein und der Immunität ein untrennbarer Zusammenhang besteht. Obwohl Cysteinhemmer die Gesundheit des Körpers fördern können, müssen sie auch unter ärztlicher Anleitung angewendet werden, und es sollte auf die Aufrechterhaltung einer angemessenen Dosis geachtet werden, um die Gesundheit des Körpers zu erhalten. Es ist ersichtlich, dass wir die Immunität verbessern müssen. Cistanche kann die Immunität erheblich verbessern, da Fleischasche eine Vielzahl biologisch aktiver Inhaltsstoffe wie Polysaccharide, zwei Pilze, Huang Li usw. enthält. Diese Inhaltsstoffe können verschiedene Immunsysteme stimulieren. zellähnliche Zellen, wodurch ihre Immunaktivität erhöht wird.

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Es wird angenommen, dass das CPC-Clip-Motiv die antimikrobielle Aktivität in Heparin-bindenden Proteinen erleichtert. Überraschenderweise besitzt ein Großteil der getesteten ICKs auch das CPC-Clip-Motiv, darunter 75 echte Knottinproteine ​​aus Pflanzen und Arthropoden, die eine hohe Sequenz- und/oder strukturelle Ähnlichkeit mit LhKNOT aufweisen. Wie LhKNOT und diese anderen 75 Knottin-Proteine ​​enthält sogar das antimykotische Peptid Drosophila Drosomycin, ein kanonisches Zielgen des TollNF-kappa B-Immunwegs der Fliege, dieses CPC-Clip-Motiv. Zusammengenommen deuten unsere Ergebnisse auf eine mögliche Abwehrfunktion des Parasitoids LhKNOT hin.

Die Verbreitung des CPC-Clip-Motivs, das dem Cysteinknoten in den hier untersuchten Knottin-Proteinen innewohnt, legt nahe, dass die resultierende 3D-Topologie für ihre biochemischen Funktionen wichtig ist. Der CPC-Clip ist wahrscheinlich ein hochkonserviertes Strukturmotiv, das in vielen verschiedenen Proteinen mit berichteter Heparin-Bindungskapazität, einschließlich Amyloidproteinen, vorkommt. Knottine sind Ziele für die Entwicklung therapeutischer Arzneimittel, und Einblicke in ihre Struktur-Funktions-Beziehungen werden die Entwicklung neuartiger Arzneimittel vorantreiben.

Schlüsselwörter:

Wirt–Parasit; Drosophila; Leptopilina; Cysteinknoten; Knotenfalte; Kation-Polar-Kation-Clip; antimikrobielles Peptid; Heparin-bindendes Motiv; Mini-Proteine.

1. Einleitung

Bei Wirt-Parasit-Interaktionen muss der Parasit offensiven Druck ausüben und gleichzeitig den Wirt am Leben erhalten, um lebensfähige Nachkommen zu erhalten [1,2]. Solche widersprüchlichen Ziele haben zur Entwicklung von Virulenzfaktoren mit unterschiedlichen molekularen Strategien bei gleichzeitiger Beibehaltung einer hohen Wirtsspezifität geführt. Parasitäre Hymenopteren umfassen mehr als eine Million Arten, sind auf dem Planeten allgegenwärtig und parasitieren eine Vielzahl von Arthropoden, hauptsächlich Insekten [3].

Wespen, die Insektenwirte angreifen, haben eine Reihe von Verhaltens- und biochemischen Erfolgsstrategien entwickelt und stehen mit ihren Wirten unter ständigem koevolutionären Druck [4–7].

Das Leptopilina/Drosophila-System ist ein neues Modell zum Verständnis der molekularen Grundlagen von Anti-Wespen-Reaktionen und Wespen-Virulenzstrategien [8]. Um die Immunität des Wirts zu unterdrücken, führen Leptopilina-Weibchen während der Eiablage Giftfaktoren in ihre Larvenwirte ein [4,9,10]. Die gut definierten angeborenen Immunmechanismen in Drosophila (11–13) bieten einen wertvollen Kontext für die Untersuchung der Auswirkungen dieser Wespengiftfaktoren.

