In Silico-basierter Bildschirm synergistische Wirkstoffkombinationen aus Kräuterarzneimitteln: Ein Fall mit Cistanche Tubulosa

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Neuroinflammationist durch das ausgearbeitete Repertoire an Entzündungsreaktionen des Gewebes des Zentralnervensystems gekennzeichnet. Die Einschränkungen der derzeitigen Behandlungen für Neuroinflammation sind wohlbekannte Nebenwirkungen in den klinischen Studien zur Monotherapie. Kombinationstherapien sind vielversprechende Strategien, um die Kompensationsmechanismen und Off-Target-Effekte zu überwinden. Die Entdeckung synergistischer Wirkstoffkombinationen aus Kräuterarzneimitteln ist jedoch selten. Ermutigt durch die erfolgreich angewandten Fälle gehen wir weiter, um die wirksamen Arzneimittelkombinationen auf der Grundlage der Systempharmakologie unter Verbindungen von Cistanche tubulosa (SCHENK) R. WIGHT zu untersuchen. Zunächst werden 63 potenzielle bioaktive Verbindungen und die damit verbundenen 133 direkten und indirekten Ziele durch die Bewertung der Arzneimittelähnlichkeit in Kombination mit dem Verfahren zur Arzneimittelausrichtung herausgesiebt. Zweitens wird das Compound-Target-Netzwerk aufgebaut, um den Datensatz für die Vorhersage von Arzneimittelkombinationen zu erfassen. Wir listen die 10 besten Arzneimittelkombinationen auf, die vom Algorithmus Probability Ensemble Approach (PEA) verwendet werden, und das Compound-Target-Pathway-Netzwerk wird dann aus den 12 Verbindungen der Kombinationen, Targets und Signalwege konstruiert, um die entsprechenden pharmakologischen Wirkungen aufzudecken. Schließlich wird ein integrativer Pathway-Ansatz entwickelt, um die therapeutischen Wirkungen des Krauts in verschiedenen pathologischen Merkmalen und relevanten biologischen Prozessen aufzuklären. Insgesamt kann das Verfahren einen produktiven Weg zur Entwicklung von Arzneimittelkombinationstherapeutika bieten.

NeurogenNeuroinflammationist definiert als orchestrierte Aktionen von angeborenen und adaptiven Immunzellen, Gefäßzellen und Neuronen, die durch pathologische Zustände und verstärkte neuronale Aktivität im Zentralnervensystem (ZNS) ausgelöst werden. Es spielt wahrscheinlich eine Rolle beim Priming des ZNSentzündlichReaktionen durch Zustände wie Schmerzen, psychische Belastungen und Epilepsie oder werden zum pathogenen Faktor bei neurodegenerativen Erkrankungen. Das derzeitige Mittel zur Behandlung von Neuroinflammation gehört hauptsächlich zur Monotherapie, einschließlich Dopamin, Somatostatin, Neuropeptid, Adenosin und so weiter. Allerdings kann beispielsweise die langfristige Anwendung der üblichen, aber alten Medikamente COX-Hemmer, nichtsteroidale Antirheumatika (NSAIDs), unerwünschte Nebenwirkungen, Magen-Darm-Läsionen oder kardiovaskuläre Risiken verursachen1,2 und die Ergebnisse klinischer Studien bleiben insbesondere unbefriedigend3, 4, es besteht also ein ungedeckter Bedarf an neuen Behandlungen der Neuroinflammation.

Die neuartige kombinatorische Arzneimitteltherapie kann eine aufstrebende Strategie sein, um die Anforderungen der Entwicklung neuartiger Arzneimittel zu erfüllen und Hürden bei der Behandlung komplexer Erkrankungen zu überwinden. Eine Kombination aus Mehrkomponententherapie könnte die oben genannten Anforderungen erfüllen, bei der zwei oder mehr Medikamente zusammen verwendet werden5, mit den aufgeführten Vorteilen: höhere Wirksamkeit, minimale Kreuzresistenz, niedrige Dosis bei weniger Nebenwirkungen und weniger Toxizität im Vergleich zu Einzelmedikamenten Agent6. Es wird seit fast 30 Jahren zur Behandlung komplexer Krankheiten7,8 eingesetzt. Interessanterweise wird die medikamentöse Kombinationstherapie auch in der Erforschung neurologischer Erkrankungen angewendet, zum Beispiel könnte die Kombination von Glimepirid und Ibuprofen Entzündungen bei der Alzheimer-Krankheit (AD)9 wirksam reduzieren oder Ketamin/Atropin könnte die Expression von entzündungsfördernden Proteinen bei epileptischen Mäusen verringern10. Synergistische Wirkstoffkombinationen können daher neue Anregungen für die Suche nach wirksamen Behandlungen fürNeuroinflammation. Wie können wir also die harte Nuss knacken, um die optimalen kombinatorischen Medikamente zu erhalten?

1Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Bildungsministerium, School of Life Sciences, Northwest University, Xi'an, China. 2Labor für Systempharmakologie, Zentrum für Bioinformatik, College of Life Science, Northwest A&F University, Yangling, China. 3State Key Laboratory of New-Tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Jiangsu Kanion Parmaceutical Co. Ltd, Lianyungang, China. Jianling Liu und Jinglin Zhu haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen. Korrespondenz und Materialanfragen sind an CZ zu richten

Jianling Liu1, Jinglin Zhu1, Jun Xue1, Zonghui Qin1, Fengxia Shen1, Jingjing Liu1, Xuetong Chen2, Xiaogang Li1, Ziyin Wu2, Wei Xiao3, Chunli Zheng1 und Yonghua Wang1

