In-vitro-Evaluierung von P-gp-vermittelten Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln unter Verwendung des RPTEC/TERT1-Modells menschlicher Nierenzellen
Mar 01, 2022
Einführung Die In-vitro-Evaluierung des Hemmpotenzials von P-Glykoprotein (P-gp) ist ein wichtiges Thema während des Arzneimittelentwicklungsprozesses, da es die Vorhersage klinisch relevanter Arzneimittelwechselwirkungen (DDIs) ermöglicht [1–3]. P-gp gehört zur Superfamilie der ATP-Bindungskassetten (ABC)-Transporter und wird vom Multidrug-Resistenzgen MDR1 (auch bekannt als ABCB1) kodiert. Es ist bekannt, dass dieser Membrantransporter in Tumorzellen überexprimiert wird und Resistenzen gegen viele Krebsmedikamente verursacht [4]. Befindet sich innerhalb aller physiologischen Barrieren, einschließlich Darm, Leber undNieren, schützt P-gp vor Xenobiotika, indem es die Absorption dieser Substrate aus dem Verdauungstrakt begrenzt und ihren Ausfluss in die Galle und den Urin erleichtert. Somit spielt P-gp eine bemerkenswerte Rolle in der Pharmakokinetik verschiedener therapeutischer Klassen [5–7]. Eine Fülle von Arzneimitteln wie Antikrebsmitteln, Antimykotika und Herz-Kreislauf-Medikamenten sind als P-gp-Substrate und/oder -Inhibitoren bekannt, und viele von ihnen sind an klinisch relevanten Wechselwirkungen beteiligt [8–10]. Daher schreibt die US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) vor, dass das P-gp-Inhibitorpotential in den frühen Stadien der Arzneimittelentwicklung bewertet werden muss. Zu diesem Zweck durchgeführte In-vitro-Assays basieren üblicherweise auf Arzneimitteltransportstudien unter Verwendung von P-gp-exprimierenden Zelllinien. Genauer gesagt empfehlen die FDA-Richtlinien die Bestimmung der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) in vitro, um das Risiko klinischer DDIs infolge einer P-gp-Hemmung abzuschätzen. Zu diesem Zweck wurden viele experimentelle Assays durchgeführt, und die meisten von ihnen konzentrierten sich auf Arzneimittelwechselwirkungen im Zusammenhang mit der intestinalen Absorption unter Verwendung der Caco-2- oder MDCK-MDR1-Modelle [11–13].
CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENERKRANKUNGEN VERBESSERN
SeitNieren-Elimination ist auch ein üblicher Eliminationsweg für verschiedene Wirkstoffklassen, aktive tubuläre Sekretion über ABC-Transporter kann ebenfalls eine Schlüsselrolle bei diesen Wechselwirkungen spielen [14]. Allerdings liegen In-vitro-Daten vorNieren-Durch P-gp vermittelte DDIs sind begrenzt. Dies liegt zum Teil an der fehlenden Entwicklung und Charakterisierung von In-vitro-Modellen zur Vorhersage vonNieren-Drogentransport. Unter verschiedenen menschlichen Zelllinien scheint das RPTEC/TERT1-Modell vielversprechend für die Bewertung von zu seinNieren-Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten. Diese Zelllinie stammt von einem gesunden menschlichen Spender und wurde aus immortalisierten proximalen Tubuluszellen erzeugt. Darüber hinaus wurden die Expression und Funktionalität von P-gp unter Verwendung dieses Modells demonstriert, wodurch seine Vorhersagefähigkeit bestätigt wurdeNieren-Arzneimittelausbrüche [15, 16]. In diesem Zusammenhang wurde die vorliegende Studie entwickelt, um das P-gp-Inhibitorpotential unter Verwendung des RPTEC/TERT1-Modells zu untersuchen. Zunächst wurde ein Rhodamin 123 (R123)-Akkumulations-Screening-Assay durchgeführt, um ein Inhibitionsprofil für jedes getestete Medikament zu erhalten. Basierend auf diesem Screening wurden dann vier Medikamente zur Bewertung ihrer konzentrationsabhängigen Wirkungen auf die intrazelluläre Akkumulation von zwei P-gp-Substrat-Medikamenten ausgewählt: Apixaban und Rivaroxaban
Schlüsselwörter:Nierenzelle, Nierenmodell, Nierenmedikament, renale Ausscheidung, Nieren.
Materialen und Methoden
ReagenzienApixaban, [2H71 3C ] - api xa ban , ri var oxa ban ,[13C6]-Rivaroxaban, Nilotinib, Crizotinib, Erlotinib, Axitinib, Idelalisib, Warfarin und Dabigatranetexilat wurden von Alsachim (Illkirch, Frankreich). Verapamil, Ketoconazol, Simvastatin, Amiodaron, Rhodamin 123, Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS) und HEPES-Lösung wurden von Sigma-Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, Frankreich) bezogen.
