Einfluss der menschlichen In-vitro-Verdauungssimulation auf den Phenolgehalt und die biologischen Aktivitäten der wässrigen Extrakte aus türkischen Zistrosenarten Teil 2

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Um zusammenzufassen

Der wässrige Extrakt von C. salvifolius zeigte eine bessere Hemmwirkung auf Verdauungsenzyme als die Extrakte anderer Arten. Darüber hinaus zeigten IN-Proben aller wässrigen Extrakte im Vergleich zu ND-Proben geringere enzymhemmende Aktivitäten.

2.4. AGEs Hemmaktivität

Wie in Tabelle 4 dargestellt, wurde in allen wässrigen Extrakten eine konzentrationsabhängige AGE-Hemmaktivität beobachtet. ND-Proben von CCA, CPA und CSA zeigten sowohl in Konzentrationen von 0,5 als auch von 1 mg/ml eine bessere inhibitorische Aktivität als die Referenzverbindung Quercetin. Unter IN-Proben der Extrakte zeigte jedoch nur C.saluifolius-Extrakt eine bessere Hemmaktivität als Quercetin. Bioverfügbare Proben von wässrigen Extrakten zeigten im Vergleich zu unverdauten Proben geringere AGE-hemmende Aktivitäten. Den Ergebnissen zufolge besaß die ND-Probe des wässrigen Extrakts von C. salvifolius die höchste AGE-hemmende Aktivität. Die IN-Probe des wässrigen Extrakts von C. monspeliensis zeigte jedoch das schwächste AGE-Inhibitionspotential in getesteten Konzentrationen.

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3. Diskussion

Freie Radikale können Proteine, Lipide oder DNA angreifen, um ein Elektron zu beschaffen, was zu verschiedenen Gesundheitsproblemen führt. Aus diesem Grund ist es wichtig, das antioxidative System des Körpers und die durch Oxidation gebildeten freien Radikale auszugleichen. Bei einer Verschlechterung dieses Gleichgewichts entsteht oxidativer Stress [29]. Oxidativer Stress ist einer der Hauptfaktoren, der zu verschiedenen chronischen Erkrankungen wie Krebs, Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Alzheimer-Krankheit usw. führt. Während es im menschlichen Körper selbst antioxidative Systeme gibt, um dies zu bekämpfenoxidativSchäden an Geweben und Organen können diese Abwehrsysteme ihre Effizienz aufgrund verschiedener Bedingungen wie übermäßigem Alkoholkonsum, Rauchen, Stress, chronischem Drogenkonsum und Bestrahlung usw. verlieren [30]. Verschiedene wissenschaftliche Berichte weisen darauf hin, dass sekundäre Pflanzenstoffe eine bedeutende Rolle bei der Verhinderung von oxidativem Stress und seinen schädlichen Auswirkungen spielen [13,14,31]Obwohl die Bioverfügbarkeit ein wichtiger Parameter ist, der die Bioaktivität dieser Verbindungen beeinflusst, wurde sie nicht berücksichtigt die meisten Studien. Es ist jedoch bekannt, dass die sekundären Metaboliten aufgrund unterschiedlicher pH-Bedingungen, enzymatischer Aktivität und Körpertemperatur im Magen-Darm-System Strukturumwandlungen unterliegen. Darüber hinaus sind die chemischen Eigenschaften der sekundären Pflanzenstoffe wie zmolekularGewicht, Polarität und Grad der Bindung an Makromoleküle in der Pflanzenmatrix sind ebenfalls signifikante Faktoren, die ihre Bioverfügbarkeit beeinflussen [13]. Dementsprechend ist die Absorption der Verbindungen oder ihrer Metaboliten in den Blutstrom nach der Einnahme wesentlich, um ihre systemischen physiologischen Wirkungen auszuüben. In-vitro-Verdauungssimulationsmodelle können Anhaltspunkte für die Bewertung der möglichen Bioverfügbarkeitseigenschaften von Stoffen liefern. Während eine Bestätigung in Versuchen am Menschen notwendig ist, um eine funktionelle Eigenschaft zu beanspruchen, werden In-vitro-Simulationsmodelle häufig als Alternativen zu In-vivo-Studien oder Versuchen am Menschen verwendet, die oft ethisch umstritten, ressourcenintensiv, teuer und zeitaufwändig sind [32].