Eine Infektion durch den Spezialisten L. boulardi aktiviert die humoralen und zellulären Immunarme, die durch den konservierten Toll-NF-κB-Signalweg der Fliege gesteuert werden. Die Expression von Genen für antimikrobielle Peptide (AMP) wie Drosomycin wird nach einer L. boulardi-Infektion aktiviert [14]. Die Toll-NF-κB-Signalisierung steuert auch die Teilung und Entwicklung von Blutzellen [15,16], Schritte, die die Einkapselung und den Tod von Wespeneiern steuern [17,18].

Im Gegensatz dazu unterdrückt eine Infektion durch das generalistische L.-Heteroatom beide Immunwege [9,14] und fast alle Larvenblutzellen werden durch Faktoren im Wespengift zerstört [19,20].

In dieser Studie analysieren wir die theoretische Struktur eines L.-Heteroatom-Peptids namens LhKNOT, das in organellenähnlichen Sekreten im L.-Heteroatom-Gift, aber nicht im L.-boulardi-Gift identifiziert wurde [21]. Diese immunsuppressiven Organellen umfassen mehr als 350 Proteine ​​und besitzen ein proteomisches Profil eukaryotischer Mikrovesikel und eine Vielzahl immunitätsbezogener Proteine ​​[21–23].

LhKNOT übernimmt das Motiv des „Inhibitor Cysteine ​​Knot“ (Knottin) [24]. Das Knottin-Motiv ist in einer Reihe von Taxa weitgehend konserviert, von Pflanzen [25,26] bis hin zu Schnecken [27]. Diese kleinen Peptide (<60 residues) are functionally diverse. Knottins are used offensively, in spider toxins [28] and cone snail venom [27], as well as defensively, e.g., in wound healing activities of cacti [26], and antimicrobial host defense in plants [25,26,29] and invertebrates [30].

Das breite Spektrum der Knottin-Aktivität wird auf die Gesamtstruktur seiner Faltung zurückgeführt, die ausschließlich auf einem konservierten Motiv aus sechs Cysteinresten beruht, das sich die einzigartige Fähigkeit dieser Cysteine ​​zur Bildung von Disulfidbrücken zunutze macht. Das Knottin-Motiv tritt auf, wenn Cysteinreste in einem C1-C2-C3-C4-C5-C6-Muster beobachtet werden (wobei „-“ für mehrere steht). sehr variable Rückstände).

Anschließend werden Disulfidbrücken auf ähnlich konservierte Weise gebildet (C1-C4, C2-C5 und C3-C6), was zu C1-C4 und C{{ führt. 8}}C5 bildet einen Makrozyklus, während C3-C6 innerhalb dieses Makrozyklus auftritt, was zu einer „verknoteten“ Topologie führt. Da diese verknotete Topologie weitgehend von der Erhaltung der sechs Cysteinreste abhängt, ermöglicht das Knottin-Motiv erhebliche Variationen in der Gesamtsequenz [30]. Die Kombination aus ihrer geringen Größe, der hohen Toleranz gegenüber Sequenzvarianz und der beobachteten strukturellen Stabilität hat Knottine zu einem beliebten Gerüst für die Arzneimittelentwicklung gemacht [30], möglicherweise sogar für die Krebsbehandlung [31].

Verschiedene experimentelle Belege belegen oder legen antimikrobielle Fähigkeiten für verschiedene Knottine [25,26,29,30,32,33] oder gesteuerte Ionenkanalwechselwirkungen [28,34] nahe, obwohl dies bei den molekularen Mechanismen, durch die diese Funktionen ausgeführt werden, nicht der Fall ist gut verstanden. Darüber hinaus ist nicht bekannt, ob diese antimikrobiellen Funktionen einen gemeinsamen Wirkmechanismus haben.