Zellkultur RPTEC/TERT1-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Molsheim, Frankreich) erhalten und in hormonell definiertem, serumfreiem Medium kultiviert, das aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium F12 (ATCC), ergänzt mit einem Wachstumsfaktor-Kit (ATCC) und a 1 Prozent Antibiotikum/Antimykotikum-Mischung (Penicillin-Streptomycin, Amphotericin B) bei 37 Grad und 5 Prozent CO 2. Für alle Experimente wurden die Zellen in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 50,000 ausgesät. Zellen pro Vertiefung und wurden nach 14 Tagen Kultur zum Wachsen verwendet. Das Medium wurde alle 2 Tage erneuert und die Zellen wurden von Passage 27 bis Passage 34 verwendet. Caco-2-Zellen wurden auch von der ATCC bezogen. Die Zellen wurden in einem Kulturmedium bestehend aus Eagle's Minimal Essential Medium (Sigma-Aldrich, Missouri, USA), ergänzt mit 10 Prozent FBS, 1 Prozent nicht-essentiellen Aminosäuren und einer 1-prozentigen Antibiotika/Antimykotika-Mischung (Penicillin-Streptomycin, Amphotericin B ) bei 37 Grad und 5 Prozent CO2. Caco-2-Zellen wurden in Platten mit 96--Wells in einer Dichte von 5 × 10 3-Zellen pro Well ausgesät und nach 14 Tagen Kultur zum Wachsen verwendet. Humane proximale tubuläre Epithelzellen (HPTECs) wurden von BIOPREDIC (Rennes, Frankreich) erhalten und in DMEM/F12, ergänzt mit Hydrocortison, EGF, Insulin, Transferrin und Natriumselenit, kultiviert. Die Zellen wurden in kollagenbeschichtete Kulturplatten mit 96- Vertiefungen in einer Dichte von 6600 Zellen pro Vertiefung ausgesät und nach 11 Tagen Kultur zum Wachsen verwendet.
Rhodamin-123-Akkumulations-Screening-Assay Das P-gp-Inhibitionspotential wurde durch Messung der intrazellulären Akkumulation von Rhodamin 123 in RPTEC/TERT1-Zellen in Gegenwart und Abwesenheit verschiedener Arzneimittelklassen bestimmt. Unter den 14 getesteten Arzneimitteln wurden Cyclosporin A (10 µM), Ketoconazol (50 µM), Verapamil (100 µM) und Amiodaron (50 µM) als P-gp-Inhibitoren verwendet. Apixaban, Rivaroxaban und Dabigatranetexilat – drei direkte orale Antikoagulantien (DOACs) – wurden als P-gp-Substrate (10 µM) verwendet. Warfarin (50 µM) wurde als Nicht-Inhibitor verwendet, und fünf Krebsmedikamente, einschließlich Nilotinib, Crizotinib, Erlotinib und Idelalisib, wurden ohne Kenntnis ihrer Hemmungsprofile bei einer Konzentration von 10 µM verwendet. Mehrere Zustände wurden mit den Caco-2-Zellen reproduziert, die von der FDA für Arzneimitteltransportstudien zugelassen sind. Auf diese Weise wurde die intrazelluläre Retention von Rhodamin 123 in Caco-2-Zellen in An- und Abwesenheit von Verapamil (100 µM), Cyclosporin A (10 µM), Nilotinib (10 µM) und DOACs (10 µM) bestimmt ). Kurz gesagt, nach 14 Tagen Kultivierung in 96- Wellplates wurden die Zellen für 10 Minuten bei 37 Grad vorinkubiert, wobei jedes Arzneimittel in HBSS mit 10 mM HEPES (v/v) gelöst wurde. Dann wurden die Zellen mit 10 &mgr;M Rhodamin 123 für 45 min bei 37 Grad inkubiert. Schließlich wurden die Zellen nach dreimaligem Waschen in kalter HBSS/HEPES-Lösung bei Raumtemperatur für 45 Minuten in einer Lösung von Natriumdodecylsulfat (SDS), die 1 Prozent Natriumborat enthielt, lysiert. Die Menge an intrazellulärem Rhodamin 123 wurde unter Verwendung eines Infnite M Nanospektrofluorometers (Life Sciences, TECAN, Schweiz) quantifiziert, wobei die Wellenlängen auf 485/535 nm eingestellt wurden. Die Daten wurden als Prozentsätze der Rhodamin-123-Akkumulation in Kontrollzellen ausgedrückt, die keinen potenziellen P-gp-Inhibitoren ausgesetzt waren, und willkürlich auf 100 Prozent Akkumulation gesetzt.