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Mehrere Forscher haben auch das antioxidative Potenzial von Extrakten untersucht, die aus verschiedenen Organen von Cistus-Arten hergestellt wurden. Gemäß der Literaturrecherche ist dies die erste Studie an Cistus-Arten hinsichtlich der Bioverfügbarkeit von phenolischen Substanzen und deren Einfluss auf die antioxidative Aktivität durch Verwendung eines in-vitro-Verdauungssimulationsmodells. Karaset al. [33] schlugen vor, dass 10 Prozent der polyphenolischen Bestandteile unverdaut in der Pflanzenmatrix verbleiben und 90 Prozent davon in der Magen- oder Darmphase verdaut werden (ungefähr 48 Prozent bzw. 52 Prozent). Wie bereits erwähnt, wurden alle Phenolmengen in wässrigen Extrakten durch das Simulationsverfahren der menschlichen Verdauung in vitro negativ beeinflusst. So wurden in den bioverfügbaren Proben aller Extrakte deutliche Verluste im Phenolgehalt festgestellt. Darüber hinaus lagen die Gesamt-Proanthocyanidin-Konzentrationen der IN-Proben in allen wässrigen Extrakten unter der Nachweisgrenze. Verschiedene Studien weisen auch auf den negativen Einfluss des Verdauungsverfahrens auf phenolische Verbindungen in den Pflanzenextrakten und damit verbundene Bioaktivitäten hin. Zum Beispiel haben wir den Gesamtphenolgehalt von Salvia virgata Jacq gemeldet. wurde auch nachteilig durch das Verdauungsverfahren in unserer vorherigen Studie beeinflusst. Darüber hinaus nahmen die Mengen der Hauptmetaboliten des Extrakts, dh Rutin und Rosmarinsäure, tendenziell ab [13]. Im Gegensatz dazu haben mehrere Studien widersprüchliche Ergebnisse berichtet. In der Studie von Celeb et al. [34] beobachteten sie die Zunahme der gesamten Phenolsäure-, Flavonoid- und Phenolmengen in den bioverfügbaren Proben des methanolischen Extrakts aus Hypericum perfoliatum L. Tatsächlich hatten die Hauptmetaboliten, Quercitrin, Chlorogen- und Gallussäure, Bioverfügbarkeitsverhältnisse von über 100 Prozent . Diese Studien zeigten, dass die Auswirkungen des Verdauungsverfahrens je nach Pflanzenmaterial variieren können. Um diese Unterschiede zu verdeutlichen, ist es unerlässlich, den Wirkungsmechanismus des Verdauungssystems auf phenolische Substanzen zu betrachten. Serra et al. [35] schlugen vor, dass phenolische Verbindungen hauptsächlich in Glykosiden, Polymeren und Esterformen in der Pflanzenmatrix vorkommen und im Verdauungssystem vor der Absorption hydrolysiert werden. Verschiedene Faktoren können die strukturellen Umwandlungen der phenolischen Verbindungen im Gastrointestinaltrakt beeinflussen. Beispielsweise müssen Verbindungen mit höheren Molekulargewichten wie Proanthocyanidine oder Procyanidine vor der Absorption im Darm hydrolysiert werden. Die Struktur der Pflanzenmatrix ist auch ein herausragender Faktor für die Bioverfügbarkeit von Phenolen; Phenolverbindungen können an Makromoleküle in der Pflanzenmatrix binden, wie Fasern, Proteine ​​und Lipidmoleküle. Somit können nur die aus der Matrix freigesetzten phenolischen Komponenten aus dem Gastrointestinaltrakt resorbierbar werden. Darüber hinaus gehören unterschiedliche pH-Werte und enzymatische Aktivitäten der Darmmikrobiota zu den anderen entscheidenden Faktoren, die die Umwandlung in der chemischen Struktur von Phenolverbindungen beeinflussen [36]. Angesichts dieser Daten können wir die Hypothese aufstellen, dass unterschiedliche Ergebnisse aus ähnlichen experimentellen Studien auf die Komplexität des Verdauungssystems und die Zusammensetzung der Pflanzenmatrix zurückzuführen sein könnten. Wie in Tabelle 3 dargestellt, zeigten die bioverfügbaren Proben von Cistus-Extrakten aufgrund ihres geringeren Phenolgehalts eine schwächere antioxidative Aktivität als die unverdauten und postgastrischen Gegenstücke.

Darüber hinaus zeigten beide Extrakte von C. saluifolius im Vergleich zu anderen Arten eine bessere antioxidative Aktivität in DPPH-, CUPRAC-, FRAP- und TOAC-Assays. Außerdem zeigten beide Extrakte von C.paroiflorus eine höhere DMPD-Radikalfängeraktivität als die Extrakte anderer Spezies. Wie in Tabelle 1 angegeben, waren die Gesamtgehalte an Phenolen, Flavonoiden und Phenolsäure von C. salviifolius höher als in den anderen Proben. Somit kann das höhere antioxidative Potenzial der C. saloiifolius-Extrakte mit seinem Phenolgehalt zusammenhängen.

Darüber hinaus können die Verringerung der antioxidativen Potenziale, der inhibitorischen Aktivitäten auf kohlenhydratverwandte Enzyme und der AGEs der bioverfügbaren Proben mit der Abnahme der Marker-Flavonoidglykoside zusammenhängen. Cistus-Extrakte enthielten jedoch auch andere phenolische Substanzen, wie in Abbildung 1 angegeben. Daher ist eine detaillierte chromatographische Analyse der Extrakte erforderlich, um den Einfluss der Verdauung auf die biologische Aktivität zu überwachen.

