In-vitro-Infektion von Madin-Darby-Bovine-Nierenzellen (MDBK) mit Sporozoiten von Eimeria Acervulina: Quantitative Analyse der zellulären Invasion und Replikation von Parasiten unter Verwendung von Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Mar 17, 2022
Abstrakt
Geflügelkokzidiose verursacht erhebliche wirtschaftliche Verluste in der Viehwirtschaft. Eimeria-Parasiten sind für diese Krankheit verantwortlich. Weltweit gehören E. acervulina und E. tenella zu den häufigsten Eimeria spp. Broiler infizieren. E. tenella wird häufig als Infektionsmodell für In-vivo- und In-vitro-Studien verwendet. Andererseits wurde E. acervulina kaum unter In-vitro-Bedingungen untersucht. Ein gut etabliertes und weit verbreitetes In-vitro-Modell für E. tenella-Infektionen ist das Madin-Darby-RindNiereZelllinie (MDBK); jedoch ist wenig über die Eignung von MDBK-Zellen als Wirtszellen für E. acervulina bekannt. Wir infizierten MDBK-Monolayer mit zwei verschiedenen Dosen, 5 × 10 4 und 2 × 10 5 , von E. acervulina-Sporozoiten und werteten Kulturen 24 und 96 Stunden nach der Infektion (hpi) aus. Zum Vergleich führten wir einen identischen Infektionsassay mit E. tenella-Sporozoiten durch. Um die Reproduktion des Parasiten zu beurteilen, wurde die Anzahl der DNA-Kopien des SCAR-Markers von E. acervulina und des ITS-1-Gens von E. tenella mittels quantitativer Echtzeit-PCR quantifiziert. Wir fanden heraus, dass die Kopienzahl von E. acervulina bei 24 hpi im Vergleich zu E. tenella (S<0.05). after="" 96="" hpi,="" e.="" acervulina="" gene="" copies="" were="" considerably="" reduced="" while="" e.="" tenella="" continued="" to="" multiply=""><0.05). our="" results="" show="" that="" mdbk="" monolayers="" could="" be="" used="" for="" in vitro="" research="" aimed="" to="" study="" e.="" acervulina="" sporozoite="" cell="" invasion.="" nevertheless,="" modifications="" of="" in vitro="" cultivation="" appear="" necessary="" to="" allow="" qualitative="" and="" quantitative="" studies="" over="" longer="" periods="" of="" parasite="">
Schlüsselwörter:Kokzidiose; Eimeria acervulina; Eimeria tenella; Geflügel; MDBK-Zellen; Niere
CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENERKRANKUNGEN VERBESSERN
Einführung
Kokzidiose ist eine wirtschaftlich bedeutende Krankheit in der Geflügelindustrie (Blake et al. 2020). Die Krankheit wird durch apikomplexe Parasiten der Gattung Eimeria verursacht. Die Infektion erfolgt durch orale Aufnahme von sporulierten Oozysten. Einmal im Wirt setzen die Oozysten Sporozoiten frei, die in die Darmepithelzellen eindringen. Innerhalb der Wirtszellen durchlaufen Sporozoiten asexuelle und sexuelle Vermehrungszyklen. Dabei werden Oozysten produziert und anschließend mit dem Kot ausgeschieden. Infizierte Tiere können Gewichtsverlust, Durchfall und geringe Eiproduktion aufweisen, und die Krankheit kann in einigen Fällen tödlich sein (López-Osorio et al. 2020). Sieben Arten von Eimeria (E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox und E. tenella) sind weltweit für Vogelkokzidiose verantwortlich. Morphologie, Pathologie und Schwere der Erkrankung der Oozysten sind häufige Unterscheidungsfaktoren zwischen diesen Arten. Von allen sieben Eimeria sind E. acervulina, E. tenella und E. maxima in Masthähnchenbetrieben am weitesten verbreitet (Jordan et al. 2018; Moraes et al. 2015; Györke et al. 2013). Von diesen 3 Arten gilt E. tenella als hochgradig pathogen, während E. acervulina und E. maxima eine mäßige Pathogenität aufweisen (López-Osorio et al. 2020). Trotz Schwankungen in der Pathogenität sind mäßig pathogene Eimeria spp. B. E. acervulina, könnten die Schwere der Erkrankung während einer Koinfektion verstärken (Hiob et al. 2017). Tiermodelle sind ein wertvolles Element in der Infektionsforschung. In-vitro-Studien