DOAC Intrazellulärer Akkumulationsassay und IC50-Bestimmung Aus dem vorherigen Rhodamin-123-Screening-Assay wurden vier Wirkstoffe ausgewählt, um ihre konzentrationsabhängigen Wirkungen auf die intrazelluläre Akkumulation von Apixaban und Rivaroxaban (10 µM) in RPTEC/TERT1-Zellen zu untersuchen. Ketoconazol, Crizotinib und Nilotinib wurden als P-gp-Inhibitoren ausgewählt, und Warfarin wurde als Nicht-Inhibitor ausgewählt. Cyclosporin A (10 µM) wurde als Breitbandinhibitor von Transportern verwendet. Studien zu den Wechselwirkungen zwischen DOACs und Nilotinib zur Bestimmung der IC50-Werte wurden in Caco-2-Zellen reproduziert, um die beiden Zellmodelle zu vergleichen. Alle Verbindungen wurden entweder allein oder mit dem zugehörigen Inhibitor in HBSS-Transportpuffer, ergänzt mit 1 % HEPES (v/v) und 1 % DMSO (v/v), verdünnt. Vor der Inkubation wurden alle Lösungen auf 37 Grad vorgewärmt und der pH auf 7,4 eingestellt. Für die Krebsmedikamente Crizotinib und Nilotinib lagen die Konzentrationen aufgrund ihrer schlechten Löslichkeit und ihres zytotoxischen Potenzials im Bereich von 0,1 bis 25 µM. Für Ketoconazol und Warfarin lagen die Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 100 µM. Kurz gesagt, nach 14 Tagen Kultur wurden alle Arzneimittel, gelöst in HBSS mit 1 Prozent HEPES (v/v), für 10 min bei 37 Grad vorinkubiert. Dann wurden die Zellen mit 10 &mgr;M Apixaban oder Rivaroxaban für 60 Minuten bei 37 Grad inkubiert. Schließlich wurden die Zellen nach dreimaligem Waschen in kalter HBSS/HEPES-Lösung bei Raumtemperatur für 45 min in einer 0,2-prozentigen Lösung von Triton X-100 lysiert. Die Menge an intrazellulärem DOAC wurde dann durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) quantifiziert. Die Daten wurden als prozentuale Erhöhungen der DOAC-Akkumulation ausgedrückt, und die intrazelluläre DOAC-Akkumulation wurde willkürlich auf 100 Prozent in Kontrollzellen gesetzt. Die IC50-Werte für die Hemmung der P-gp-Aktivität, die den Werten der halbmaximalen wirksamen Konzentration (EC50) für eine zunehmende DOAK-Akkumulation entsprechen, wurden aus einer ungewichteten nichtlinearen Regressionsmodellierung der kleinsten Quadrate einer erhöhten Akkumulation mit der Funktion „nls()“ in R bestimmt Software, gemäß der folgenden Gleichung (Gl. 1):
Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-AnalyseDie Quantifizierung von Apixaban (m/z 460.19793) und Rivaroxaban (m/z 436.07285) wurde mit einem Ultimate U300{{18) durchgeführt }} Flüssigchromatographiesystem (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) gekoppelt mit einem Q-Exactive Plus Massenspektrometer (ThermoFisher, Bremen, Deutschland). LC-Trennungen wurden mit einer analytischen Hypersil Gold C18-Säule (3 µm, 50 × 2,1 mm) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) und einer Flussrate von 0,6 ml/min erreicht . Mobile Phase A war Wasser mit 0,1 Prozent Ameisensäure (FA) und mobile Phase B war Acetonitril mit 0,1 Prozent FA. Für Rivaroxaban war der Gradient: 0–0,3 min, 10 % B; 0,3–1 min, linear von 10 % bis 70 % B; 1–1,5 min, 70 Prozent B; 1,51 min, Rückkehr zu Ausgangsbedingungen bis 3 min. Für Apixaban war der Gradient: 0–0,3 min, 10 Prozent B; 0,3–0,7 min, linear von 10 bis 90 Prozent B; 0,7–1,5, 90 Prozent B; 1,51 min, Rückkehr zu Ausgangsbedingungen bis 3 min. Die Detektion wurde im Elektrospray-positiven Parallelreaktionsüberwachungsmodus (PRM) mit einer Auflösung von 35 000 (bei m/z 200) durchgeführt. Die internen Standards (ISs) waren [13C,2H7]-Apixaban (m/z 468,2452) für Apixaban und [13C6]-Rivaroxaban (m/z 442,09297) für Rivaroxaban. Für jedes Medikament und seinen jeweiligen IS wurden ein Zielion (zur Quantifizierung) und ein bestätigendes Ion überwacht. Für Rivaroxaban und seinen IS war das Zielion m/z 144,95125 und die Bestätigungsionen waren m/z 231,11280 bzw. m/z 237,13298. Für Apixaban und seinen IS war das Zielion m/z 199,08656 und die Bestätigungsionen waren m/z 282,12387 bzw. m/z 241,06062.