Das Hemmpotential von Pflanzenextrakten auf Verdauungsenzyme hat in letzter Zeit aufgrund der Sicherheitsbedenken bei synthetischen Inhibitoren mehr Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Daher wurde in mehreren Studien die hemmende Wirkung von Pflanzenextrakten ermittelt, die allgemein mit phenolischen Substanzen wie Flavonoiden, Phenolsäuren, Proanthocyanidinen etc. in Verbindung gebracht wurde. Sun et al. [37] schlugen vor, dass polyphenolische Verbindungen ihre hemmende Wirkung entfalten, indem sie mit Hilfe von hydrophoben Kräften und nicht-kovalenten Bindungen an die oben genannten Enzyme binden. Daher hängt die Hemmung der Enzymaktivität von -Amylase und -Glucosidase durch Polyphenole mit ihren molekularen Strukturen zusammen. Während dieser Wechselwirkungsmechanismus unter Verwendung verschiedener Techniken wie Inhibitionskinetik, molekulares Docking-Fluoreszenzlöschen usw. untersucht wurde, wurde noch keine sichere Schlussfolgerung gezogen [38]. Zahlreiche Studien haben jedoch berichtet, dass die Hemmung der Verdauungsenzyme der Pflanzenextrakte in direktem Zusammenhang mit ihrem Phenolgehalt steht. Ähnliche Studien zu den enzymhemmenden Aktivitäten von Cistus-Spezies wurden auch früher berichtet. Sayah et al. [39] untersuchten die -Amylase- und a-Glucosidase-hemmenden Aktivitäten der 80-prozentigen methanolischen und wässrigen Extrakte von C. monspeliensis und C. saluifolius. Ihre Ergebnisse stimmten mit der vorliegenden Studie überein und zeigten, dass der wässrige Extrakt von C. salvijfolius eine höhere -Glucosidase (IC50 ug/ml∶0.95±0.14） und o aufwies -Amylase (IC50 ug/ml∶217,1±0,15) inhibitorische Aktivität als der wässrige Extrakt von C. monspeliensis （IC50 ug/ml∶14,58±1,26） bzw. （ICsn ug/ml:886,10±0,10). Die Hemmraten beider wässriger Extrakte auf diese Enzyme waren höher als die der Referenzverbindung Acarbose (ICso ug/ml: 18,01 ± 2.00). Ähnlich wie in unserer Studie fanden sie eine Korrelation mit den Enzymhemmraten und der Gesamtmenge phenolische und flavonoide Mengen. Sowohl der Gesamtphenol- als auch der Gesamtflavonoidgehalt des wässrigen Extrakts von C. salvijfolius (408,43 ± 1,09 mg GAE bzw. 140,00 ± 1,15 RE) waren höher als der des wässrigen Extrakts von C. monspeliensis (261,76 ± 1,9 mg GAE und 78.00±1,15 RE bzw.). Orhanet al. [40] untersuchten auch die Verdauungsenzym-hemmenden Potenziale von 80-prozentigen wässrigen und ethanolischen Extrakten aus den Blättern von C. laurifolius. Ihren Ergebnissen zufolge zeigten 80 Prozent ethanolischer Extrakt (71,7 Prozent ± 0,6) eine starke Amylase-Hemmaktivität im Vergleich zu wässrigem Extrakt (39,3 Prozent ± 2,2) bei einer Konzentration von 1 mg/ml. Sie schlugen vor, dass phenolische Verbindungen, insbesondere Flavonoide, die Insulinsekretion direkt beeinflussen, indem sie die Apoptose von Betazellen verhindern und die antidiabetische Aktivität unterstützen. Diese Hypothese, die mit unseren Ergebnissen korreliert, zeigt, dass die ND-Probe von wässrigen Extrakten von C. salviifolius den höchsten Gesamtgehalt an Flavonoiden und Phenolen und die größten o-Amylase- und o-Glucosidase-Hemmaktivitäten aufwies. Wie in Tabelle 4 angegeben, zeigte der wässrige Extrakt von C. salviifolius bessere Hemmaktivitäten auf Verdauungsenzyme als die anderen Extrakte.

