Entzündungserkennende, Katalase imitierende Nanozyme lindern akute Nierenverletzungen durch Umkehrung des lokalen oxidativen Stresses Ⅳ
Jun 19, 2024
Abschluss
Bio-Kräuter gegen Nierenerkrankungen
Materialen und Methoden
Materialien
Synthese und Charakterisierung von dMn3O4-Nanopartikeln
Die Synthese von TK-Linker, TK-Linker-konjugiertem Polyethylenglykol (PEG-TK) und (PEG)-Stearin (C18)-Konjugat (PTC) wurde gemäß unserer vorherigen Veröffentlichung durchgeführt [15]. Als Kontrolle haben wir auch ROS-unempfindliches Polymer (PC) hergestellt, indem wir Stearinsäure an PEG-AM konjugiert haben. Kurz gesagt wurden 200 mg m-PEG-Amin mit 160 mg Stearinsäure mit 160 µl TEA, 480 mg EDC und 290 mg NHS in 20 ml DMF bei 37 Grad über Nacht unter Rühren und N2-Spülung umgesetzt. Die Probe wurde dann durch Dialyse (MWCO=12–14 KDa) gegen DW für einen Tag gereinigt, gefolgt von Gefriertrocknung. Die chemischen Strukturen des synthetisierten PTC und PC wurden mittels Protonenkernresonanzspektroskopie (1 H-NMR) (400 Hz, Bruker: Billerica, MA, USA) in Chloroform (CHCl3) bestätigt. ROS-empfindliche PTC- und ROS-unempfindliche PC-Leermicellen wurden durch Selbstorganisation von PTC und PC unter Ultraschallbehandlung und Dialyse hergestellt.
Vorbereitung und Charakterisierung des ROS-empfindlichen Enzyms (PTC-M)
PTC-M wurde durch die Dialysemethode hergestellt. Kurz gesagt, 2 mg dMn3O4 und 10 mg PTC wurden in 1 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Die Mischung wurde dann unter Sondenbeschallung (30 % Amplitude, 5 s EIN/AUS, 5 min) tropfenweise zu 20 ml DW gegeben. Die Lösung wurde dann einen Tag lang gegen DW dialysiert (MWCO=12–14 KDa) und anschließend gefriergetrocknet. In ähnlicher Weise wurden auch dMn3O4 NP-beladene ROS-unempfindliche Nanomizellen (PC-M) als Kontrollgruppe hergestellt. Die hydrodynamischen Durchmesser und das Zetapotential der vorbereiteten leeren Nanomicellen (PTC und PC) und dMn3O4 NP-beladenen Nanomicellen (PTC-M und PC-M) wurden durch dynamische Lichtstreuung (Zetasizer Nano Z Instrument, Malvern, UK) bewertet. Die Morphologie des vorbereiteten PTC und PTC-M wurde mittels FE-TEM visualisiert. Die ROS-empfindliche Destabilisierung durch den Abbau des TK-Linkers von PTC-M wurde durch DLS- und FE-TEM-Analyse nach Behandlung der Proben mit 1 mM H2O2 beobachtet. Der Beladungsgehalt von dMn3O4 im endgültigen PTC-M wurde mit einem thermogravimetrischen Analysegerät (TGA N-1000, Scinco, Seoul, Korea) und einer ICP-MS-Analyse (820 ICPMS Varian Bruker, Billerica, MA, USA) analysiert .
Die H2O2-Zersetzung zu Wasser und Sauerstoff wurde auch mit Ru(DDP) als Sonde für die Sauerstofferzeugung bestätigt. Kurz gesagt, wurde den Proben 1 mM H2O2 zugesetzt und anschließend folgtedurch Zugabe von 1 µM Ru(dDDP(DMF). Die Probenwurden gründlich gemischt und die Fluoreszenzintensität bestimmtbei Anregung 440 nm und Emission 530 – 730 nm betrugaufgezeichnet. Später wurde auch die Sauerstoffproduktion bestätigtdurch Bestimmung der gelösten Sauerstoffkonzentration mitein Sensor für gelösten Sauerstoff (RDO Optical Dissolved Sen(sor, Thermo Scientific).