Ergebnisse
Rhodamin-123-Akkumulations-Screening-AssayDer Rhodamin-123-Akkumulations-Screening-Assay wurde in RPTEC/TERT1-Zellen mit 14 Arzneimitteln mit unterschiedlichen Inhibitionsprofilen durchgeführt (Abb. 1). Wie erwartet war die intrazelluläre Anreicherung von Rhodamin 123 in Gegenwart von Cyclosporin A, einem Breitband-Inhibitor, mit einer Steigerung der Anreicherung um 75 Prozent im Vergleich zu den Kontrollzellen mit am höchsten. Das Vorhandensein von Verapamil, einem spezifischen P-gp-Inhibitor, führte zu einer Zunahme der Akkumulation von Rhodamin 123 um 57 Prozent, was die Beteiligung von P-gp belegt. In gleicher Weise führte Ketoconazol, das als starker P-gp-Inhibitor beschrieben wird, im Vergleich zu Verapamil zu einer stärkeren Zunahme (66 Prozent) der intrazellulären Akkumulation von Rhodamin 123, was sein Hemmprofil bestätigt. Umgekehrt verursachte die Zugabe von Amiodaron, das als moderater P-gp-Hemmer charakterisiert wird, eine Zunahme der Akkumulation von 59 Prozent, was der von Verapamil verursachten ähnlich ist. Für die Antikrebsmittel Nilotinib, Axitinib, Crizotinib, Erlotinib und Idelalisib wurden unterschiedliche Hemmprofile beobachtet. Die Zugabe von Nilotinib verursachte einen starken Anstieg der Akkumulation von Rhodamin 123 (71 Prozent), was auf ein signifikantes inhibitorisches Potenzial hinweist, gefolgt von Axitinib, das eine Erhöhung der Retention von 57 Prozent verursachte. Auf der anderen Seite zeigten Crizotinib und Erlotinib ein mäßiges bis niedriges Hemmungspotenzial, mit einem Anstieg der Akkumulation von Rhodamin 123 um 23 Prozent bzw. 16 Prozent. Idelalisib hatte keinen Einfluss auf die Akkumulation von Rhodamin 123; Dasselbe galt für Warfarin, das war
als Nicht-Inhibitor gewählt. Unter den drei DOAKs verursachten Apixaban und Rivaroxaban leichte Erhöhungen der Retention von Rhodamin 123: 33 Prozent bzw. 12 Prozent. Interessanterweise verursachte Dabigatranetexilat, ein Prodrug von Dabigatran und ein bekanntes Substrat von P-gp, eine Erhöhung der Retention von Rhodamin 123 um etwa 50 Prozent, obwohl es nicht als potenzieller P-gp-Inhibitor beschrieben wird. Schließlich bewirkte die Zugabe von Simvastatin nur eine geringfügige Erhöhung der Akkumulation des fluoreszierenden Substrats (32 Prozent). Basierend auf diesem Screening wurden vier Medikamente ausgewählt, um ihre konzentrationsabhängigen Wirkungen auf die intrazelluläre Akkumulation von Apixaban und Rivaroxaban innerhalb des RPTEC/TERT1-Modells zu bewerten. Ketoconazol wurde als positive Kontrollbedingung für die P-gp-Hemmung ausgewählt, und Warfarin wurde als Nicht-Inhibitor von P-gp für die negative Kontrollbedingung ausgewählt. Nilotinib und Crizotinib wurden als starke bzw. moderate P-gp-Inhibitoren ausgewählt. Mit dem Referenzmodell Caco-2 wurden mehrere Bedingungen reproduziert. Die intrazelluläre Akkumulation von R123 in Zellen wurde nach Kombination (oder nicht) mit Apixaban und Rivaroxaban (10 µM), Nilotinib (10 µM) und mit Cyclosporin A (10 µM) und Verapamil (100 µM) für die Kontrollbedingungen für die Hemmung bestimmt (Abb. 2A). Wie erwartet verursachten Verapamil und Cyclosporin A eine hohe Erhöhung der R123-Retention von 297 Prozent bzw. 275 Prozent. Auf die gleiche Weise verursachte Nilotinib einen starken Anstieg der intrazellulären Akkumulation von R123 (229 Prozent), was sein inhibitorisches Potenzial bestätigt. Die Kombination von R123 mit DOACs führte im Vergleich zu den anderen Arzneimitteln zu einer geringfügigen Erhöhung der Akkumulation von R123 (40–44 Prozent). Darüber hinaus ist die intrazelluläre Akkumulation von Rhodamin 123 in Abwesenheit und Anwesenheit von Cyclosporin A inNieren-Primäre menschliche Zellen wurden in dieser Studie ebenfalls untersucht, um die Zuverlässigkeit der mit RPTEC/TERT1-Zellen erhaltenen Ergebnisse zu überprüfen (Abb. 2B). Diese Analysen zeigten, dass das Vorhandensein von Cyclosporin A die R123-Retention um 71 Prozent erhöhte. Dieser Wert lag nahe bei dem, der unter den gleichen Bedingungen mit RPTEC/TERT1-Zellen erhalten wurde (ein Anstieg von 75 Prozent mit Cyclosporin A). Daher war die P-Glycoprotein-Aktivität im RPTEC/TERT1-Modell und in primären menschlichen Zellen ähnlich.