Darüber hinaus enthielten IN-Proben der wässrigen Extrakte geringere Mengen an Phenolen und Flavonoiden als ND-Proben und zeigten daher in der vorliegenden Arbeit geringere enzymhemmende Aktivitäten. Während der Phenolgehalt der Extrakte durch das Verdauungsverfahren negativ beeinflusst wurde, zeigten sie immer noch eine signifikante Hemmwirkung auf Verdauungsenzyme. In mehreren Studien wurden Flavonoidglykoside als die Hauptmetaboliten von Pflanzenextrakten mit starker Wirkung berichteta-Amylaseund -Glucosidase-Inhibitorpotentiale [41-43]Während der Inhibitormechanismus von phenolischen Verbindungen auf die Verdauungsenzyme noch nicht aufgeklärt wurde, wurden Struktur-Wirkungs-Beziehungsstudien an einigen phenolischen Komponenten wie Flavonoiden, Phenolsäuren, Proanthocyanidinen durchgeführt und Tannine Struktur-Wirkungs-Beziehungsstudien über Flavonoide zeigten, dass die C2=C3-Doppelbindung des C-Rings das Verdauungsenzym-Hemmpotential solcher Verbindungen verstärkt. Da diese Bindung die Elektronendichte erhöht, wird die Stärke der Wechselwirkung zwischen Flavonoid und Enzym erhöht [44]. Darüber hinaus fördern Hydroxylgruppen an C-5 und C-7 das o-Amylase-Hemmpotential von Flavonoiden. Es wurde auch vorgeschlagen, dass die Hydroxylierung des Flavonoidskeletts ihre a-Amylase positiv beeinflusst und-Glucosidase-Enzyminhibitorische Potenziale[45]. Wie bereits erwähnt, waren alle Marker-Flavonoide in der vorliegenden Studie Flavonol-Glykoside, die diese oben beschriebenen strukturellen Anforderungen trugen. Nach dem In-vitro-Verdauungsverfahren nahmen ihre damit verbundenen Aktivitäten jedoch in bioverfügbaren Proben der wässrigen Extrakte signifikant ab.

Im Allgemeinen hängt das hemmende Potenzial der Pflanzenextrakte auf AGEs von mehreren Faktoren ab, dh ihrem Phenolgehalt, antioxidativen Potenzialen, Metallchelatbildungsfähigkeiten, Proteinwechselwirkungen und AGE-Rezeptorblockierungsaktivitäten[13]. Wie in Tabelle 4 dargestellt, zeigten bioverfügbare Proben der wässrigen Extrakte geringere AGE-Hemmaktivitäten im Vergleich zu ND-Proben, da das in vitro-Verdauungsverfahren den Phenolgehalt der Extrakte nachteilig beeinflusste. Gemäß den aktuellen Studienergebnissen besaß die ND-Probe des wässrigen Extrakts von C.salvifolius die höchste AGE-hemmende Aktivität sowie den Gesamtgehalt an Phenolen und Flavonoiden. Im Vergleich dazu zeigte die IN-Probe des wässrigen Extrakts von C. monspeliensis das schwächste AGE-Inhibitionspotential, was auf den niedrigsten Gesamtgehalt an Flavonoiden und Phenolen zurückzuführen ist. Da Flavonoide in Pflanzenextrakten, Obst, Gemüse und Getränken weit verbreitet sind, haben sich mehrere Studien intensiviert mit dem Hemmpotential von Flavonoiden auf AGE-Bildungen. Dieselben Flavonoide, die in dieser Studie als Marker-Phenole zugewiesen wurden, wurden auch in anderen Studien als Markerverbindungen angegeben [46-48].

Ähnlich wie bei der Hemmung von Verdauungsenzymen wurden die AGE-hemmenden Aktivitäten von Flavonoiden durch die C2=-C3-Doppelbindung und die Hydroxylierung der A- und C-Ringe stimuliert. Die Zuckerbindung an das Flavonoidskelett führt jedoch zu einer verringerten inhibitorischen Aktivität [49]. Andererseits haben Cervantes-Lauren et al. [50] schlugen vor, dass Flavon-3- von Glykosiden ein größeres AGE-Inhibitionspotential besitzt als die anderen Flavonoidglykoside. Diese Hypothese kann eine Erklärung für die verringerte AGE-Hemmung in bioverfügbaren Proben sein. Beispielsweise wurden Quercitrin und Hyperosid in bioverfügbaren Proben des wässrigen Extrakts von C. monspeliensis nicht nachgewiesen, was der Grund für die geringere Aktivität von IN-Proben von C. monspeliensis im Vergleich zu den Extrakten anderer Arten ist. Obwohl Quercitrin im wässrigen Extrakt von C. saloifolius nicht nachgewiesen wurde, können signifikant höhere Mengen an Hyperosid und Salidrosid die Ursache für seine hohe AGE-Inhibitionsaktivität sein. Im Allgemeinen wurde eine positive Korrelation zwischen den Markerflavonoidgehalten der Proben und ihren inhibitorischen Potentialen auf AGEs beobachtet.

4. Material und Methoden

4.1.Chemikalien

Alle in den Experimenten verwendeten Referenzen, Enzyme und Chemikalien wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) erworben. In den Experimenten wurden Materialien von Analysequalität verwendet.