von Kokzidienparasiten können jedoch zum grundlegenden Verständnis der Krankheit auf zellulärer Ebene beitragen (Marugán-Hernández et al. 2020, Bussite et al. 2018, Thabet et al. 2017). Darüber hinaus können sie ein nützliches Werkzeug sein, das Basisdaten für zukünftige Therapien liefert (Thabet et al. 2017; Khalafalla et al. 2011). Aufgrund seiner Fähigkeit, in Nicht-Vogel-Zelllinien zu wachsen (Marugán-Hernández et al. 2020; Thabet et al. 2017), wurde E. tenella häufig als Modellorganismus in der In-vitro-Forschung verwendet (Marugán-Hernández et al. 2020 ; Thabet et al. 2019, 2017; Khalafalla et al. 2011) und es wurden beträchtliche Anstrengungen auf die In-vitro- und In-vivo-Forschung zu E. tenella gerichtet, einschließlich der Verwendung molekularer Ansätze wie der quantitativen Echtzeit-PCR (RT-qPCR) (Marugán-Hernández et al. 2020; Thabet et al. 2019, 2017; Hiob et al. 2017; Raj et al. 2013). Für andere Eimeria-Arten, einschließlich E. acervulina, wurden weniger Anstrengungen gemeldet (Naciri-Bontemps 1976; Itagaki et al. 1974; Strout et al. 1965; Hiob et al. 2017). Das Ziel dieser Studie war es, die In-vitro-Invasion und -Replikation von E. acervulina-Sporozoiten in MDBK-Zell-Monolayern mittels quantitativer Echtzeit-PCR zu bewerten.
CISTANCHE WIRD DIE NIEREN-/RENALE DIALYSE VERBESSERN
Materialen und Methoden
Passage von Oozysten von E. acervulina und E. tenella Oozystenvon E. acervulina und E. tenella wurden nach einer modifizierten Methode von Eckert et al. in gesunden 11- Tage alten Küken getrennt passagiert. (1995). Sporulierte Oozysten wurden gesammelt und bis zur weiteren Verwendung in 4-prozentiger Kaliumdichromatlösung bei 4 Grad gelagert.Reinigung und Exzystation von OozystenOozysten beider Eimeria-Spezies wurden aus der 4-prozentigen Kaliumdichromatlösung gereinigt. Danach wurden Sporozoiten angeregt und gemäß dem von Rentería-Solís et al. beschriebenen modifizierten Verfahren gereinigt. (2020).ZellkulturMadin-Darby-RindNiere(MDBK) Monolayer (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) wurden als Infektionsmodell verwendet. MDBK-Zellen wurden (2 × 10 5 Zellen/Vertiefung) in Platten mit 24- Vertiefungen mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 IE Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, und ausgesät 2,5 ug/ml Amphotericin und bei 37 Grad in einer Atmosphäre von 5 Prozent CO2 in Luft inkubiert, bis sie 80 Prozent Konfluenz erreichten.Infektion von MDBK-Zellen mit Eimeria-SporozoitenKonfluente MDBK-Monoschichten wurden mit E. acervulina-Sporozoiten inokuliert. Vorläufige Studien wurden durchgeführt, um eine Infektionsdosis basierend auf verschiedenen Infektionsmultiplizitätsraten (MOI) auszuwählen (Parasit:Zelle): {{0}}.25, 0.5, 1.{ {9}}, 1.5 und 5.0 (Taha et al. unveröffentlichte Daten). Für die Infektion wurden zwei getrennte Dosen ausgewählt: 5 × 104 (MOI: 0,25) oder 2 × 105 Sporozoiten/Vertiefung (MOI: 0,5). Der Infektion ausgesetzte Kulturen wurden dann bei 41 Grad in einem DMEM-Medium mit 2 Prozent FBS, 100 IE Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und 2,5 ug/ml Amphotericin inkubiert. Es wurden zwei unterschiedliche Inkubationszeiten implementiert: 24 h nach Infektion (hpi) und 96 hpi. Ein identischer Satz von Infektionsdosen und Inkubationszeiten wurde für E. tenella-Sporozoiten durchgeführt. Alle Experimente umfassten eine Negativkontrolle, die aus nicht infizierten MDBK-Monoschichten (NC-nicht infizierte Zellen) bestand. Alle Assays wurden dreifach durchgeführt. Nach 24 hpi wurden die Zellen dreimal mit sterilem PBS (pH 7,2) gewaschen und der 96 hpi-Gruppe wurde ein neues Medium hinzugefügt, während die 24 hpi-Kulturen beendet wurden. Monoschichten wurden am Ende jeder Inkubationsperiode (24 hpi bzw. 96 hpi) trypsinisiert.