Angesichts der Entdeckung aus immunsuppressiven Partikeln von Fliegenparasiten bestand unser Ziel darin, (a) LhKNOT-verwandte Sequenzen aus verschiedenen Organismen, einschließlich L. heteroatom, L. boulardi und Ganaspis-Parasitoiden, zu identifizieren, die Drosophila angreifen, und (b) alle zu identifizieren neuartige Strukturmotive, die in den bekannten oder neuen LhKNOT-Homologen vorhanden sind, mit der Hoffnung, dass die Vorhersage eines solchen konservierten Motivs mögliche Funktionen für LhKNOT aufzeigen und zukünftige experimentelle Forschung leiten könnte.

Wir zeigen, dass ein theoretisches Modell von LhKNOT die Merkmale der Knottin-Faltung mit drei antiparallelen Beta-Faltblättern aufweist, die durch Disulfidbrücken eingeschränkt sind. Das LhKNOT-Modell enthält einen CPC-Clip, der mit Heparin, einem negativ geladenen Glykosaminoglykan (GAG) von erheblichem medizinischem Wert, interagieren kann. LhKNOT hat auch das Potenzial, mit anderen GAGs zu interagieren, wie z. B. Keratansulfat (ein GAG, das stark sulfatiert ist, ähnlich wie Heparin) und Hyaluronsäure (der einzige GAG-Vertreter, der keine Sulfatierung erfordert) [35].

Darüber hinaus besitzen strukturelle Homologe von LhKNOT (dh echte Knottin-Motivproteine) auch das CPC-Clip-Motiv, das an Heparin andocken kann. Überraschenderweise teilt, wie LhKNOT und diese anderen echten Knottin-Proteine, sogar das antimykotische Peptid Drosophila Drosomycin dieses CPC-Clip-Motiv in seiner Struktur. Dieses Motiv wurde auch in 41 von 46 weiteren LhKNOT-Homologen von L. heteroatom, L. boulardi und Ganaspis spp. identifiziert. Wespen erfolgreich auf D. melanogaster.

Diese in silico-basierten Beobachtungen legen nahe, dass das CPC-Clip-Motiv, das vielen Knottinen innewohnt, die strukturelle Grundlage für die Modifizierung von Immun- oder Virulenzfunktionen bilden könnte. Wir spekulieren über eine mögliche antimikrobielle oder virulenzbezogene Funktion der Wespe LhKNOT. Die Häufigkeit der Knottin-Falte und ihre Übereinstimmung mit dem CPC-Clip-Motiv in den meisten neu identifizierten Knottin-Peptiden von drei Drosophila-Parasitoiden lassen darauf schließen, dass sie eine wichtige, noch zu bestimmende Rolle in der Physiologie der Parasitoiden und/oder im Wirt-Parasiten spielen Interaktionen.

2. Ergebnisse
2.1. Die LhKNOT-Sequenz zeigt Ähnlichkeit mit antimikrobiellen Peptiden von Insekten und Pflanzen

Eine BLASTp-Suche in den nr- und TSA-Datenbanken unter Verwendung der LhKNOT-Sequenz voller Länge (60 Aminosäuren) ergab eine begrenzte Anzahl signifikanter Treffer, die hauptsächlich als „antimikrobielle Peptide“ annotiert waren, von Pflanzen und Insekten. Es wurden auch einige Pilzsequenzen identifiziert. Alle Ergebnisse zeigten eine Aminosäureidentität von weniger als 60 Prozent mit LhKNOT. Der Top-Treffer für LhKNOT in der Nr.-Datenbank war ein antimikrobielles Peptid aus dem Käfer Callosobruchus maculates, während der Top-Treffer in der TSA-Datenbank ein antimikrobielles Peptid aus der Weizenmilbe Aceria Coachella war.

Die Konservierung war am deutlichsten im Bereich des einzigen mit LhKNOT assoziierten Sequenzmotivs, der Cystein-verknüpften „antimykotischen Peptid“-Signatur (pfam11410-Domäne, E=2,8 × 10−3 ). Nach dem Ausführen von PSI-BLAST zur Erkennung entfernter Homologe wurden zusätzliche Sequenzen entdeckt. PSI-BLAST zeigte ähnliche Ergebnisse bei der Eispflanze Mesembryanthemum crystallinum; Rote Milben, Dinothrombium tinctorium; Schlupfwespe, Trichogramma pretiosum; Schnellkäfer, Ignelater leuchtend; Schlupfwespe, Trichogramma Brassicae; Gemeiner Pollenkäfer, Brassicogethes aeneus; Eschenbohrer, Agrilus planipennis; und Sägewespe, Neodiprion lecontei.