Heutzutage existieren folgende Ansätze zum Screening von Wirkstoffkombinationen, systematische Erhebungen von Wirkstoffpaaren in vitro wie das Hochdurchsatz-Screening-Verfahren11 und das „Multiplex Screening for Interacting Compounds“ (MuSIC)12 oder Auswertungen der paarweisen Wirkstoffkombinationen mit großen -Experimente13,14. Nichtsdestotrotz kann der übermäßige Verbrauch an Arbeitskräften, natürlichen Ressourcen und die Zeit für mühsame empirische Tests ein unvermeidliches Problem bei der Bewertung wirksamer Arzneimittelkombinationen sein. Als Reaktion auf die Überwindung der Mängel sind auch Ansätze für die kombinatorische Wirkstoffforschung entstanden, die auf Netzwerkanalysen basieren, insbesondere auf genetischen Interaktionsnetzwerken15, chemischen systembiologischen Daten16 sowie molekularen und pharmakologischen Daten17. Darüber hinaus schlug eine wachsende Zahl von Forschern18,19 neuartige Netzwerkansätze zur Vorhersage optimaler Kombinationen vor und bot inzwischen die entsprechende experimentelle Validierung an, sodass die Integration von Netzwerkvorhersage und experimenteller Validierung ein neuer Trend im Bereich der kombinatorischen Vorhersage sein könnte.

Pflanzliche Arzneimittel umfassen eine beträchtliche Anzahl von Formeln (Fang-Ji in Mandarin) und chemischen Inhaltsstoffen, die eine Naturproduktdatenbank bilden, so dass sie innovative Hinweise und grundlegende biologische Daten für die Entwicklung von Arzneimittelkombinationen liefern könnten, wie Professor Li20,21 und Professor Liu22 führte ganzheitliche Analysemethoden ein, die auf integrierter Biologie basieren, um die molekularen Mechanismen pflanzlicher Arzneimittel zu entschlüsseln: Liu-Wei-Di-Huang-Pille oder reduzierende Injektion. In unserer früheren Arbeit fanden wir nicht nur zwei repräsentative Kräuter, Lonicera japonica und Fructus Forsythia, die synergistische Wirkungen auf Influenza oder Entzündungen zeigen23, sondern auch die Verbindungen Rutin und Amentoflavon zeigen synergistische Wirkungen bei der Vorbeugung von Depressionen24.

In unserer aktuellen Arbeit entwickeln wir einen systempharmakologischen Ansatz, um die synergistischen Wirkstoffkombinationen zwischen Verbindungen aus dem Kraut zu entdeckenCistanche tubulosa(SCHENK) R. WIGHT werden die folgenden Schritte vorgeschlagen: Erstens suchen wir bioaktive Verbindungen durch Vorhersage der Arzneimittelähnlichkeit heraus, die als Köder verwendet werden, um die entsprechenden Ziele zu fischen. Und dann, inspiriert von einem auf „Netzwerkzielen“ basierenden Paradigma zur Priorisierung synergistischer Wirkstoffkombinationen mit hohem Durchsatz25, erwerben wir wirksame Wirkstoffkombinationen unter den potenziellen Verbindungen auf der Grundlage eines internen Algorithmus, der als Probability Ensemble Approach (PEA)26 bezeichnet wird hohe Trainingseffizienz, umfassende Anwendbarkeit und zwei quantitative Indizes zur Beschreibung der Eigenschaft einer Wirkstoffkombination. Schließlich verwenden wir die erhaltenen Ziele und die Verbindungen von Kandidatenpaaren, um ein Netzwerk/einen Weg aufzubauen und dann eine Analyse bereitzustellen, um den Mechanismus von zu codierenCistanche tubulosaanNeuroinflammationganzheitlich. Zum Beispiel ist es das erste Mal, wirksame Wirkstoffkombinationen aus Naturprodukten auf der Grundlage der Systempharmakologie durch die Integration von Computermethoden und experimenteller Validierung herauszufiltern, um die Zuverlässigkeit der Vorhersage zu bestätigen. Wir glauben, dass dies zur Personalisierung beitragen kannBehandlung von Neuroinflammation, verbessern unser Verständnis der effektiven neuroprotektiven Entwicklung und werden die zukünftige vorklinische Forschung unterstützen.

Ergebnisse

Ziele von Cistanche tubulosa.

Um die zugehörigen Ziele zu erhaltenNeuroinflammationerreichen wir zunächst die Zutaten inCistanche tubulosa(SCHENK)R. WIGHT durch Durchsuchen der TCMSP-Datenbank (http://lsp.nwu.edu. cn/), was zu 103 Verbindungen führt (Ergänzungstabelle S1, siehe Materialien und Methoden). Dann analysieren wir ihre Arzneimittelähnlichkeit, indem wir das in unserer vorherigen Arbeit erstellte DL-Vorhersagemodell anwenden (siehe Materialien und Methoden). Auf diese Weise erreichen wir 63 potenzielle bioaktive Verbindungen (Ergänzungstabelle S2) mit einem DL-Index größer oder gleich 0,18. Anschließend identifizieren wir mithilfe der Sys DT- und WES-Algorithmen 117 Ziele dieser potenziellen bioaktiven Verbindungen. Schließlich werden 43 potenzielle Ziele (Ergänzungstabelle S3), die eng mit Neuroinflammation verwandt sind, nach dem Löschen von Rauschen und Fehlern abgerufen, indem die 117 Ziele der Verbindungen der CTD-Datenbank zugeordnet werden.

GOBP-Anreicherungsanalyse für Targets.

Um zu überprüfen, ob die Proteine, auf die die potenziellen bioaktiven Verbindungen abzielen, eng verwandt sindNeuroinflammationführen wir eine GOBP-Anreicherungsanalyse durch, indem wir Targets auf DAVID abbilden. Abb. 1 zeigt einen GO-Baum, der die Ergebnisse signifikant angereicherter GOBP-Terme darstellt (P-Wert kleiner als oder gleich 0,05), wobei die Ziele in 20 verschiedene Gruppen kategorisiert sind, wie z. B. positive Regulation der glatten Gefäßmuskulatur Zellproliferation und positive Regulation der Leukozytenmigration. Unter diesen Gruppen sind die chemische synaptische Übertragung,entzündlichReaktion, Zell-Zell-Signalisierung und so weiter sind alle eng damit verbundenNeuroinflammation. Beispielsweise werden die synaptischen Veränderungen, die bei neuroinflammatorischen Erkrankungen auftreten, weitgehend vermittelt durchentzündlichZytokine, die von infiltrierenden T-Zellen und von aktivierten Mikroglia freigesetzt werden und zumindest teilweise für die irreversible dendritische Pathologie verantwortlich sind (insgesamt legen diese Beobachtungen nahe, dass die vorhergesagten Ziele wahrscheinlich zur Behandlung von beitragen könnenNeuroinflammation.