Zellkultur und Reagenzien
Die In-vitro-Studien wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [37]. Kurz gesagt, für die i-vitro-Studien wurden humane proximale tubuläre Epithelzellen der Niere (HK-2-Zellen, American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) verwendet. HK-2-Zellen wurden alle 3–4 Tage in 100--mm-Schalen kultiviert und passagiert, die eine Kombination aus Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) und Hams F-12-Medium (Welgene, Daegu, Korea) enthielten. ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS; Welgene), 100 U/ml Penicillinund 100 mg/ml Streptomycin (Sigma-Aldrich). TeHK-2-Zellen wurden dann in einer feuchten Atmosphäre inkubiertAtmosphäre von 5 % CO2und 95 % Luft bei 37 Grad für 24 Stunden und subbis zu einer Konfluenz von 70 – 80 % kultiviert. Die HK-2-Zellen warenplattiert auf 60-mm-Schalen in einem Medium mit 10 %FBS und 24 Stunden inkubiert. Die Zellen waren dann angewachsen
Lebensfähigkeit der Zellen
Zellaufnahme
Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrieanalyse wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (38). Ein Annexin-V-FLUOS-Färbekit (SigmaAldrich) wurde verwendet, um den Grad der Annexin-V-Bindung gemäß den Anweisungen des Herstellers zu messen. Kurz gesagt, nach 24-stündiger Behandlung mit 0 oder 1 mM H2O2 mit oder ohne 2 μg PTC-M-Vorbehandlung wurden HK-2-Zellen geerntet und zweimal mit vorgekühlter phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und resuspendiert in einem Annexin V enthaltenden Bindungspuffer. Nach 15-minütiger Inkubation im Dunkeln wurden die Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). Mehrere Steuerungen wurden verwendet, um die Geräteeinstellungen zu optimieren und das Gating für die Windows-basierte Plattform zu bestimmen. Apoptotische Zellen wurden als PI-negativ und Annexin V-FITC-positiv definiert.
Bestimmung der intrazellulären ROS-Erzeugung
Um die ROS-Erzeugung zu bestimmen, verwendeten wir den Fluorophor DCF-DA (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) wie zuvor beschrieben [38]. HK-2-Zellen wurden mit 0 oder 1 mM H2O2 für 24 Stunden mit oder ohne 2 ug PTC-M-Vorbehandlung inkubiert und zweimal mit Hanks ausgewogener Salzlösung gewaschen und dann mit Hanks ausgewogenem Salz inkubiert Lösung (ohne Phenolrot), die DCF-DA enthält, für 30 Minuten bei 37 Grad im Dunkeln. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon, Tokio, Japan) aufgenommen.
Versuchstiere und Protokolle
In-vivo-Bioverteilung
Um die therapeutische Wirkung von PTC-M in vivo zu überprüfen, wurde der Behandlungsgruppe nach der Operation eine Einzeldosis von 0,5 mg/kg PTC-M über eine Schwanzveneninjektion verabreicht. Die Mäusewurden nach 48 Stunden Reperfusion eingeschläfert. Blutprobenwurden von Herzen gesammelt, und dielinke NiereWarschnell entfernt und für Western Blot verarbeitet oderfür die Immunhistotherapie in einer 4%igen Paraformaldehydlösung fixiertChemie (IHC). Derrechte Nierewar eingefroren−80 Gradfür die Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Analyse.
Plasma-NGAL-Messung
Semiquantitatives Immunblotting
Die Western-Blot-Analyse wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (37). Nierengewebe wurden in einer eiskalten Isolationslösung homogenisiert, die 0,3 M Saccharose, 25 mM Imidazol, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 8,5 mM Leupeptin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (pH 7,2) enthielt. Die Homogenate wurden bei 4000×g 15 Minuten lang bei 4 Grad zentrifugiert, um ganze Zellen, Kerne und Mitochondrien zu entfernen. Die Gesamtproteinkonzentration wurde mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Testkit (Pierce; Rockford, IL, USA) gemessen. Alle Proben wurden angepasst, um die gleichen endgültigen Proteinkonzentrationen zu erreichen. Anschließend wurden sie 15 Minuten lang bei 65 Grad in Natriumdodecylsulfat (SDS)-haltigem Probenpuffer gelöst und bei -20 Grad gelagert. Um die gleichmäßige Beladung der Proteine zu bestätigen, wurde ein anfängliches Gel mit Coomassie-Blau gefärbt. Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) wurde auf 9 oder 12 % Polyacrylamidgelen durchgeführt. Die Proteine wurden elektrophoretisch auf Nitrozellulosemembranen (Hybond ECL RPN3032D; Amersham Pharmacia Biotech; Little Chalfont, UK) unter Verwendung eines Bio-Rad Mini Protean II-Geräts (Bio-Rad; Hercules, CA, USA) übertragen. Die Blots wurden mit 5 % Milch in PBS-T (80 mM Na2HPO4, 20 mM NaH2PO4, 100 mM NaCl und 0,1 % Tween-20 bei pH 7,5) 1 Stunde lang blockiert; über Nacht bei 4 Grad mit primären Antikörpern inkubiert; und anschließend mit sekundären Anti-Kaninchen-, Anti-Maus- oder Anti-Ziegen-Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Antikörpern inkubiert. Die Immunoblots wurden dann mithilfe eines verstärkten Chemilumineszenzsystems sichtbar gemacht. Die Proteingehalte wurden mittels Densitometrie quantifiziert. Die relativen Intensitäten der Immunoblot-Signale wurden durch Densitometrie unter Verwendung der Software Scion Image für Windows (Scion Corporation, 2000–2001. Version Alpha 4.0.3.2. MD, USA) gemessen und als Faltungsänderungen relativ zu den Kontrollen ausgedrückt. Die beim Immunblotting verwendeten Primär- und Sekundärantikörper sind in Tabelle S1 aufgeführt.
Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (Echtzeit-PCR)
Die Analyse der Polymerasekettenreaktion wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (37). Nierenrinden wurden in Trizol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) homogenisiert. Die RNA wurde mit Chloroform extrahiert, mit Isopropanol ausgefällt, mit 75 % Ethanol gewaschen und dann in DW gelöst. Die RNA-Konzentration wurde durch die Absorption bei 26 0 nm bestimmt (Ultraspec 2000; PharMacia Biotech, Cambridge, UK). Die mRNA-Expression von Entzündungszytokinen und Adhäsionsmolekülen wurde mittels Echtzeit-PCR bestimmt. cDNA wurde durch reverse Transkription von 5 μg Gesamt-RNA unter Verwendung von Oligo (dT)-Priming und hochgestellter Reverse Transkriptase II (InvitRogen, Carlsbad, CA, USA) hergestellt. Die cDNA wurde unter Verwendung eines Smart Cycler II-Systems (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA) quantifiziert und zum Nachweis wurde SYBR Green verwendet. Jede PCR-Reaktion wurde mit 10 pM Vorwärtsprimer, 10 pM Rückwärtsprimer, 2X SYBR Green Premix Ex Taq (TAKARA BIO INC, Seta 3-4-1, Japan), 0,5 μl cDNA und H2O durchgeführt, um das Endvolumen auf 20 zu bringen ul. Die relativen mRNA-Spiegel wurden durch Echtzeit-PCR unter Verwendung eines Rotor-GeneTM 3000-Detektorsystems (Corbette Research, Mortlake, NSW, Australien) bestimmt. Die Sequenzen der Primer sind in der Zusatzdatei 1: Tabelle S2 aufgeführt. Die PCR wurde gemäß den folgenden Schritten durchgeführt: 1) 95 Grad für 5 Minuten; 2) 95 Grad für 20 s; 3) 58 bis 60 Grad für 20 s (optimiert für jedes Primerpaar) und 4) 72 Grad für 30 s, um SYBR Green zu erkennen. Die Schritte 2 bis 4 wurden weitere 40 Zyklen lang wiederholt, während am Ende des letzten Zyklus die Temperatur von 60 auf 95 Grad erhöht wurde, um eine Schmelzkurve zu erzeugen. Daten aus der Reaktion wurden mit Corbett Research Software gesammelt und analysiert. Die vergleichenden kritischen Schwellenwerte aus Vierfachmessungen wurden zur Berechnung der Genexpression verwendet, mit Normalisierung auf GAPDH als interne Kontrolle. Um die Spezifität der Amplifikationsreaktion zu verbessern, wurde eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt.
Histologie
Die Präparation des Nierengewebes erfolgte wie zuvor beschrieben [37]. Nierengewebe wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und in 3-μm dicke Schnitte geschnitten. Die periodische Säure-Schif-Färbung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers (Abcam, Cambridge, MA, USA) durchgeführt. Für die Immunhistochemie wurden entparaffinierte Gewebeschnitte durch 15-minütiges Erhitzen auf 1{{10}}0 Grad in Citratpuffer, pH 6, antigenentnommen.0 (Sigma- Aldrich). Die Schnitte wurden über Nacht bei 4 Grad mit primären Antikörpern inkubiert, die in Blockierungspuffer verdünnt waren (1 % [w/v] Rinderserumalbumin, gelöst in 0,3 % [v/v] Triton X-100, zubereitet in PBS [0,3 % PBS- T]). Nachdem die Schnitte dreimal kurz mit 0,3 % PBS-T gewaschen worden waren, wurden sie 1 Stunde lang bei RT mit in Blockierungspuffer verdünnten Sekundärantikörpern inkubiert. Die Werte für tubuläre Verletzungen wurden nach der zuvor beschriebenen Methode berechnet [39, 40]. Der Wert der tubulären Verletzung wurde durch Untersuchung von mindestens 10 HPF des kortikomedullären Übergangs (200-fache Vergrößerung) in PAS-gefärbten Schnitten (n=5–7) gemessen. Die in den immunhistochemischen Analysen verwendeten Primär- und Sekundärantikörper sind in Tabelle S3 aufgeführt. Die Apoptose tubulärer Epithelzellen wurde durch TUNEL-Färbung mit dem ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Kit (Sigma-Aldrich) gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen. Gewebeschnitte aller wichtigen Organe wurden in Paraffin eingebettet und mit Hämatoxylin/Eosin (H&E) gefärbt, um die histologischen Veränderungen zu vergleichen.
Statistische Analyse
Die Ergebnisse werden als mittlerer Standardfehler des Mittelwerts (SEM) ausgedrückt. Mehrere Vergleiche zwischen den drei Gruppen wurden mithilfe einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) und des Post-hoc-Tukey-Tests zur ehrlichen signifikanten Differenz durchgeführt. Unterschiede mit p-Werten von weniger als 0,05 wurden als signifikant angesehen.