DOACs Intrazellulärer Akkumulationsassay: Bestimmung des IC50- und I1/IC50-Verhältnisses Studien zur intrazellulären Akkumulation wurden durchgeführt, um den P-gp-vermittelten Transport von Apixaban und Rivaroxaban bei einer konstanten Konzentration von 10 µM in RPTEC/TERT1-Zellen in vitro und in Gegenwart steigender Konzentrationen von Nilotinib, Crizotinib und Ketoconazol zu beurteilen und Warfarin (Abb. 2, 3). Die Modellierung einer erhöhten Apixaban- und Rivaroxaban-Retention wurde bewertet, um IC50-Werte zu bestimmen. Die Kombination von DOAKs mit Nilotinib führte zu den niedrigsten IC50-Werten: 0,85 µM und 1,37 µM für Rivaroxaban bzw. Apixaban (Abb. 4, 5). Die Kombination mit Crizotinib ergab IC50-Werte von 10,1 µM für Rivaroxaban bzw. 12,2 µM für Apixaban. Überraschenderweise führte die Kombination von DOAKs mit Ketoconazol nicht zu den niedrigsten IC50-Werten (16,5 µM bzw. 16,9 µM für Rivaroxaban und Apixaban). Schließlich, wie erwartet, Kombination mit Warfarin, was war
als Nicht-Inhibitor gewählt, beeinflusste die intrazellulären Retentionen der zwei DOACs nicht. Die intrazelluläre Akkumulation sowohl von Apixaban als auch von Rivaroxaban in Caco-2-Zellen in Gegenwart steigender Konzentrationen von Nilotinib wurde daher zum Vergleich mit den Zellmodellen untersucht. Interessanterweise war, wie beim RPTEC/TERT1-Modell beobachtet, der IC50-Wert für Rivaroxaban (4,16 µM) niedriger als der für Apixaban (9,35 µM). Es ist auch interessant festzustellen, dass die in Caco-2-Zellen beobachteten IC50-Werte höher waren als die, die in RPTEC/TERT1-Zellen für denselben Inhibitor erhalten wurden. Die klinische Relevanz von DDIs kann anhand von In-vitro-Daten vorhergesagt werden. Gemäß den FDA-Richtlinien wurden die [I1]/IC50-Verhältnisse für jede Arzneimittelkombination berechnet. Dieses Verhältnis ermöglicht den Vergleich von In-vivo-Konzentrationen mit solchen, von denen bekannt ist, dass sie in vitro eine relevante Wirkung hervorrufen. Für Apixaban in RPTEC/TERT1-Zellen betrugen die Verhältnisse 3,1, 0,06 und 17,4 mit Nilotinib, Crizotinib bzw. Ketoconazol (Tabelle 1). In Caco-2-Zellen betrug das [I1]/IC50-Verhältnis für die Wechselwirkung zwischen Apixaban und Nilotinib 0,46 (Tabelle 1). Für Rivaroxaban waren die Verhältnisse etwas höher als die für Apixaban in RPTEC/TERT1-Zellen erhaltenen Verhältnisse: 5,1, 0,08 bzw. 17,7 für Nilotinib, Crizotinib und Ketoconazol (Tabelle 2). In gleicher Weise betrug das [I1]/IC50-Verhältnis, das für die Wechselwirkung zwischen Rivaroxaban und Nilotinib in Caco-2-Zellen beobachtet wurde, 1,03 und war damit höher als das für Apixaban erhaltene (Tabelle 2).