Aufbau und Analyse von Compound-Target-Netzwerken.

Im Allgemeinen sind praktikable und wirksame Kombinationstherapien Kombinationen von bioaktiven Verbindungen mit idealen pharmakokinetischen Eigenschaften, die das Krankheitsnetzwerk durch Regulierung spezifischer Ziele ausgleichen können. Daher konstruieren wir weiter ein statisches Compound-Target-Netzwerk, um ihre topologischen Beziehungen zu überprüfen. Wie in Abb. 2 gezeigt, zeigt das zweiteilige Compound-Target(CT)-Netzwerk 482 Wechselwirkungen zwischen 63 Verbindungen und 43 Targets auf optisch ansprechende Weise. Wir analysieren den Grad der Knoten im Compound-Target-Netzwerk, was zu einem durchschnittlichen Grad pro Compound von 11,209 bzw. 7,651 pro Target führt. Wir beobachten, dass unter den 63 Verbindungen 38 von ihnen mehr als 7 Ziele anpassen (größer als der Durchschnitt), was die potenziellen synergistischen Effekte zwischen ihnen manifestiert.

Zum Beispiel interagiert Syringin (mol30) mit der größten Anzahl von Targets, die möglicherweise eine zentrale Rolle im Netzwerk spielen. Interessanterweise belegt eine Studie, dass der aus Euonymus alatus (Thunb.) Sieb. (Celastraceae) hat eine anti-neuroinflammatorische Wirkung durch Hemmung der NO-Produktion2.2'-Acetylacteosid (mol42) kontrolliert 10 verschiedene Ziele (Grad =10). Ein Beispiel ist ein molekulares Chaperon, das bei vielen Krankheiten und Verletzungsmodellen neuroprotektive Eigenschaften aufweist. Bei Verbascosid (mol33) umfassen die neuroprotektiven Eigenschaften dieser bioaktiven Verbindung die Modulation von Transkriptionsfaktoren und folglich eine veränderte Genexpression, was zu einer Herunterregulierung der Entzündung führt30. Es ist erwähnenswert, dass, obwohl die Topologieeigenschaft des Netzwerks nicht in Richtung Echinacosid (mol41, Grad =7) voreingenommen ist, es eine potenzielle neue oral aktive Verbindung zur Regulierung von Neuroinflammation und verwandten Signalen bei der Parkinson-Krankheit ist und eine neue liefern könnte Aussicht auf klinische Behandlung. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass die gescreenten potenziellen Wirkstoffe alle mit Neuroinflammation in Zusammenhang stehen und als Datensatz zur Vorhersage von Arzneimittelkombinationen angesehen werden können.

Aufbau und Analyse von Compound-Target-Pathway-Netzwerken.

Durch die Anwendung des PEA-Algorithmus erhalten wir 10 verschiedene Arzneimittelkombinationen (Tabelle 1.), die 12 Verbindungen beinhalten. Diese Wirkstoffkombinationen weisen alle eine hohe Synergiewahrscheinlichkeit auf, was die Möglichkeit darstellt, eine Synergie zwischen zwei Verbindungen zu induzieren. Diese Verbindungen gelten daher gewissermaßen als die pharmakologischen Grundstoffe von Cistanche tubulosa. Basierend auf den Zielinformationen dieser Verbindungen und den von DAVID abgeleiteten Signalwegen konstruieren wir das Compound-Target-Pathway (CTP)-Netzwerk, um vorläufig die molekularen Mechanismen dieser Verbindungen zu beleuchten. Das resultierende Compound-Target-Pathway-Netzwerk besteht aus 47 Knoten und 99 Kanten. Wie in Abb. 3 dargestellt, können diese Verbindungen nicht nur auf die Proteine ​​stromaufwärts, sondern auch stromabwärts der mit Neuroinflammation assoziierten Signalwege einwirken, insbesondere auf die direkten Indikatoren von Entzündungsmarkern.

Insbesondere zielt die überwiegende Mehrheit der Verbindungen auf die stromaufwärts gelegenen Proteine ​​wie HSPB1, HTR2A, NTSR1 und andere ab, was auf die Makroregulation dieser Verbindungen für die Behandlung von Neuroinflammation hinweist. Beispielsweise zielt die Verbindung Echinacosid (mol41) auf den VEGF-Weg durch das Protein HSPB1 ab (ergänzende Abbildung 1). Glücklicherweise zeigen Studien, dass HSPB1 signifikante zytoprotektive Eigenschaften in mehreren Modellen neurologischer Erkrankungen in vivo oder in vitro hat und eine Rolle bei der entzündungshemmenden Wirkung spielen kann, indem es den Nuklearfaktor-KB(NF-KB)-Signalweg reguliert435. Eine Studie zeigt auch, dass R-Ras die angiogenen Aktivitäten von Endothelzellen teilweise über die Hemmung der p38-Mitogen-aktivierten Proteinkinase (p38 MAPK)-HSPB1-Achse des VEGF-Signalwegs regulieren könnte*.