DNA-Extraktion und quantitative Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit (RT-qPCR)DNA wurde aus den trypsinisierten Zellen unter Verwendung des DNeasy Blood & Tissue-Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. RT-qPCR wurde durchgeführt, um Kopien des E. acervulina-Sequenz-charakterisierten amplifizierten Region (SCAR)-Markers Ac-R01-1731 und für E. tenella internal transcribed spacer 1 of ribosomal DNA (ITS-1)-Gen als zu quantifizieren ein Korrelat der Parasitenreplikation. RT-qPCR-Assays wurden gemäß den von Blake et al. (2008) und Kawahara et al. (2008) mit einigen Modifikationen. Kurz gesagt, eine Reaktion mit einem Volumen von 20 &mgr;l enthielt 10 &mgr;l SYBR Green ® -Mastermix (Thermo Scientific, Dreieich, Deutschland), 500 nM Forward- und Reverse-Primer (Tabelle 1), 2 &mgr;l DNA-Matrize und 7 &mgr;l nukleasefreies Wasser. Jedem Assay wurde eine aus Nuklease-freiem Wasser bestehende Non-Template-Kontrolle (NTC) zugesetzt. RT-qPCR-Reaktionen wurden dreifach amplifiziert und auf einem Bio-Rad CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Feldkirchen, Deutschland) durchgeführt. Die RT-qPCR-Bedingungen waren 95 Grad für 5 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen von 95 Grad für 30 Sekunden. Das Glühen wurde bei 59,8 Grad und 58 Grad für 20 Sekunden für E. acervulina bzw. E. tenella durchgeführt, gefolgt von einem Verlängerungszyklus von 20 Sekunden bei 72 Grad. Ein Schmelzkurvenprogramm wurde mit einem Temperaturbereich von 60 bis 95 Grad angewendet, um eine Dissoziationskurve zu erzeugen. Schließlich wurden E. acervulina- und E. tenella-Standardkurven durch eine serielle Verdünnung von genomischer DNA bzw. eine serielle Verdünnung von klonierten ITS-1-Genfragmenten (nach Thabet et al. 2015) erstellt.
statistische Analyse
D'Agostino-Pearson and Shapiro–Wilk normality tests were used to determine the normal distribution of data. A two-way ANOVA test was used for comparison of reproduction considering time points, infection doses, and Eimeria species. Differences were considered statistically significant when p>0.05. Alle statistischen Analysen wurden in der Software GraphPad Prism 9 (San Diego, CA, USA) durchgeführt.
Resultate und Diskussion
Genkopien des SCAR-Markers von E. acervulina und des ITS-1-Gens von E. tenella wurden in jeder Reaktion erfolgreich amplifiziert und durch RT-qPCR nachgewiesen. Nach einer Inkubationszeit von 24 hpi war die Zahl der nachgewiesenen Kopien nach Applikation einer Dosis von 5× 104 Sporozoiten signifikant höher (p=0.0002) für E. acervulina (1,88× 105±5,56× 104 ) als für E. tenella (3,60 × 104 ± 5,37 × 103) (Abb. 1). In ähnlicher Weise wurde eine signifikant höhere (p=0.0002) Anzahl von Kopien für E. acervulina (4,82 × 105 ± 8,50 × 10 4 ) als für E. tenella (1,27 × 105 ± 9,32 × 10 3 ) 24 hpi danach erhalten Applikation von 2×105 Sporozoiten (Abb. 1). Im Gegensatz dazu war 96 hpi nach der Infektion mit 5 × 104 Sporozoiten die Anzahl der Kopien in den mit E. acervulina infizierten Kulturen signifikant (p=0.0044) niedriger (6,96 × 103 ± 3,87 × 103) im Vergleich zu E. acervulina Tenella (1,24 x 105 ± 1,01 x 105). Ebenso führte die höhere Dosis von 2 × 105 Sporozoiten, die mit Monolayern für den längeren Zeitraum von 96 hpi inkubiert wurden, zu signifikant (p=0.0044) geringeren Mengen an E. acervulina-Kopien (3,35 × 104 ± 1,53 × 104 ) in Vergleich mit E. tenella (4,98 × 105 ± 1,28 × 105 ) (Abb. 1).