Unter Verwendung des auf Hidden-Markov-Modellen basierenden HMMER-Webservers als alternative Methode zur Erkennung entfernter Homologe identifizierten wir fünf Pilztreffer von Akanthomyces lecanii, Cordyceps javanica, Cordyceps confragosa, Rosellinia necatrix und Beauveria bassiana.

Eine Suche in der PDB nach ähnlichen Sequenzen ergab nur zwei signifikante Ergebnisse, eines für ein antimykotisches Peptid vom Knottin-Typ Alo-3 aus dem Insekt Acrocinus longimanus und das zweite für das Disulfid-beschränkte Wundheilungspeptid pB1 aus Pereskia bleo. Die Details aller nahen und entfernten Homologen, die mithilfe der verschiedenen Sequenzähnlichkeitsansätze identifiziert wurden, sind in der Ergänzungstabelle S1 zusammengefasst.

Eine Angleichung von LhKNOT an die bekannten Strukturen typischer Knottine sowie identifizierter Homologe zeigte die Konservierung der sechs Cysteine, die die drei Disulfidbrücken in LhKNOT bilden (Abbildung 1A). An seinem N-Terminus enthält LhKNOT ein langes, helikales Segment, von dem vorhergesagt wird, dass es als Signalsequenz fungiert; Im Inneren enthält es drei Beta-Faltblätter, wie man es von der Sekundärstruktur von Knottin-Peptiden erwartet (Abbildung 1B).

Darüber hinaus wurde eine Bewertung der Sequenzähnlichkeit von LhKNOT durchgeführt, die auf die verfügbaren L.-Heteroatom- und L.-boulardi-Transkripte sowie auf einen anderen Drosophila-Parasitoiden, Ganaspis spp., abzielte. (siehe Methoden) ergab eine Fülle verwandter Sequenzen. Für L. heterotoma (Lh14) identifizierten wir 16 zusätzliche Lh14-Knottin-Proteine ​​(Ergänzungstabelle S2).
Für L. boulardi haben wir 22 Knottin-Proteine ​​identifiziert (Ergänzungstabelle S3). Sechs LhKNOT-Homologe wurden auf ähnliche Weise aus Ganaspis Hookeri (G1) identifiziert und zwei LhKNOT-Homologe wurden in den Proteinvorhersagen gefunden, die aus dem Genom von G. brasiliensis (VA) erstellt wurden (Ergänzungstabelle S4). Abbildung 2 zeigt die Konservierung dieser parasitoiden Knottin-Sequenzen mit LhKNOT. Daher scheinen zumindest die wenigen in dieser Studie untersuchten Drosophila-Parasitoide für mehrere Knottin-Proteine ​​zu kodieren. Weitere solche Knottin-Peptide könnten von diesen Wespen kodiert werden, und es sind systematische proteomische/bioinformatische Ansätze erforderlich, um eine umfassende Liste zu erhalten. Die Funktionen dieser mutmaßlichen Knottine in der Physiologie von Parasiten sind weiterhin unbekannt.