Wir können feststellen, dass die Verbindung Tubulosid A (mol56) auf den Calcium-Signalweg durch das Protein NTSR1 im Netzwerk abzielt. Es ist allgemein bekannt, dass Calcium-Ionen (Ca² plus) ein universeller zweiter Botenstoff in den Zellen des Immunsystems sind. Die Verringerung der synaptischen Aktivität oder die verstärkte extrasynaptische N-Methyl-D-Asparaginsäure (NMDA)-Rezeptorsignalisierung kann zu einer nukleären Calcium-Dyshomöostase führen37,38, wodurch das Auftreten von Neurodegeneration und kognitiver Dysfunktion verstärkt wird. Darüber hinaus ist das Zielprotein NTSR1 ein Mitglied der großen Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, und die Signalübertragung wird durch die Bindung von G-Proteinen erzeugt, die ein Phosphatidylinositol-Calcium-Second-Messenger-System und nachgeschaltete MAP-Kinasen aktivieren können9.

Ein weiteres Beispiel ist, dass die Verbindung 2'-Acetylacteoside (mol42) auf den GnRH-Signalweg durch das Protein PRKCD abzielt. PRKCD, eine der PKC-Isoformen, ist ein Hauptmediator der Aktivierung von extrazellulär regulierten Proteinkinasen 1/2 MAPK (ERK1/2 MAPK), c-Jun N-terminalen Proteinkinasen MAPK (JNK MAPK) und p38 MAPK durch Gonadotropin- Releasing-Hormon (GnRH)0. Und als Schlüsselprozesse im GnRH-stimulierten Signalnetzwerk könnten die nachgeschalteten MAPK-Kaskaden und Arachidonsäure(AA)-Metabolite produzierenentzündlichProtein, COX-2. Kankanosid O (mol18) und Syringin (mol30) interagieren direkt mit den nachgeschalteten Proteinen PTGS2, NOS2 und anderenentzündlichIndikatoren, die eine intuitive Widerspiegelung der Wirksamkeit der Verbindungen sind. Eine Studie zeigt, dass Syringin die Produktion von Tumornekrosefaktor-c (TNF-c) in mit Lipopolysacchariden (LPS) stimulierten RAW264.7-Zellen unterdrücken könnte42. Und die anderen Studien zeigen, dass Svringin auch die NO-Konzentration und die NOS-Aktivität oder die Produktion von Prostaglandin E2 senken könnte. Auf Isoacteosid (mol43) gerichtetes MMP9 spielt eine wichtige Rolle im zentralen Nervensystem und wäre ein mutmaßliches vermittelndes Enzym für neuropsychiatrische Erkrankungen wie Schizophrenie und bipolare Erkrankungen5, den Abbau von NF-KB und die Phosphorylierung von p38, ERK1/2, JNK MAPK oder Akt (Proteinkinase B) der vorgeschalteten Signalwege könnten die MMP9-Genexpression und die Hemmung von MMP9 modulieren, was die Expression von induzierbaren Stickoxid-Synthase (iNOS)-inaktivierten Zellen verringern könnte46-48

Pfadanalyse.

Ein eingebauter "Neuroinflammationsweg" wird durch Integrieren der Schlüsselwege konstruiert, die durch Analyse des Verbindungs-Ziel-Weg-Netzwerks erhalten wurden, einschließlich des Wegs der Alzheimer-Krankheit, des Calcium-Signalwegs, des GnRH-Signalwegs, des VEGF-Signalwegs und der serotonergen Synapse. Von den 43 Targets lassen sich 19 dem „Neuroinflammation Pathway“ zuordnen. Wie in Abb. 4 gezeigt, stellt die Cistanche tubulosa die Ziele der Wirkstoffe dar, die sich im „Neuroinflammation Pathway“ verteilen. Der „Neuroinflammation Pathway“ wird in 13 verschiedene therapeutische Module eingeteilt, wie Zelltod, Apoptose, Entzündung und Neuroprotektion. In dieser Studie nehmen wir Zelltod-, Entzündungs- und Neuroprotektionsmodule als Beispiele, um den Mechanismus von Cistanche tubulosa für Neuroinflammation zu klären.

Zelltod-Modul. Ziele, die sich im Weg der Alzheimer-Krankheit befinden, sind hauptsächlich am Zelltodprozess beteiligt, was darauf hindeutet, dass der Zelltod eng mit der Neuroinflammation zusammenhängt. Studien zeigen, dass eine durch Mikroglia vermittelte Neuroinflammation zum neuronalen Zelltod beiträgt, der nicht auf eine bestimmte Krankheit beschränkt ist, sondern an verschiedenen Krankheiten wie Ischämie4, Parkinson-Krankheit und Alzheimer-Krankheit5l beteiligt ist. Wie in Abb. 4 gezeigt,

zielt auf APP, GRIN2B und MAPT ab und wird durch die Wirkstoffe von Cistanche tubulosa reguliert, was darauf hinweist, dass sie den Zelltod hemmen und dadurch eine Behandlung von Neuroinflammation bieten können. Interessanterweise beeinträchtigt die intrazelluläre Domäne von APP die adulte Neurogenese in transgenen Mäusen, indem sie eine Neuroinfammation induziert52. Die Unfähigkeit von MAPT reguliert die Dynamik der neuronalen Mikrotubuli richtig und vermittelt somit den neuronalen Zelltod53. All dies weist darauf hin, dass Cistanche tubulosa Neuroinflammation behandeln kann, indem es den Zelltod hemmt.

Entzündungsmodul.

Der Begriff Neuroinflammation bezeichnet die entzündlichen Reaktionen im ZNS als Reaktion auf neuronale Aktivität1. In dieser Studie erkennen wir die Beteiligung des GnRH-Signalwegs und des VEGF-Signalwegs am Entzündungsmodul (Abb. 4). Beispielsweise gehört MMP2 im GnRH-Signalweg zur Familie der MMPs, die in physiologischen Situationen und pathologischen Zuständen mit Entzündung exprimiert werden. Und MMPs regulieren mehrere Funktionen im Zusammenhang mit Entzündungen, einschließlich der Bioverfügbarkeit und Aktivität von entzündlichen Zytokinen und Chemokinen54. Darüber hinaus kann der VEGF-Signalweg zur Bildung von NOS2 führen, außerdem ist er durch mehrere Mechanismen an der akuten Entzündungsreaktion auf LPS beteiligt: ​​Beteiligung an der proinflammatorischen Zytokin-Signalübertragung und Veränderung der Expression verschiedener Gene, die sich auf entzündliche Immunantworten auswirken LPS55. Zusammengenommen weisen all diese darauf hin, dass Cistanche tubulosa Neuroinflammation heilen kann, indem sie das Entzündungssystem reguliert.