4.2. Pflanzenproben

Luftteile von C.creticus und C.saloifolius wurden in der letzten Aprilwoche 2018 auf dem Campus der Yeditepe-Universität (Kayisdagi, Istanbul) gesammelt. Luftteile von C.mon-speliensis und C.paroiflorus wurden in der Nähe von AlacatI Kutlu Aktas gesammelt Balaji, Cesme, Izmir in der zweiten Maiwoche 2018. Luftteile von C. laurifolius wurden in der ersten Juniwoche 2018 von der Straße Kemer-Doganhisar, Konya, gesammelt. Prof. Dr. Erdem Yesilada authentifizierte Pflanzenmaterialien. Belegexemplare für C.creticus (YEF18013), C. lauri-folios (YEF18017), C. monspeliensis (YEF18015), C. paroifforus (YEF18016) und C. salvifolus (YEF18014) wurden im Herbarium der Abteilung für Pharmakognosie aufbewahrt, Fakultät für Pharmazie, Yeditepe-Universität, Istanbul, Türkei.

4.3. Extraktionsverfahren

Die wässrige Extraktion wurde gewählt, da sie als Zubereitungstechnik in der traditionellen Medizin weit verbreitet ist. Die grob luftgetrockneten und pulverisierten Luftteile vonCistancheArten (100 g) wurden mit heißem destilliertem Wasser (80 Grad, 1,5 l) unter Verwendung einer Schüttelvorrichtung für 15 Minuten extrahiert. Dann wurden wässrige Extrakte durch ein Filterpapier filtriert und unter reduziertem Druck zur Trockne eingedampft. Nachdem das Gefriertrocknungsverfahren abgeschlossen war, wurden die Extrakte zur weiteren Verarbeitung in destilliertem Wasser gelöst (unverdaute Probe: ND) (die Ausbeute an Extrakten: 13,04 Prozent für C.creticus, 15,7 Prozent für C. laurifolius, 12,8 Prozent für C. monspeliensis 14,94 Prozent für C. parviflorus, 14,74 Prozent für C. salvifolius).

4.4. In-vitro-Methode zur Simulation der menschlichen Verdauung

Das menschliche Verdauungssimulationsmodell wurde in vitro auf Cistus-Proben angewendet, nach der zuvor von Celeb et al. [34] beschriebenen Methode. Zuerst wurden 1 g NaCl und 1,6 g Pepsin in 500 ml destilliertem Wasser gelöst, um eine simulierte Magensaftlösung zu erhalten (SGF). Später wurde der pH-Wert der SGF-Lösung mit HCl (5 M) auf 2 eingestellt; 17,5 ml dieser Lösung wurden mit 2,5 ml Pflanzenproben gemischt, und diese Mischung wurde für 2 h in das Schüttelwasserbad bei 37 Grad gestellt ahmen die peristaltischen Bewegungen des Verdauungssystems nach. Nach 2 h wurden die Proben in ein Eisbad gegeben, um die enzymatischen Reaktionen zu inaktivieren; 2 ml der Proben wurden als "postgastrische" (P)-Probe für weitere Experimente beiseite gelegt. Eine Zellulose-Dialysemembran, die mit einer geeigneten Menge NaHCO 3 (1 M, pH 7) beladen war, befand sich in den kalten Probenlösungen; somit wurde die gastrointestinale Absorption nachgeahmt. Dann wurden 4,5 ml Gallensäuren/Pankreatin-Lösung mit den Lösungen vereinigt und die Mischung weitere 2 h bei 37 Grad inkubiert. Schließlich wurde die Flüssigkeit innerhalb der Dialysemembran als "bioverfügbare" Probe (IN) erfasst. Nachdem das Verfahren beendet war, wurden alle Proben für weitere Experimente bei -20 Grad aufbewahrt. 4.5.In-vitro-Schätzung des Phenolprofils

4.5.1.Gesamtphenolgehalt-Assay

Die spektrophotometrische Bestimmung des Gesamtphenolgehalts der Proben wurde in einer 96--Well-Plattenvorlage gemäß dem zuvor von Barak et al. [32] beschriebenen Verfahren durchgeführt; 75 ul NagCO3 (20 % in H2O) wurden hinzugefügt 20 μL frisch zubereitete Proben- und Referenzlösungen. Dann wurden 100 &mgr;l Folin-Ciocalteu-Reagenz mit der Mischung kombiniert. Nach einer 30-minütigen Inkubationszeit bei Raumtemperatur im Dunkeln wurde die Extinktion bei 690 nm gemessen. Gallussäure wurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet, um eine Kalibrierungskurve zu erstellen, und der Gesamtphenolgehalt wurde als Gallussäureäquivalente (GAE) ausgedrückt.