Wir haben die Fähigkeit von E. acervulina getestet, in MDBK-Monoschichten einzudringen und sich anschließend über 24 und 96 hpi zu vermehren. Frühere Versuche zur Bewertung der E. acervulina-Kultur wurden mit unterschiedlichen Ergebnissen durchgeführt. Stroutet al. (1965) infizierten verschiedene primäre (Hühnerembryos).Niereund Fibroblasten) und permanente Zelllinien (Maus-Fibroblasten, HeLa-Zellen). Stroutet al. (1965) berichteten über eine erkennbare Zellinfektion bei 24 hpi in allen Zelllinien. Interessanterweise beobachteten sie in keinem der getesteten Zellmodelle (Strout et al. 1965) parasitäres Wachstum über Zeiträume von mehr als 24 hpi, was mit unseren Beobachtungen einer abnehmenden Anzahl von Genen übereinstimmt
Kopien 96 hpi. Naciri-Bontemps (1976) berichtete über das Wachstum von E. acervulina bei HühnernNiereZellen bis 93 hpi und beobachtete Oozystenbildung nach Inokulation von Merozoiten. Nach unserem besten Wissen wurden diese Ergebnisse jedoch nicht durch spätere Veröffentlichungen bestätigt. Es wurde nur ein Artikel über mit E. acervulina-Sporozoiten infizierte MDBK-Monolayer veröffentlicht (Talebi 2001). Kurz gesagt setzte der Autor MDBK-Zellen, die zuvor mit hyperimmunen Hühner- oder Kaninchen-Antiseren behandelt worden waren, E. acervulina-Sporozoiten für 24 hpi aus. Kulturen wurden gefärbt und intrazelluläre Sporozoiten wurden mikroskopisch gezählt. Leider zeigt die Studie nur Prozentsätze der Parasitenhemmung durch Antiserum (Talebi 2001), sodass Rückschlüsse auf die Wirksamkeit der Infektion in diesem Modell nicht ohne Weiteres gezogen werden können. Unseres Wissens wurden keine weiteren Versuche zur Verwendung von MDBK-Zellen als Infektionsmodelle für E. acervulina gemeldet. Entsprechend den Erkenntnissen von Strout et al. (1965) beobachteten wir eine Spitzenreproduktion der Parasiten bei 24 hpi und später eine deutliche Abnahme, die durch niedrige Kopienzahlen bei 96 hpi dargestellt wurde. Stroutet al. (1965) und Naciri-Bontemps (1976) berichteten qualitative Daten, die nur aus mikroskopischer Analyse stammten. RT-qPCR ist jedoch ein genaueres und empfindlicheres Mittel zur Beurteilung der Parasitenreproduktion. Tatsächlich wird RT-qPCR heutzutage häufig zur quantitativen Bewertung verwendet und hat sich erfolgreich etabliert, um die Reproduktion von Kokzidien zu beurteilen (z . 2018, Hiob et al. 2017, Thabet et al. 2017, Raj et al. 2013, Khalafalla et al. 2011)
Die Elektronenmikroskopie könnte jedoch wertvolle Daten für die Analyse der intrazellulären Entwicklung von E. acervulina in MDBK-Zellen liefern. Daher sollten weitere In-vitro-Untersuchungen von E. acervulina in Erwägung gezogen werden. Theoretisch wären Vogelzelllinien als In-vitro-Infektionsmodell für Hühner-Eimeria vorzuziehen, da sie aus dem natürlichen Wirt stammen und einen repräsentativeren Einblick in die Wechselwirkungen zwischen Parasit und Wirt ermöglichen könnten als von Säugetieren stammende Zellkulturen. Die meisten für die Geflügelkokzidiose-Forschung geeigneten Hühnerzellkulturen sind jedoch Primärlinien (Bussiere et al. 2018, Strout et al. 1965; Naciri-Bontemps 1976). Primäre Zellen haben mehrere Einschränkungen im Vergleich zu permanenten Kulturen. Einer ist der allgemeine Bedarf an frischem tierischem Gewebe, um Laborexperimente zu starten, was mit einem Kontaminationsrisiko verbunden sein kann (Verma et al. 2020). Außerdem müssen zur Gewinnung von Primärzellen Tiere geopfert werden, was ethischen Erwägungen widerspricht. Schließlich kann die Standardisierung primärer Zelllinien mit Schwierigkeiten verbunden sein.