Neuroprotektionsmodul.

Neuroprotektion sind die Mechanismen und Strategien zum Schutz vor neuronaler Schädigung oder Degeneration im ZNS nach akuten Erkrankungen (z. B. Schlaganfall oder Verletzung/Trauma des Nervensystems) oder als Folge chronischer neurodegenerativer Erkrankungen (z. B. Parkinson, Alzheimer, Multiple Sklerose). Das Ziel der Neuroprotektion ist es, die neuronale Dysfunktion/den Tod nach einer ZNS-Verletzung zu begrenzen und zu versuchen, die höchstmögliche Integrität der zellulären Interaktionen im Gehirn aufrechtzuerhalten, was zu einer ungestörten neuralen Funktion führt. Wie aus Fig. 4 ersichtlich ist, sind einige Ziele auf dem serotonergen Synapsenweg an der Funktion der Neuroprotektion beteiligt. Beispielsweise ist die Produktion von Prostaglandinen durch PTGS1 und PTGS2 (auch bekannt als COX-1 und COX-2) ein wesentlicher Mediator beim Hervorrufen von entzündungshemmenden und neuartigen Pro-Resolving-Mechanismen56. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat gezeigt, dass die Genexpression von ADCY5, einem Enzym, das die Bildung von cAMP57 ​​katalysiert, durch Promotormethylierung in COX-2--induzierten menschlichen HCC-Zelllinien reduziert wird58. Basierend auf der obigen Analyse spekulieren wir, dass die COX-2-Akkumulation die Sekretion von sAPP, die Spaltung von APP, gespalten durch -Secretase, die durch cAMP moduliert wird, beeinflussen und weiter den neuroprotektiven Effekt ausüben kann59,60. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Neuroprotektion eine wichtige Rolle bei der Behandlung von Neuroinflammation spielt.

Experimentelle Validierung

Die Lebensfähigkeit von BV2-Mikrogliazellen, die mit den Verbindungen behandelt wurden.

BV2-Mikrogliazellen (8×104 Zellen/ml) werden mit Konzentrationen von 37,5 bis 300 uM pro Milliliter Kulturmedium ohne Serum der vier Verbindungen für 24 h gefüttert. Wir betrachten die Zelllebensfähigkeit der Kontrollgruppe, die in Abwesenheit von Serum mit weniger als 0,1 Prozent DMSO kultiviert wurde, als 100 Prozent (Fig. 5 (ad)). Anscheinend wird bei den vorgeschriebenen Dosierungen der Gruppen keine signifikante zelluläre Zytotoxizität beobachtet.

Validierung von Arzneimittelsynergien und potenzieller entzündungshemmender Wirkung in vitro.

Um die erhaltenen Ergebnisse in silico weiter zu bewerten, werden vier Verbindungen, die drei synergistische Paare abdecken, nämlich Isoacteosid, 2'-Acetylacteosid, Echinacosid und Verbascosid, ausgewählt, um ihre synergistischen Arzneimittelwirkungen und potenziellen entzündungshemmenden Wirkungen unter Verwendung von mit LPS behandelten BV2-Zellen zu untersuchen. Insbesondere führen wir eine Western-Blot-Analyse für die iNOS- und COX-2-Proteinexpression durch, um die synergistischen und entzündungshemmenden Wirkungen der vorhergesagten Arzneimittelkombinationen zu bestätigen.

Wie in Abb. 5 (z. B.) gezeigt, werden die Konzentrationen von iNOS- und COX-2-Proteinen in der Reihe der getesteten BV2-Zelllinien angegeben. Wir beobachten, dass sowohl die Isoacteosid- als auch die 2'-Acetylacteosid-Behandlung die Proteinexpression von iNOS und COX-2 in BV2-Zellen bei unterschiedlichen Dosierungen signifikant verringert. Die Behandlung mit der Kombination aus Isoacteosid und 2'-Acetylacteosid induziert jedoch einen signifikanten Anstieg der Entzündungsfaktoren iNOS und COX-2(Abb. 5(e)). Abbildung 5(1) zeigt, dass die Behandlung mit Echinacosid oder Verbascosid als Einzelwirkstoff eine Abnahme der iNOS- und COX-2-Expression bewirkt. Darüber hinaus führte die Behandlung mit Echinacosid in Kombination mit Verbascosid in einer Konzentration von 150 μM erwartungsgemäß zu einer stärkeren Abnahme der Proteinexpression (iNOS und COX-2), was auf die synergistischen entzündungshemmenden Wirkungen hinweist Medikamentenkombination. In ähnlicher Weise zeigt die Kombination von Echinacosid und 2'-Acetylacteosid, wie in 5(g) angegeben, eine signifikante synergistische Wirkung auf die Hemmung von COX-2 bei einer Konzentration von 75 &mgr;M oder 300 &mgr;M. Für iNOS bei einer Dosierung von 300 μM stellt die Kombination jedoch eine deutliche Unterdrückung des Proteins dar. Im Gegensatz dazu stellen wir fest, dass es bei der Kombination von Isoacteosid und 2'-Acetylacteosid oder Echinacosid und Verbascosid bei einer Konzentration von 75 μM (ergänzende Abbildung 2) keine offensichtlichen Hemmwirkungen sowohl auf iNOS als auch auf COX-2 gibt, außerdem Behandlung mit anderen Paaren zeigt eine viel schwächere Wirkung im Vergleich zu den Einzelmitteln bei der Dosierung von 150 oder 300 μM, die in Abb. 5 (z. B.) zu sehen ist.