4.5.2.Gesamt-Flavonoidgehalt-Assay

Die spektrophotometrische Bestimmung des gesamten Flavonoidgehalts der Proben erfolgte in einer 96--Well-Plattenvorlage gemäß der zuvor erläuterten Methode von Bardakci et al.[51]; 150 ul 75-prozentiges Ethanol, 10 ul Aluminiumchlorid und 10 &mgr;l 1 M Natriumacetattrihydrat wurden getrennt mit 50 &mgr;l Proben- und Referenzlösungen kombiniert. Dann wurden diese Mischungen bei Dunkelkammertemperatur für 30 min inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde die Extinktion bei 405 nm berechnet.Quercetinwurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet, um eine Kalibrierungskurve zu erstellen, und die gesamten Flavonoidgehalte wurden als Quercetin-Äquivalente (QE) dargestellt. 4.5.3.Gesamtgehalt an Phenolsäure

Der Gesamtphenolsäuregehalt der Proben wurde spektrophotometrisch nach dem früher von Barak et al. berichteten Verfahren gemessen. [52]. Zunächst wurden geeignete Mengen an Natriumnitrit und Natriummolybdat in destilliertem Wasser gelöst, um das Arnow-Reagens zu erhalten. Dann wurde 1 ml der Proben getrennt mit 1 ml Arnow-Reagenz, 1 ml 0,1 M HCl und 1 ml 1 M NaOH kombiniert. Danach wurde das Volumen der Mischung mit destilliertem Wasser auf 10 ml eingestellt und die Extinktion wurde sofort bei 490 nm abgelesen. Kaffeesäure wurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet, um eine Eichkurve zu erhalten, und die Gesamtgehalte an Phenolsäure wurden als Kaffeesäureäquivalente (CAE) angegeben.

4.5.4.Gesamt-Proanthocyanidin-Gehaltsassay

Die spektrophotometrische Bestimmung des gesamten Proanthocyanidingehalts der Proben wurde in einer 96--Well-Plattenvorlage nach dem Verfahren von Barak et al. [1]25 ul der Probenlösungen wurden kurz mit 150 ul 4-prozentiger Vanillin- bzw. 75 ul HCl-Lösung (32 prozentig) gemischt. Nach 15 min Inkubationszeit bei Dunkelkammertemperatur wurde die Extinktion auf 492 nm eingestellt. Catechinhydrat wurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet, um eine Eichkurve zu erhalten. Als Kontrolllösung wurde Methanol eingesetzt. Der Gesamt-Proanthocyanidingehalt der Proben wurde als Catechin-Äquivalente (CE) angegeben.

4.6. Radikalfänger-Aktivitäts-Assays 4.6.1.DPPH Radikalfänger-Aktivitäts-Assay

Die DPPH-Radikalfängeraktivität der Proben wurde in einer 96-Well-Plattenvorlage nach der von Celeb et al.[53] modifizierten Methode bestimmt. Zunächst wurden 150 μM DPPH-Lösung frisch hergestellt. Dann wurden 200 &mgr;l DPPH-Lösung mit 25 &mgr;l Probenlösungen gemischt. Dann wurde diese Mischung bei Dunkelkammertemperatur für 50 min inkubiert. Die Extinktion wurde bei 540 nm berechnet. Als Referenzlösung wurde butyliertes Hydroxytoluol (BHT) in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt. Methanol wurde als Kontrolllösung verwendet. Die Aktivität der Proben wurde als EC50 angegeben, was der Konzentration entspricht, die 50 % Aktivität zeigt.

4.6.2. DMPD-Radikalfänger-Aktivitätsassay

DMPD plus (N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin)-Radikalfängeraktivität der Proben wurde in einer 96--Napfplattenmatrize gemäß dem zuvor von Inan et al. beschriebenen Verfahren durchgeführt. [13]. Erstens, 10{{10}} mM DMPD plus Lösung, 0,05 M FeCl; 6H2O-Lösung und 0,01 M Acetatpuffer wurden frisch hergestellt. Dann 1 ml DMPD-Lösung, 100 ml Acetatpuffer und 0,2 ml FeCl; 6H2O-Lösung gemischt, und später wurden 15 μL Probenlösungen mit 210 μL dieser Mischung kombiniert. Nach 50 min Inkubationszeit bei Dunkelraumtemperatur wurde die Extinktion bei 492 nm gemessen. Trolox wurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet, um eine Kalibrierungskurve zu erhalten. Die Konzentrationen der Probenlösungen betrugen 1 mg/ml. Die DMPD-Radikalfängeraktivitäten der Proben wurden als Trolox-Äquivalente (TE) angegeben. 4.7. Metallreduzierende Aktivitätsassays

4.7.1.Eisen reduzierender Antioxidans-Leistungsassay (FRAP)

Die Bestimmung der FRAP-Aktivität der Proben wurde in einem 96-Well-Platten-Template nach dem früher von Bardakci et al.[54] beschriebenen Verfahren durchgeführt. Zu Beginn des Experiments wurde das FRAP-Reagenz durch Mischen von Acetatpuffer, Eisentripyridyltriazin und FeCl gebildet; 6H2O-Lösungen. Danach wurde das FRAP-Reagenz für 30min in den 37-Grad-Ofen gegeben. Dann wurden 10 ul der Probenlösungen mit 30 ul destilliertem Wasser bzw. 260 ul FRAP-Reagenz kombiniert. Nach 30-minütiger Inkubationszeit bei 37 Grad wurde die Extinktion auf 593 nm eingestellt. Eine Standardkurve wurde erstellt, indem verschiedene Molaritäten von Eisensulfatlösung (0,25-2 mM) verwendet wurden, um die Ergebnisse zu bewerten. BHT wurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet. FRAP-Aktivitäten der Proben wurden als mM FeSO4 in 1 g Trockenextrakt dargestellt.