Abbildung 1. (A) Mehrfachsequenz-Alignment von LhKNOT (oben) und Homologen in der Knottin-Familie (von oben nach unten): Mesembryanthemum crystallinum (Pflanze; antimikrobiell; NCBI-ID: AAC19399), Aceria tosichella (Milbe; antimikrobiell; NCBI-ID :MDE48292.1), Callosobruchus maculatus (Käfer; unbekannt; NCBI ID:VEN35376.1), Dinothrombium tinctorium (Milbe; unbekannt; NCBI ID:RWS16713.1), Trichogramma pretiosum (Alo{{10}} wie; Schlupfwespe; antimikrobiell; NCBI-ID: XP_014233229.1), Ignelater luminosus (Käfer; unbekannt; NCBI-ID: KAF2884324.1), Trichogramma Brassicae (Schlupfwespe; unbekannt; NCBI-ID: CAB{{27 }}{{30}}31014.1), Brassicogethes aeneus (Käfer; unbekannt; NCBI-ID: CAH0563829.1), Agrilus planipennis (Eschenbohrer; antimikrobiell; NCBI-ID : XP_018321119.1), Neodiprion lecontei (Blattwespe; unbekannt; NCBI-ID: XP_015517007.2), Akanthomyces lecanii (Pilz; antimykotisch; Uniprot-ID: A0A168C5L6), Cordyceps javanica (Pilz; antimykotisch ; Uniprot ID: A0A545VVU1), Cordyceps confragosa (Pilz; unbekannt; Uniprot ID: A0A179IJT7), Rosellininia necatrix (Pilz; Unbekannt; Uniprot-ID: A0A1S8A723), Beauveria bassiana (Pilz; unbekannt; Uniprot-ID: A0A0A2VUF6), Acrocinus longimanus (Alo-3; Käfer; antimykotisch; PDB-ID: 1Q3J) und Pereskia bleo (pB1; Kaktus; PDB-ID: 5XBD). Identische Rückstände werden rot hervorgehoben, während chemisch ähnliche Rückstände gelb hervorgehoben werden. Schwarze Pfeile kennzeichnen die konservierten Cysteinreste, die für die Knottin-Strukturfaltung verantwortlich sind, und die Disulfidbrückenkonnektivität der drei Disulfidbrücken ist mit neongrünen Zahlen markiert.

X und XX bezeichnen die variable Anzahl von Resten am N- bzw. C-Terminus. Oben sind Sekundärstrukturelemente des modellierten LhKNOT dargestellt. und T stehen für -strang bzw. -turn. (B) Sekundärstrukturvorhersage für LhKNOT, zeigt ein langes helikales Segment (rosa Zylinder; Signalpeptid), gefolgt von drei Betasträngen (gelbe Pfeile). Diese Sekundärstruktur folgt der kanonischen Knottin-Signatur [36]. (C) Ein Prototyp der Knottin-Strukturfalte aus der KNOTTIN-Datenbank [36] (Genehmigung zur Reproduktion dieses Bildes erteilt von Dr. Jean-Christophe Gelly, INSERM, Oktober 2019). Die beiden Disulfidbrücken (grün) bilden einen Makrozyklus, während eine dritte (blau) durch die Mitte verläuft und dem Protein seine namensgebende geknotete Topologie verleiht. (D) Die vorhergesagte Tertiärstruktur von LhKNOT zeigt die geknotete Topologie und das konservierte Cysteinmotiv. Cysteinreste bilden Disulfidbrücken in dem konservierten Muster, das in der gesamten Knottinfamilie zu sehen ist (C1 -C4- und C2 -C5-Form). der Makrozyklus, C3 -C6 zieht durch die Mitte).

Abbildung 2. (A) Mehrfachsequenz-Alignment von LhKNOT (oben) und Homologen in Lh14. (B) Mehrfachsequenz-Alignment von LhKNOT (oben) und Homologen in L. boulardi. Das im grünen Feld markierte X entspricht den folgenden Einfügungen in zwei Lb17-Sequenzen: Lb: GISX01151661.1 X=SQAPPPTPEPFHPPGTPP; Lb: GISX01151653.1 X=SQLTSPRSTFPPTGSTIPSIITT. (C) Mehrfachsequenz-Alignment von LhKNOT (oben) und Homologen in Ganaspis spp. Identische Rückstände werden rot hervorgehoben, während chemisch ähnliche Rückstände gelb hervorgehoben werden.