Zusammenfassend liefert die In-vitro-Studie zusätzliche Informationen für das Screening von Arzneimittelkombinationen mit starken entzündungshemmenden Wirkungen und demonstriert die Zuverlässigkeit der In-silico-Screening-Strategie.

Diskussion

Neuroinflammation ist an den meisten neurologischen, psychiatrischen und neurologischen Entwicklungserkrankungen beteiligt, da dies nicht nur eine Folge ist, sondern ein Auslöser der Pathologie sein könnte6!. Derzeitige Behandlungen für neuroinflammatorische Erkrankungen sind jedoch meist Monotherapien, die, wie wir wissen, durch bekannte Nebenwirkungen eingeschränkt sind. COX-2-Hemmer können zu kardiovaskulären Defekten führen, die auf eine Langzeitbehandlung ansprechen, und eine TNF-gerichtete Behandlung könnte durch Immunsuppression eine Infektion verursachen62. Kombinatorische Therapieansätze können zwingend erforderlich sein, um die Behandlung komplexer Erkrankungen mit folgenden Vorteilen zu verbessern: die Widerstandsfähigkeit des Netzwerks und die Bypass-Kompensation. die erhöhte klinische Wirksamkeit bei gleichzeitig minimaler Humantoxizität und die reduzierte Dosierung jeder Verbindung63. Jedoch ist die Erforschung der synergistischen Arzneimittelkombinationen unter Verbindungen, die von Kräuterarzneimitteln abgeleitet sind, basierend auf Systempharmakologie, durch den möglichen Hauptgrund großer Mengen an Verbindungen wenig eingeschränkt.

In the work, we firstly gain 63 potential bioactive compounds from the herb Cistanche tubulosa, fulfilling the criteria (DL>0.18) zur weiteren Analyse mit Hilfe der Vorhersage, die unabdingbar ist, um vielversprechendere Moleküle mit wünschenswerten Eigenschaften auszusortieren. Nachdem wir die 133 Ziele der 63 potenziellen bioaktiven Verbindungen der Datenbank zugeordnet haben, erhalten wir 43 Ziele im Zusammenhang mit Neuroinflammation, und dann kann die GOBP-Clustering-Analyse der vorhergesagten Ziele wahrscheinlich zur Behandlung von Neuroinflammation beitragen. Das analytische Ergebnis des CT-Netzwerks zeigte einen durchschnittlichen Grad pro Verbindung von 11,209 bzw. 7,651 pro Ziel, und 38 davon justieren mehr als 7 Ziele (größer als der durchschnittliche Grad). Zum Beispiel könnten Echinacosid (mol41)4-, vorhergesagt mit 7 Zielen, Verbascosid (mol33)3067 mit 9 Zielen, oder Tubulosid B(mol57)686 mit 8 Zielen, eine Schlüsselrolle bei der Neuroprotektion im Einklang mit der zunehmenden Literatur spielen.

Wir erreichen direkte therapeutische Ziele wie APP, MAPT (auch bekannt als Tau), PPARG70, MMP9, MMP27172 und HTR2A (auch bekannt als 5-HT2A), GRIN2B (glutamationotroper Rezeptor NMDA-Typ Untereinheit 2B) und GRIA1( Glutamat-ionotroper Rezeptor AMPA-Typ-Untereinheit 1) oder nachgeschaltete potenzielle Ziele wie PTGS274 oder NOS27, die mit Neuroinflammation oder verschiedenen Erkrankungen des Nervensystems in Verbindung gebracht werden,

Die Analyse des Compound-Target-Pathway-Netzwerks zeigt 12 Verbindungen aus den Top-10-Wirkstoffpaaren durch den PEA-Algorithmus, verbunden mit den 43 potenziellen Zielen und den mit Neuroinflammation verbundenen Signalwegen, z. B. Calcium-Signalweg, neuroaktive Ligand-Rezeptor-Interaktion oder TNF-Signalweg und so weiter. In dem System könnten diese vorhergesagten Verbindungen nicht nur auf die Proteine ​​stromaufwärts, sondern auch stromabwärts von Signalwegen wirken, die mit Neuroinflammation und entzündlichen Biomarkern assoziiert sind. Insbesondere werden darüber hinaus zusätzliche Informationen für das Screening von Arzneimittelkombinationen mit potenziell entzündungshemmenden Wirkungen bereitgestellt und die Zuverlässigkeit der In-silico-Screening-Strategie durch experimentelle Validierung verifiziert. Der Neuroinflammationsweg besteht aus dem Alzheimer-Krankheitsweg, dem Calcium-Signalweg, dem GnRH-Signalweg, dem VEGF-Signalweg und der serotonergen Synapse. Die Analyseergebnisse erklärten uns deutlich, dass Zelltod, Entzündung und Neuroprotektionsmodule beispielhaft dargestellt werden, um den Mechanismus von Cistanche tubulosa zur Behandlung von Neuroinflammation zu entschlüsseln.

Neuroinflammation begleitet verschiedene neurodegenerative Erkrankungen, die nicht nur eine Folge, sondern auch ein Auslöser der Pathologie sein können, daher werden entzündungshemmende Therapien als vielversprechender Behandlungsansatz vorgeschlagen!. Obwohl wir die Grenzen der Monotherapien erkannt haben, sind zu unserer Enttäuschung die Bewertung und die zugrunde liegenden Mechanismen von Kombinationstherapien immer noch die größten Herausforderungen bei der Entwicklung der neuartigen alternativen Strategie. Diese Arbeit könnte daher neue therapeutische Möglichkeiten für Neuroinflammation bieten und einen neuen Weg zur Entdeckung von Arzneimittelkombinationen aus Naturprodukten eröffnen.

Materialen und Methoden

Sammlung von Verbindungen.