4.7.2.Cupric Reducing Antioxidant Capacity Assay (CUPRAC)

Die CUPRAC-Aktivität der Proben wurde in einer 96-Well-Plattenvorlage nach dem von Celeb et al. modifizierten Verfahren bestimmt. 【31】; 85 μl CuSO4 (10 mM), Neocuprain- und Ammoniumacetatlösungen und 51 μl destilliertes Wasser wurden separat zu 43 μl Probenlösungen gegeben. Nach einer Inkubationszeit (20 min) bei 50 Grad im Wasserbad wurde die Extinktion bei 450 nm gemessen. Ascorbinsäure wurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet, um eine Eichkurve zu erhalten. Die CUPRAC-Aktivitäten der Proben wurden als Ascorbinsäureäquivalente (AAE) dargestellt. 4.8. Test der gesamten antioxidativen Aktivität (TOAC) Die Bestimmung der gesamten antioxidativen Aktivität der Proben wurde in einer 96--Napfplattenschablone nach dem Verfahren von Celeb et al. [55]. Zunächst wurde eine bestimmte Menge Natriumphosphat, Ammoniummolybdattetrahydrat und Schwefelsäure gemischt, um die TOAC-Lösung zu erhalten. Dann wurden 300 &mgr;l TOAC-Lösung zu 30 &mgr;l Probenlösungen hinzugefügt. Nach der Inkubationszeit bei 95 Grad im Wasserbad für 90 min wurde die Extinktion bei 690 nm bestimmt. Ascorbinsäure wurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet, um eine Eichkurve zu erhalten. Die TOAC-Aktivitäten der Proben wurden als Ascorbinsäureäquivalente (AAE) dargestellt. 4.9.Schätzung des Bioverfügbarkeitsindex

Der Bioverfügbarkeitsindex (BAvI) wurde nach der von Inan et al.[13] beschriebenen theoretischen Gleichung berechnet: BAVI=CIN/CND Der "Bioverfügbarkeitsindex" (BAvI) wurde als Verhältnis der Anzahl der Phenole beschrieben in der bioverfügbaren Probe (IN) zu der in der unverdauten Probe (ND). 4.10. Quantifizierung von Marker-Flavonoiden durch HPTLC

Die quantitative Bestimmung der Salidrosid-, Hyperosid- und Quercitrinkonzentrationen in allen Simulationsproben (ND, PG, IN) der wässrigen Extrakte aus Cistus-Arten erfolgte mittels Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC) (CAMAG, Muttenz, Schweiz) nach der von Guzelmeric et al. [16] validierten Methode. Hyperosid, Salidrosid und Quercitrin wurden in Konzentrationen von 25, 50 und 100 ug/ml hergestellt, und die Konzentrationen von frisch hergestellten Probenlösungen wurden auf 10 mg/ml eingestellt. Diese Lösungen wurden auf Normalphasen-Kieselgelplatten mit Glasrücken (20 cm × 10 cm, Merck, Darmstadt, Deutschland) mit bestimmten Volumina (1-5 μl Standardlösungen und 5 μl Probenlösungen) unter Verwendung von 100-μl-Spritzen aufgetragen ( Hamilton, Bonaduz, Schweiz）. Das Aufbringungsverfahren wurde mit dem Probenapplikator Linomat 5 durchgeführt. Der Entwicklungsprozess wurde in einer automatisierten Entwicklungskammer (ADC 2) und Ethylacetat: Dichlormethan, Essigsäure, Ameisensäure: Wasser (10:25:10) durchgeführt :10:10:10me) wurde als mobile Phase ausgewählt Anschließend wurden die Platten mit Natural Product Reagent (NPR) (1g Diphenylborsäure 2-aminoethylesterin 200mL Ethylacetat) in der Tauchvorrichtung (CAMAG) derivatisiertHyperosidund Quercitrin wurden spektrophotometrisch bei 260 nm analysiert, die Menge an Salidrosid wurde bei 330 nm mit einem UV-Scanner gemessen. Die Rf-Werte der Standards wurden als Hyperosid （≈0.35）, Quercitrin （≈0.45）, Tilirosid （≈0.65） bestimmt. Die Korrelationskoeffizienten （r2） wurden mit x0.98 ermittelt zur Quantifizierung der Marker Flavonoide.