Diskussion
Zahlreiche Studien, die in den letzten Jahrzehnten durchgeführt wurden, haben über eine bemerkenswerte Rolle von P-gp in der Pharmakokinetik von Arzneimitteln berichtet [17–19]. Im Hinblick auf das zunehmende behördliche Interesse an P-gp-vermittelten Arzneimittelwechselwirkungen sind In-vitro-Assays zur Untersuchung des Hemmpotentials von Arzneimitteln ein wichtiger Aspekt der Arzneimittelentwicklung und der klinischen Praxis. Zu diesem Zweck wurden viele In-vitro-Assays durchgeführt, und die meisten damit verbundenen Daten zur vorhergesagten intestinalen Resorption wurden aus den Caco-2- und MDCK-MDR1-Zelllinien generiert [20–22]. Allerdings liegen nur wenige Daten zur aktiven tubulären Sekretion von Arzneimitteln vor, die ebenfalls eine Schlüsselrolle bei der Arzneimitteldisposition spielt und von der Anwesenheit von ABC-Transportern abhängt. Diese Beobachtung ist eindeutig mit dem Mangel an Charakterisierung verbundenNieren-Zelllinien zur Vorhersage von ArzneimittelnNieren-efux. Dieses Ziel erfordert eine in vitroNieren-Modell, das die physiologische Barriere genau nachahmt. Die humane Zelllinie RPTEC/TERT1, die mehrere ABC-Transporter (insbesondere P-gp) exprimiert, scheint eine gute Alternative zu sein, wie in einer früheren Studie gezeigt wurde [16]. In diesem Zusammenhang untersuchte die vorliegende Arbeit die Anwendung des RPTEC/TERT1-Modells zur Bewertung des P-gp-Inhibitorpotentials. Nach unserem besten Wissen ist diese Arbeit die erste, die Daten aus P-gp-Hemmungsstudien mit Menschen liefertNieren-Zellen.
In-vitro-Assays zur Bestimmung des P-gp-Inhibitionspotentials basieren üblicherweise auf der Verwendung eines spezifischen P-gp-Referenzsubstrats wie Digoxin oder Rhodamin 123 [23–25]. Aufgrund ihrer einfachen Handhabung sind Fluoreszenzsonden für Hochdurchsatz-Assays von Vorteil. Darüber hinaus wurde Rhodamin 123 in einer Vielzahl von Studien zum Nachweis der P-gp-Aktivität eingesetzt [26–28]. Auf diese Weise wurden in dieser Studie Assays zur Akkumulation von Rhodamin 123 in RPTEC/TERT1-Zellen durchgeführt, um die Hemmungsprofile von 14 Arzneimitteln zu identifizieren. Unter diesen Arzneimitteln wurden Cyclosporin A, Ketoconazol und Verapamil als starke P-gp-Inhibitoren ausgewählt. Diese Inhibitoren wurden ausführlich auf ihr signifikantes P-gp-Hemmpotential hin charakterisiert, das zur Modulation sowohl des Digoxin- als auch des Rhodamin-123-Transports führt [27, 29, 30]. Wie erwartet verursachten diese Medikamente die höchsten Rhodamin-123-Retentionen in RPTEC/TERT1-Zellen. Im Gegensatz dazu wurde bei Warfarin, das als Negativkontrolle verwendet wurde, keine Zunahme der Retention von R123 beobachtet, was die Zuverlässigkeit des RPTEC/TERT1-Modells bestätigt. Interessanterweise verursachten unter allen getesteten Medikamenten DOAKs – einschließlich Dabigatranetexilat, Apixaban und Rivaroxaban – deutliche Erhöhungen der Retention von R123, obwohl sie zuvor nicht als Inhibitoren, sondern nur als P-gp-Substrate charakterisiert wurden [31, 32]. Diese Beobachtung kann auf das Vorhandensein einer sogenannten "kompetitiven" Hemmung zurückzuführen sein, bei der die Arzneimittel mit den gleichen Bindungsstellen auf P-gp interagieren können. Die am besten charakterisierten Stellen für P-gp sind die H-Stelle (zur Bindung von Hoechst 33342) und die R-Stelle (zur Bindung von Rhodamin 123). Allerdings könnten mehrere andere unbekannte Wirkstoffbindungsstellen bei diesen Wechselwirkungen eine Rolle spielen, was die unterschiedlichen Wirkungen der DOACs auf die Akkumulation von R123 erklären könnte [33, 34]. Die für ein bestimmtes Medikament beobachtete P-gp-Hemmung hängt daher von dem in In-vitro-Studien verwendeten Substrat ab [28, 35]. Die Verwendung unterschiedlicher P-gp-Substrate, die mit unterschiedlichen Arzneimittelbindungsstellen interagieren, sollte daher in Betracht gezogen werden, um die mutmaßlichen P-gp-Hemmwirkungen von Arzneimitteln genau zu beschreiben. Es ist auch interessant festzustellen, dass mehrere Bedingungen aus dem Rhodamin-123-Screening auch in Caco-2-Zellen durchgeführt wurden, um die RPTEC/TERT1-Zellen mit einem Referenzmodell in Arzneimitteltransportstudien zu vergleichen. Wie erwartet verursachten Cyclosporin A, Verapamil und Nilotinib die höchsten Anstiege der Rhodaminretention. Die gleichen Hemmprofile wurden sowohl bei Caco-2- als auch bei RPTEC/TERT1-Zellen beobachtet. Die durch die Wechselwirkungen im Caco-2-Modell erzeugten Zunahmen der Rhodamin-123-Retention waren jedoch größer als die in RPTEC/TERT1-Zellen beobachteten, was auf einen möglichen Unterschied in der Expression von P-Glykoprotein zwischen den Modellen hindeutet. Daher in der Gegenwart Studie wurde eine zweite Methode verwendet, um die potenzielle Hemmung von P-gp durch Medikamente zu bewerten und zu bestätigen.