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Daher ist die Verwendung von immortalisierten Zelllinien allgemeine Praxis in den meisten Forschungsgruppen, die an der In-vitro-Kultur von Vogelkokzidien arbeiten. Im Allgemeinen werden von Säugetieren stammende Dauerkulturen gewählt, da sie leicht aus kommerziellen Quellen erhältlich sind und Werkzeuge wie Antikörper, Marker, veröffentlichte Protokolle, genomische Sequenzen usw. etabliert sind, während dies bei weniger häufig verwendeten Hühnerzelllinien nicht immer der Fall ist . MDBK-Zellen sind eine vom Rind stammende permanente Linie, die als In-vitro-Modell für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet wird. MDBK-Zellen sind für In-vitro-Studien an E. tenella gut etabliert (Marugán-Hernández et al. 2020, Rentería-Solís et al. 2020, Thabet et al. 2019, Bussiere et al. 2018, Thabet et al. 2017, Khalafalla et Al. 2011). Marugán-Hernández et al. (2020) führten beispielsweise eine umfassende Beschreibung der intrazellulären Entwicklung von E. tenella in MDBK-Zellen durch. In dieser Studie verfolgten die Autoren mittels RT-qPCR und Reverse-Transkriptase-Echtzeit-PCR die Zellteilung und die Stadienentwicklung von transgenen Stämmen von E. tenella.
Unser Ziel war es, die Vermehrung von E. acervulina in MDBK-Zellen durch PCR-Technologie zu quantifizieren. Nach unserem derzeitigen Kenntnisstand wurden solche Daten zuvor noch nicht veröffentlicht. Die morphologische Analyse wurde in unserem Experiment nicht berücksichtigt. Es wurde jedoch wiederholt (Marugán-Hernández et al. 2020, Thabet et al. 2017 und Raj et al. 2013) gezeigt, dass die Zunahme der Genkopienzahlen tatsächlich mit der Vermehrung während der Merogonie zusammenhängt. Eine Entwicklung über diese Phase der ungeschlechtlichen Vermehrung hinaus ist unter den in unserem Versuch gegebenen Bedingungen eher unwahrscheinlich. Wir fanden heraus, dass Sporozoiten von E. acervulina im Vergleich zu E. tenella in die Zelle eindringen und sich während der ersten 24 hpi mit einer höheren Rate vermehren. Allerdings sinkt die Zahl der Genkopien erheblich um 96 hpi, was eine Dynamik der Parasitenvermehrung für E. acervulina zeigt, die sich deutlich von derjenigen von E. tenella unterscheidet. Daher erscheint es wahrscheinlich, dass sich die verschiedenen Eimeria-Spezies in vitro unterschiedlich verhalten und dass allgemeine Schlussfolgerungen, die von E. tenella als dem einzigen etablierten Modellorganismus erhalten wurden, mit Vorsicht gezogen werden sollten. Das Hinzufügen weiterer Zeitpunkte könnte hilfreich sein, um die Dynamik der In-vitro-Vermehrung detaillierter zu bewerten. Zusätzliche Techniken können angewendet werden, um aufzuklären, was während dieser Zeit passiert und ob sich aus diesen Ergebnissen praktische Anwendungen für zukünftige Therapien ableiten lassen.
Nichtsdestotrotz haben wir in dieser Zelllinie einen Erfolg bei der Parasiteninvasion gezeigt. Daher könnten MDBK-Zellen weiter als Infektionsmodelle für die Invasion von E. acervulina-Sporozoitenzellen verwendet werden. Außerdem wird die Verwendung von RT-qPCR und anderen sensitiven Tools empfohlen. Noch wichtiger ist, dass diese Zelllinie auch eine E. tenella-Infektion unterstützt. Dies könnte in Vergleichsstudien zwischen beiden Eimeria-Arten umgesetzt werden. Weitere detaillierte quantitative und qualitative Analysen sollten durchgeführt werden, um die Eignung der MDBK-Kultur als In-vitro-Matrix für E. acervulina und Entwicklungsstadien anderer Hühner-Eimeria-Spezies zu beurteilen. Hilfe; wir danken auch M. Fritsche, B. Schneidewind und R. Schumacher (Institut für Parasitologie, Universität Leipzig) für ihre hervorragende Unterstützung als Tierpfleger. Vielen Dank auch an R. Zhang (College of Animal and Veterinary Sciences, Southwest Minzu University) für ihre wertvolle Hilfe bei der Laborarbeit. Die Autoren danken auch R. Schmäschke (Institut für Parasitologie, Universität Leipzig) für seine wertvolle Arbeit bei der Erstellung von Tiergenehmigungen.