Schwarze Pfeile kennzeichnen die konservierten Cysteinreste, die für die Knottin-Strukturfaltung verantwortlich sind, und die Disulfidbrückenkonnektivität der drei Disulfidbrücken ist mit neongrünen Zahlen markiert. Oben sind Sekundärstrukturelemente des modellierten LhKNOT dargestellt. und T stehen für -strang bzw. -turn. An den Sequenzblöcken werden graue Sterne hinzugefügt. Die obigen Reste stellen Reste dar, die mit alternativen Konformationen modelliert wurden.

2.2. Die dreidimensionale Struktur von LhKNOT

Die typische Strukturfaltung eines Knottin-Peptids wird durch sechs Cysteine ​​definiert, die an drei Disulfidbindungen beteiligt sind und ein mit Cystein verknotetes dreisträngiges antiparalleles Beta-Faltblatt bilden [25]. Ein wichtiges Merkmal dieser Faltung ist die Verbindung der Cysteinreste zur Bildung der Disulfidbrücken und der Disulfidbrücke der Cysteine ​​3 und 6, die durch die Disulfide 1–4 und 2–5 verläuft, um einen speziellen Disulfid-durch-Disulfid-Knoten zu bilden (Abbildung 1A, C ).

Dieses Disulfid unterscheidet die Knottin-Faltung durch ein Disulfidknotenmerkmal von anderen Cysteinknotenproteinen. Abgesehen von den konservierten Cysteinen kann der Rest der Aminosäuresequenz sehr variabel sein, und daher wird nur eine begrenzte Anzahl von Knottinen durch Sequenzähnlichkeitsansätze für LhKNOT identifiziert (siehe vorheriger Abschnitt und Ergänzungstabelle S1).

Faltenerkennungsalgorithmen und vorlagenbasierte Modellierungsansätze hingegen haben mehrere unterschiedliche Knottins als geeignete Kandidaten für die Modellierung von LhKNOT ermittelt. Unter den verschiedenen generierten LhKNOT-Modellen war das beste Modell ein auf mehreren Vorlagen basierendes Modell von LhKNOT, das mit dem Programm HHpred [37] mit strukturellen Einschränkungen erstellt wurde, die von den drei wichtigsten Vorlagen abgeleitet wurden, Alo-3 (PDB: 1Q3J) [ 30], Omega-Agatoxin-IVA (PDB: 1IVA) [28] und PAFP-S (PDB: 1DKC) [25]. Mit ProSA-web [38] berechnete wissensbasierte Energieprofile für dieses ausgewählte Modell zeigten niedrige Energien und einen Z-Score von −4,53, was mit gelösten Strukturen vergleichbar ist.

Verify3D [39] bewertete dieses auf mehreren Vorlagen basierende Modell mit einer bestandenen Punktzahl (100.00 Prozent der Reste im Modell haben einen gemittelten 3D-Wert-1 D-Score größer oder gleich 0,2). Der VoroMQA-Score [40] von 0,325 spiegelt wahrscheinlich die geringe Größe des Peptids wider, und die Scores der Templates lagen im gleichen Bereich (ergänzende Abbildung S1).

Dieses auf mehreren Vorlagen basierende Modell charakterisiert die Knottin-Faltung mit drei antiparallelen Betasträngen, die durch Disulfidbrücken und die erwartete Konnektivität von Disulfidbrücken eingeschränkt werden (Abbildung 1D). KNOTER3D, ein Tool in der KNOTTIN-Datenbank [36], bestätigte, dass dieses Modell eine echte Knottin-Falte aufweist, und bestätigte das zuvor identifizierte Disulfidbindungsmuster in Abbildung 1D.

2.3. LhKNOT zeigt das Vorhandensein eines CPC-Clips, der mit Heparin und anderen GAGs interagieren kann

Um nach potenziellen LhKNOT-Funktionen zu suchen, wurden Struktur-Funktions-Korrelationen enger Strukturhomologe von LhKNOT untersucht. Ein Knottin-Protein aus dem Kaktus Pereskia bleo (PDB: 5XBD) [26] besitzt ein Heparin-bindendes Motiv, das als CPC-Clip bekannt ist. Dieses Strukturmotiv bildet eine geometrisch begrenzte Klammer aus zwei kationischen und einem polaren Rest, die mit Heparin über Salzbrücken und Wasserstoffbrückenbindungen interagieren und es innerhalb der positiv geladenen Oberfläche der Klammer in Position halten [41].