Insgesamt 66 chemische Inhaltsstoffe von Cistanche tubulosa werden manuell von TCMSP (http://lsp.nwuedu.cn/)6 gesammelt, darunter 26 Phenylethanoidglykoside, 22 Iridoide, 4 Lignane, 7 Monoterpenglykoside, 2 stickstoffhaltige Substanzen, 3 Benzol Acryloylzucker, 1 Sterol, 1 Ketol. Da Glykoside in Cistanche tubulosa normalerweise hydrolysiert werden, um Aglykon freizusetzen, das dann in der Darmschleimhaut absorbiert wird, nehmen wir daher die Moleküle ohne Glykolsäure in Betracht, die als qt gekennzeichnet sind. Dies führte zur Erzeugung der 103 Verbindungen. Diese Moleküle sind in der Ergänzungstabelle S1 angegeben.

Bewertung der Arzneimittelähnlichkeit. Um die potenziellen bioaktiven Verbindungen aus Cistanche tubulosa zu erhalten, bewerten wir die Arzneimittelähnlichkeit dieser Inhaltsstoffe, indem wir die Tanimoto-Ähnlichkeit77 zwischen pflanzlichen Verbindungen und den durchschnittlichen molekularen Eigenschaften aller Chemikalien in der Drugbank-Datenbank8 berechnen. Und das DL-Vorhersagemodell wurde in vielen Studien98 erfolgreich angewendet, um bioaktive Verbindungen auszuwählen. In der Arbeit wird der DL-Index größer als oder gleich 0.18 der Kandidaten als Schwellenwert definiert, um für die nachfolgende Analyse besser geeignet zu sein.

Vorhersage von Medikamentenzielen.

Die Identifizierung der Wirksamkeitsziele für führende Wirkstoffe bleibt ein wichtiger Schritt, um Wirkstoffe in die Arzneimittelentwicklung zu bringen. Hier werden zwei hauseigene Tools: SysDT und WES durchgeführt, um die molekularen Zielinformationen für das Drogenfischen abzuleiten. Sys DT ist ein In-Silio-Modell, das mit der Kombination chemischer, genomischer und pharmakologischer Informationen basierend auf den beiden leistungsstarken mathematischen Werkzeugen Random Forest (RF) und Support Vector Machine (SVM) durchgeführt wird, um das Problem der Zielidentifizierung effektiv anzugehen2. Das erhaltene Modell dient als wertvolle Plattform für die Vorhersage von Arzneimittel-Ziel-Wechselwirkungen mit einer Gesamtgenauigkeit von 97,3 Prozent, einer aktivierten Vorhersagegenauigkeit von 87,7 Prozent und einer gehemmten Vorhersagegenauigkeit von 99,8 Prozent Filterkriterien sind in dieser Studie definiert als RF-Wert größer als oder gleich 0,7 oder SVM größer als oder gleich 0,8.

Weighted Ensemble Similarity (WES) ist ein neues leistungsstarkes Rechenmodell, um die direkten Wirkstoffziele der tatsächlichen bioaktiven Inhaltsstoffe zu lokalisieren. Als neuartiges Werkzeug leistet das erhaltene Modell gute Ergebnisse bei der Vorhersage der Bindung mit einer durchschnittlichen Empfindlichkeit von 85 Prozent (SEN) und der nicht-bindenden Muster mit 71 Prozent (SPE) mit den durchschnittlichen Flächen unter den Receiver-Betriebskurven (ROC, AUC). von 85,2 Prozent und eine durchschnittliche Übereinstimmung von 77,5 Prozent. Die erhaltenen Targets werden weiter Uniprot (http://www,uniprot.org) zugeordnet, um ihre Namen und Organismen anschließend zu normalisieren. Hier wählen wir nur die Ziele von Homo sapiens für die weitere Analyse aus. Kandidatenziele der ausgewählten Verbindungen werden der CTD-Datenbank (http://ctdbase.org/) zugeordnet, um ihre verwandten Krankheiten zu erhalten, und wir filtern schließlich potenzielle Ziele im Zusammenhang mit Neuroinflammation.

GO-Anreicherung und Analyse für Targets. Um die beteiligten biologischen Prozesse der erhaltenen Ziele zu untersuchen, ordnen wir die Ziele DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov)8 zu und die Terme mit einem P-Wert von weniger als 0,05 werden ausgewählt diese Abteilung.

Analyse von Arzneimittelkombinationen.

In unserer früheren Arbeit wurde ein systempharmakologisches Framework genutzt, um Arzneimittelkombinationen auf einem neu entwickelten Modell mit dem Namen Probability Ensemble Approach (PEA) vorherzusagen, um die klinische Wirksamkeit und Nebenwirkungen von Arzneimittelkombinationen zu analysieren. Im Detail wurde ein Bayes'sches Netzwerk mit Integration in einen Ähnlichkeitsalgorithmus entwickelt, um die Kombinationen aus molekularer und pharmakologischer Wirkung der Verbindung zu modellieren. Die kombinierte Bewertung, die die klinische Wirksamkeit und die Nebenwirkungen für die vorhergesagten Paare abschätzte, wurde dann präsentiert26. Kurz gesagt, es zeigt, dass PEA die Wirksamkeit der Paare mit hoher Spezifität und Sensitivität (AUC=0.90) in unserer Arbeit vorhersagen konnte. In dieser Arbeit wählen wir die Top-Ten-Medikamentenkombinationen basierend auf ihren Synergiewahrscheinlichkeiten aus, die die Möglichkeit darstellen, Synergien zwischen zwei Verbindungen zu induzieren.

Aufbau und Analyse von Netzwerken/Pfadwegen.