CISTANCHE WIRD DIE NIEREN-/RENALE DIALYSE VERBESSERN
Basierend auf dem Rhodamin-123-Akkumulationsassay wurden vier Wirkstoffe ausgewählt, um ihre konzentrationsabhängigen Wirkungen auf die intrazelluläre Akkumulation von Apixaban und Rivaroxaban zu bestimmen. Es wurde gezeigt, dass P-gp eine Hauptrolle im Efux von Apixaban und Rivaroxaban spielt [32, 36]. Daher wurden die IC50-Werte von Nilotinib, Crizotinib und Ketoconazol bewertet, wobei DOAKs als „Opfer“-Medikamente ausgewählt wurden. Nach unserem besten Wissen ist diese Studie die erste, die intrazelluläre Akkumulationsstudien mit DOAKs beim Menschen durchführtNieren-Zellen. Die für Nilotinib und Crizotinib erhaltenen IC50-Werte stimmten mit ihren Hemmprofilen überein, die aus dem Rhodamin-123-Akkumulationstest erhalten wurden. Nilotinib, das eine starke Erhöhung der Retention von R123 verursachte, wies den niedrigsten IC50-Wert für die beiden DOAKs auf, was sein hohes Hemmpotential bestätigt. Dieses Ergebnis steht auch im Einklang mit einer früheren Studie, die eine konzentrationsabhängige Zunahme der intrazellulären Akkumulation von [³H]-Paclitaxel in MDR1--transfizierten Zellen zeigte, was darauf hindeutet, dass es ein Inhibitorprofil hat [37]. Für Crizotinib zeigte der R123-Assay ein moderates Hemmungspotenzial mit einer geringeren Zunahme der R123-Retention als bei Nilotinib. Diese Beobachtung wird durch eine frühere Studie gestützt, in der Crizotinib die intrazelluläre Akkumulation von R123 und Doxorubicin in MDR1--transfizierten Zellen erhöhte [38]. Dieses Ergebnis steht auch im Einklang mit den mit DOAKs ermittelten IC50-Werten, die über den entsprechenden Werten von Nilotinib lagen und dessen moderates Hemmprofil bestätigen. Es ist jedoch interessant festzustellen, dass eine Konzentration von 10 µM von entweder Nilotinib oder Crizotinib nicht die gleiche Zunahme der Retention von Rhodamin 123 und DOACs verursachte. Beim Rhodamin-Screening erhöhte Nilotinib die Retention des Substrats um etwa 71 Prozent, während es bei DOAKs etwa 40 Prozent waren. Im Gegensatz dazu verursachte Crizotinib bei gleicher Konzentration eine geringe Erhöhung der Retention von Rhodamin (23 Prozent), aber eine stärkere Erhöhung der Retention von DOACs (etwa 50 Prozent). Wie zuvor diskutiert, könnte diese Beobachtung durch Unterschiede in den Bindungsstellen auf P-gp erklärt werden. Es ist bekannt, dass viele Arzneimittel eher mit der H-Bindungsstelle als mit der R-Bindungsstelle (an der Rhodamin 123 bindet) interagieren und mit dieser konkurrieren und umgekehrt [39]. Interessanterweise verursachte Ketoconazol, das als starker P-gp-Hemmer bekannt ist, einen etwas geringeren Anstieg der Retention von Rhodamin 123 als Nilotinib (66 Prozent gegenüber 71 Prozent). Dennoch wurde ein ähnlicher Wert bei Caco-2-Zellen beobachtet, wo die Anwesenheit von Ketoconazol eine um 60 Prozent erhöhte Akkumulation von R123 bewirkte [40]. Auch die intrazelluläre Akkumulation von DOAKs zur Bestimmung der IC50-Werte zeigte im Vergleich zu Nilotinib und Crizotinib höhere Werte. Interessanterweise lagen die meisten IC50-Werte, die in den LLC-PK1- oder Caco-2-Modellen unter Verwendung von Digoxin als P-gp-Substrat gefunden wurden, zwischen 3 und 4 µM für Ketoconazol [41, 42]. Diese Werte unterscheiden sich deutlich von denen, die in der vorliegenden Studie gefunden wurden (16,5 µM bzw. 16,9 µM mit Apixaban bzw. Rivaroxaban). Diese Beobachtung bestätigt, dass die Wahl des Substrats und des verwendeten Modells entscheidende Einflüsse bei der Bestimmung des P-gp-Inhibitorpotentials