Eine strukturelle Überlagerung des Kaktusknottins und von LhKNOT zeigte, dass die beiden Strukturen mit einem Gesamtunterschied von weniger als 2 Å sehr ähnlich sind. Die Docking-Analyse von LhKNOT mit Heparin unter Verwendung der spezifischen Parameter von ClusPro für Heparin als Ligand ergab, dass für LhKNOT die polaren Wechselwirkungen, die zum CPC-Clip-Motiv passen, in den Resten R1-S3-R14 auftreten (Abbildung 3A). .

Die gemessenen Abstände (sowohl zwischen Alpha-Kohlenstoffatomen als auch den Massenschwerpunkten der beteiligten Restseitenketten) unterschieden sich von denen des CPC-Clips um weniger als 1 Å, was auf das Vorhandensein eines mutmaßlichen CPC-Clips in LhKNOT schließen lässt (Abbildung 3B). Die Oberflächenelektrostatik des modellierten LhKNOT zeigte auch das Vorhandensein der erwarteten kationischen Bindungstasche, die durch den CPC-Clip gebildet wurde [41,42] (Abbildung 3C).

Um die Fähigkeit des CPC-Clips zur Interaktion mit anderen GAGs zu beurteilen, wurde eine zusätzliche Docking-Analyse mit LhKNOT und Keratansulfat (PDB-ID: 1KES) sowie mit LhKNOT und Hyaluronsäure (PDB-ID: 1HYA) durchgeführt. In beiden Fällen wird die durch den CPC-Clip erzeugte positiv geladene Bindungsoberfläche an die negativ geladenen Moleküle gebunden. Von PDBSum erstellte Ligplots bestätigten eine Assoziation der GAGs mit den CPC-bildenden Resten (Ergänzende Abbildungen S2 und S3).

2.4. Andere Strukturhomologe von LhKNOT enthalten ebenfalls das CPC-Clip-Motiv

Das Vorhandensein des CPC-Clips sowohl in LhKNOT als auch in seinem Strukturhomolog aus Pereskia bleo (pB1) deutete auf die Möglichkeit einer breiteren Konservierung des CPC-Clips innerhalb der Knottin-Familie hin. Eine Analyse von 21 engen Strukturhomologen von LhKNOT mit experimentell gelösten PDBs in der KNOTTIN-Datenbank ergab, dass die Peptide in jedem Fall das CPC-Clip-Motiv besitzen. Bei den meisten Peptiden (z. B. T. tridentatus) wichen die Motivparameter weniger als 1 Å von der Kern-Knottin-Falte ab, während bei anderen (z. B. den anstößigen Knottinen) die Abweichung bis zu 3 Å betrug (Ergänzungstabelle S5). In ähnlicher Weise zeigten modellierte Knottin-Proteine ​​der identifizierten Homologen, dass fast alle von ihnen den CPC-Clip besaßen.

Sechzehn zusätzliche Sequenzen von L. heteroatom, 22 Sequenzen von L. boulardi und 8 Sequenzen von Ganaspis spp. ohne bekannte 3D-Strukturen wurden modelliert und auf das Vorhandensein des CPC-Clip-Motivs analysiert. Während 13 der 16 mutmaßlichen L.-Heteroatom-Knottine und 20 der 22 mutmaßlichen L.-boulardi-Knottine ein CPC-Clip-Motiv zeigten, enthielten alle Ganaspis-Sequenzen den CPC-Clip (Ergänzungstabelle S5). Interessanterweise gehören die sieben Homologen, die kein CPC-Clip-Motiv aufwiesen, zu (a) der gewöhnlichen Pollenkäfersequenz (B. aeneus (CAH0563829.1), (b) der Pilzsequenz R. necatrix (A0A1S8A723) und (c) drei L. heterotoma knottins 4,5,6 und L. boulardi knottins 3 und 20 (Ergänzungstabelle S5).