Um die Beziehungen zwischen den Wirkstoffen und den entzündlichen Erkrankungen zu untersuchen, werden von Cytoscape 2.8.1, einem beliebten Bioinformatikpaket für die Visualisierung biologischer Netzwerke und Datenintegration, ein Compound-Target (CT)-Netzwerk und ein Compound-Target-Pathway-Netzwerk (CTP) generiert※. Die quantitativen Eigenschaften des Netzwerks werden von den beiden folgenden Plugins Network Analyzer und CentiScaPe 1.2 analysiert. In dem grafischen Netzwerk zeigen Knoten entweder Verbindungen, Ziele oder Wege an, während Kanten die Arzneimittel-Ziel-Wechselwirkung kodieren die aktuellen Informationen der Pathologie der Neuroinflammation. Zunächst werden die erreichten Zielprofile durch Kartierung auf die KEGG-Datenbank (http://www.genome.jp/kegg/) zu mehreren Pfaden aggregiert. Nach Verlassen der indirekten Abschnitte wird dann ein relativ synthetisierter Weg aufgrund der pathologischen und klinischen Daten manuell integriert.

Experimentelle Validierung

Probenvorbereitung.

Echinacosid, Verbascosid, Isoacteosid und 2'-Acetylacteosid werden von Nanjing Zelang Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, China) bezogen. Testproben werden in Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma, USA) gelöst, um 100 mM als Stammlösung zu erhalten, und dann bei 4°C gelagert. Die Endverdünnungen von DMSO, die dem Kulturmedium zugesetzt wurden, überstiegen nie 0,1 Prozent, die versicherten, dass es keine Auswirkung auf die Zelllebensfähigkeit gibt.

Zellkultur. BV2-Maus-Mikrogliazellen wurden ursprünglich von der Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften in Shanghai entwickelt und in 25- oder 75-cm2-Kolben mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM/25 mM HEPES) (Gibco BRL, USA) kultiviert, das mit 10 Prozent fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wurde. Gibco BRL, USA), Penicillin G (100 Einheiten/ml) und Streptomycin (100 mg/ml) in einem befeuchteten Inkubator mit 5 Prozent CO/95 Prozent O bei 37 Grad, 5 Prozent CO2.

Western-Blot-Analyse. Das zelluläre Protein wird aus Zelllinien unter Verwendung eines Qproteome Mammalian Protein Prep Kit (Qiagen, Deutschland) nach den angegebenen Verfahren gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Quick Stari Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, USA) wird zur Proteinquantifizierung verwendet. Äquivalente Proteinmengen (50ug) werden durch 10-minütiges Kochen bei 100 Grad mit 2*lämmli-Probenladepuffer (Bio-Rad, USA) plus 5 Prozent 3-Mercaptoethanol in einem Verhältnis von denaturiert 1:1 und pro Spur auf 12 Prozent SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Minigele) geladen, auf 0,45 um Polyvinylidenfluoridmembranen (PDVF) (Millipore, Bedford, MA, USA) für 150 min bei 200 mA elektrotransferiert. Anschließend werden die Membranen in 3 Prozent Rinderserumalbumin (BSA) bei Raumtemperatur blockiert und mit den Primärantikörpern iNOS und COX-2 (Abcam) über Nacht bei 4 Grad inkubiert. Nach drei gründlichen Waschungen in Tris-gepufferter Saline-Tween (TBST) für jeweils 5 min werden die Membranen mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten sekundären Antikörpern (1:10000 Verdünnungen; Abcam) für 1,5 h bei Raumtemperatur sondiert. Die immunreaktiven Banden werden dann unter Verwendung eines ECL-Chemilumineszenz-Nachweiskits (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien, USA) nach zweimaligem Waschen in TBST und einmal TBS für jeweils 5 min sichtbar gemacht. Densitometrische Werte werden unter Verwendung von -Actin als ladende interne Kontrolle normalisiert.

Statistische Analyse. Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler dargestellt, die Western-Blot-Analyse wird drei unabhängige Experimente mit dem gleichen Ergebnis wiederholt. Die einfache Varianzanalyse wird verwendet, um die Differenzen der Mittelwerte für drei oder mehr Gruppen zu vergleichen, die statistische Signifikanz wird mit dem Students-Test zwischen zwei Gruppen analysiert. Ausstattung und Einstellungen. In Abb.1 wurde Excel von Microsoft Office2013 verwendet.

In Abb. 2 wurde Cytoscape 2.8.1 verwendet. In Abb. 3 wurde Cytoscape 2.8.1 verwendet.

In Abb. 4 wurde Visio von Microsoft Office2013 verwendet.

In Abb. 5 wurde Graphpad Prism 6 und Visio von Microsoft Office 2013 verwendet.

Datenverfügbarkeit. Die Datensätze, die während der aktuellen Studie generiert und/oder analysiert wurden, sind auf begründete Anfrage beim korrespondierenden Autor erhältlich.

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Danksagung Die Forschung wird finanziell unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (Nr. U1603285, Nr. 81373892 und Nr. 31540008) und die Industrialisierung des Pilotprojekts im Bildungsministerium der Provinz Shaanxi: Industrialisierung von umweltfreundlichen Fermentationsfutterzusatzstoffen für Mikroorganismen (NR. 2010JC22).

Autorenbeiträge

Autorenbeiträge zu Konzeption und Design: JLL, YHW und CLZ konzipierten und gestalteten die Studie. Arzneimittelzielvorhersage und GO-Anreicherung und Analyse für Ziele: XTC und ZHQ Arzneimittelkombinationsanalyse und Aufbau und Analyse von Netzwerken/Pfadwegen: JLZ, ZHQ, FXS und JJL Experimente und Erfassung von Daten JLZ, JX und ZHQ Analyse und Interpretation von Daten JLZ , JX, ZYW und WX Erstellung des Manuskripts: JLZ und CLZ Genehmigt die endgültige Version des eingereichten Manuskripts: J.LL, CL.Z. und YH.W. Überarbeitet von CLZ, JLZ und XGL

zusätzliche Information

Ergänzende Informationen begleiten dieses Dokument unter https://doi.org/10.1038/s41598-017-16571-3. Interessenkonflikte: Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Hinweis des Herausgebers: Springer Nature bleibt neutral in Bezug auf Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

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