sind. Darüber hinaus berichtete eine kürzlich durchgeführte Studie, dass die Expressionsniveaus von ABC-Transportern in In-vitro-Zellmodellen einen Einfluss auf Arzneimitteltransportassays und daher auf die Bewertung von DDIs in Bezug auf P-gp haben [43]. Tatsächlich zeigte die Bestimmung der IC50-Werte für Verapamil unter Verwendung von Rivaroxaban als P-gp-Substrat eine Heterogenität zwischen den MDCKMDR1- und Caco-2-Zellmodellen mit IC50-Werten von 6,94 µM bzw. 21,2 µM [43]. Darüber hinaus wurde in dieser Studie auch die konzentrationsabhängige Wirkung von Nilotinib auf die intrazelluläre Akkumulation von Apixaban und Rivaroxaban in Caco-2-Zellen untersucht. Interessanterweise waren die IC50-Werte für Nilotinib in Caco-2-Zellen signifikant höher als in RPTEC/TERT1-Zellen. Diese Beobachtung kann durch den Unterschied in der P-gp-Expression zwischen diesen Modellen erklärt werden. Außerdem ist bekannt, dass die P-gp-Verteilung vom betrachteten Gewebe abhängt. Fallonet al. zeigten, dass der P-gp-Spiegel in höher warNiereals im Lebergewebe des Menschen [45]. Andererseits scheint das Expressionsniveau von P-gp im Darm höher zu sein als inNiereGewebe [46]. Die Verwendung von menschlichen Zellen wie dem RPTEC/TERT1-Modell, die Transporter nicht überexprimieren, könnte daher zusätzliche Daten liefern. Diese Daten könnten in der physiologisch basierten pharmakokinetischen Modellierung (PBPK) verwendet und imputiert werden, indem mehrere Parameter integriert werden, wie z. B. die Menge an P-gp in einem Gewebe- oder In-vitro-Modell oder IC50-Werte.
Obwohl die für Ketoconazol im RPTEC/TERT1-Modell gefundenen IC50-Werte höher waren als die in der Literatur beobachteten, zeigte sich das [I1]/IC50-Verhältnis – validiert als Prädiktor für potenziell klinisch relevante DDIs für oral verabreichte Arzneimittel hohe Werte, die über dem von der FDA definierten Schwellenwert von 0,1 lagen. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit einer klinischen Studie, die einen zweifachen Anstieg der Apixaban-Exposition bei gleichzeitiger Verabreichung von Ketoconazol zeigte [44]. Zusammengenommen zeigen alle diese Ergebnisse, dass das RPTEC/TERT1-Modell ein vielversprechendes Instrument zur Bewertung des P-gp-Inhibitorpotentials ist.
CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENSCHMERZEN VERBESSERN
Fazit
Unsere Studie hat gezeigt, dass die Anwendung des RPTEC/TERT1-Modells für die Bewertung der P-gp-Hemmungspotenziale verschiedener Wirkstoffklassen geeignet ist. Rhodamin-123-Akkumulationsassays ermöglichten die Durchführung eines anfänglichen Drogenscreenings. Jedoch müssen die P-gp-Inhibitorpotentiale von Arzneimitteln, die nicht mit der R-Stelle von P-gp interagieren, ebenfalls unter Verwendung zusätzlicher Substrate untersucht werden, um die Vorhersagen zu bestätigen. Die aus der intrazellulären Akkumulation von Apixaban und Rivaroxaban bestimmten IC50-Werte stimmen mit den mit Rhodamin 123 beobachteten Hemmprofilen überein. Darüber hinaus bestätigte die Verwendung von Ketoconazol und Warfarin als starker Inhibitor bzw. Nicht-Inhibitor von P-gp dies Zuverlässigkeit des RPTEC/TER1-Modells, wenn es verwendet wird, um In-vitro-Daten über das inhibitorische Potenzial von Arzneimitteln gegenüber P-gp zu erhalten. Schließlich unterstrich ein Vergleich der mit dem RPTEC/TERT1-Modell erhaltenen Ergebnisse mit denen, die mit Caco-2-Zellen erhalten wurden, die Bedeutung der Durchführung von In-vitro-Studien in verschiedenen Zellmodellen, um das Hemmprofil für ein bestimmtes Medikament zu bestätigen.