Eine Untersuchung von Knottinen in der KNOTTIN-Datenbank, die nichts mit LhKNOT zu tun haben, aber für verschiedene Taxa (Kegelschnecke, Pfeilschwanzkrebs, Insekt, Pflanze, Skorpion und Spinne) repräsentativ sind, zeigte das CPC-Clip-Motiv. In allen Fällen ist das elektrostatische Oberflächenprofil des CPC-Clip-Motivs positiv geladen, was wahrscheinlich die Wechselwirkungen mit dem negativ geladenen Heparin erleichtert (Abbildung 4). Ähnlich wie bei den oben beschriebenen Käfer-, Pilz- und Wespenknottinen wurde der CPC-Clip jedoch nicht in Knottinen aus pflanzlichen Cyclotiden und Schwämmen identifiziert (Ergänzungstabelle S5).

Abbildung 4. Heparin-Docking-Ergebnisse und Oberflächenelektrostatik von (A) antimykotischem Peptid von Phytolacca americana (PFAP-s; Pflanze; PDB: 1DKC), (B) Calciumkanal-selektivem Omega-Agatoxin von Agelenopsis aperta (Omega-Agatoxin IV-A). ; Spinne; PDB: 1IVA), (C) antimykotisches Peptid von Acrocinus longimanus (Alo-3; Käfer; PDB: 1Q3J), (D) wundheilendes Peptid von Pereskia bleo (pB1; Kaktus; PDB: 5XBD) , (E) LhKNOT, (F) antimykotisches Peptid „Drosomycin“ von Drosophila spp. (Drosomycin; Fliege; PDB: 1MYN), (G) Conotoxin GS (Conotoxin GS; Kegelschnecken; PDB: 1AG7), (H) antimikrobielles Peptid Tachystatin A, isoliert aus Pfeilschwanzkrebsen (Tachystatin A; Pfeilschwanzkrebse; PDB: 1CIX) und (I) Chlorotoxin, ein kleines Skorpiontoxin von Leiurus quinquestriatus (Chlorotoxin; Skorpion; PDB:1CHL), das das kationische CPC-Clip-Motiv zeigt. Die Abbildungen sind so ausgerichtet, dass sie die Struktur des CPC-Clips optimal darstellen. Die elektrostatischen Oberflächenpotentiale sind farblich abgestuft von –4 kT/e (rot) bis plus 4 kT/e (blau).

2.5. In Silico-Mutationsanalyse des LhKNOT-CPC-Clips enthüllt einen sekundären CPC-Clip

Modelle von drei In-silico-LhKNOT-Mutanten (R1A, S3A, R14A) wurden untersucht, um Bindungsinteraktionen von Wildtyp- und Mutantenproteinen zu vergleichen. Im Fall der R14A-Mutante wurde überraschenderweise gezeigt, dass Heparin mit einem sekundären CPC-Clip assoziiert ist, der die R1-, S3- und R30-Reste anstelle der R1-, S3- und R14-Motive im Wildtyp umfasst (ergänzende Abbildung S4). Doppel- oder Dreifachmutanten (R14A-R1A; R14A-S3A-R1A) zeigten jedoch keine Wechselwirkung mit einem der primären oder sekundären CPC-Clip-Motivreste (Ergänzende Abbildung S4C, D).

Die In-silico-Mutanten mit der R1A-Mutation (die sowohl das primäre als auch das sekundäre CPC-Clip-Motiv unterbricht) zeigten jedoch eine Assoziation von Heparin mit R29 und R30, da sie die einzige verbleibende kationische Oberfläche darstellen (Ergänzende Abbildung S4C, D). Interessanterweise assoziiert der Ligand lieber mit dem CPC-Clip-Motiv, sowohl im Fall des primären als auch des sekundären Clips, über diese zusätzliche kationische Oberfläche, wenn das Motiv verfügbar ist, was darauf hindeutet, dass die spezifische Wechselwirkung des CPC-Clips eine stabilere Assoziation ermöglichen könnte eine unspezifische elektrostatische Wechselwirkung.

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