4.11. Inhibitorische Aktivität auf Diabetes-verwandte Enzyme

4.11.1. -Glucosidase-Inhibitoraktivität

-Glucosidase-Inhibitoraktivitäten der unverdauten und bioverfügbaren Proben, die aus den wässrigen Extrakten von Cistus-Spezies erhalten wurden, wurden nach dem zuvor von Balan et al. [56]. Zuerst wurden geeignete Mengen an Mononatriumphosphat und Dinatriumphosphat mit der Beschaffung von 100mM Phosphatpuffer (pH7) gemischt. o---Glucosidase-Enzym wurde in Phosphatpuffer gelöst, um die a-Glucosidase-Lösung (0,2 U/ml) zu erhalten. Dann wurden 17 0 ul Phosphatpuffer, 20 ul der -Glucosidase-Lösung und 20 ul Probenlösungen kombiniert und in einem 37-Grad-Ofen für 15 min inkubiert. Danach wurden 20 μl 2,5 mM p-Nitrophenyl- -D-glucopyranosid-Lösung in 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) zu der Mischung gegeben, und eine weitere Inkubationszeit wurde bei 37 Uhr durchgeführt Grad für 15 min. Dann wurden 80 &mgr;l 0,2 M Natriumcarbonatlösung zu der Mischung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Die Absorption wurde bei 405 nm gemessen. Als Referenz wurde Quercetin-Lösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der inhibitorischen Aktivität in Konzentrationen von 1 mg/ml und 0,5 mg/ml von ND- und IN-Proben der wässrigen Extrakte von Cistus-Spezies geschätzt. 4.11.2. -Amylase-Hemmaktivität Die o-Amylase-Hemmaktivität von unverdauten und bioverfügbaren Proben, die aus den wässrigen Extrakten von Cistus-Arten gewonnen wurden, wurde nach dem zuvor von Balan et al. [56] beschriebenen Verfahren bestimmt. Die spektrophotometrische Bestimmung der a-Amylase-Hemmaktivitäten der Proben wurde unter Verwendung von DNS (3,5-Dinitrosalicylsäure)-Reagens durchgeführt. Wie in dem Verfahren angegeben, wird Maltose aus der Umwandlung der Stärke gebildet, und die gelbe Farbe der alkalischen DNS wird aufgrund der aus Stärke hergestellten Maltose in die orange-rote Farbe umgewandelt. So wurde aus der Mischung von Natriumkaliumtartratlösung (gelöst in 2 M NaOH) und einer bestimmten Menge DNS (gelöst in destilliertem Wasser) eine 96 mM DNS-Lösung hergestellt. Dann wurde 20 mM Natriumphosphatpuffer mit 6,7 mM NaCl (Co-Faktor des u-Amylase-Enzyms) bei 20 Grad (pH: 6,9) hergestellt. das a-Amylase-Enzym (1 U/ml) und Stärke (10 mg/ml) wurden in diesem Puffer gelöst. Danach wurden 50 &mgr;l Natriumphosphatpuffer und 10 &mgr;l a-Amylase-Enzymlösung mit 20 &mgr;l der Probenlösungen gemischt. Diese Mischung wurde 45 min lang bei 37 Grad inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden 20 &mgr;l der Stärkelösung zu der Mischung hinzugefügt. Eine weitere Inkubationsperiode wurde bei 37 Grad für 45 min gestartet. Das gleiche Verfahren wurde auf die Proben ohne die Zugabe von &bgr;-Amylase-Enzymlösung, die als "Probenhintergrund" bezeichnet wird, angewendet. Die Kontrollgruppe wurde mit dem gleichen Verfahren in Abwesenheit von Probenlösungen untersucht. Die Extinktion wurde bei 540 nm gemessen. Als Referenzlösung wurde Acarbose in unterschiedlichen Konzentrationen verwendet. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der Hemmaktivität in Konzentrationen von 1 mg/ml und 0,5 mg/ml von ND- und IN-Proben aus wässrigen Extrakten von Cistus-Arten dargestellt. 4.11.3. AGE-Hemmaktivität Die AGE-Hemmaktivität von unverdauten und bioverfügbaren Proben aus wässrigen Extrakten von Cistus-Spezies wurde nach dem von Starow-icz et al. [57]. Vor jedem Prozess wurden Konzentrationen von 1 mg/ml und 0,5 mg/ml von ND- und IN-Proben frisch zubereitet. Dann wurde 1 ml einer Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) in einer Konzentration von 10 mg/ml zu 1 ml ND- und IN-Probenlösungen gegeben. Kontrollproben wurden ohne Zugabe von ND- und IN-Probenlösungen hergestellt, und die Blindproben wurden ohne Zugabe von 0,5 M Glucose hergestellt. Anschließend wurden alle vorbereiteten Proben für 40 h in einem Schüttelwasserbad bei 55 Grad inkubiert. Nach Ende der Inkubationszeit wurde der Thermo ScientificTM VarioskanTMLUX Multimode-Mikroplatten-Reader im 370-nm-Anregungs-/440-nm-Emissionsbereich verwendet, um die Fluoreszenzintensität zu berechnen. Quercetin wurde als Referenzlösung in verschiedenen Konzentrationen verwendet.

4.12.Statistische Analyse

Alle Experimente wurden unabhängig voneinander dreimal zu unterschiedlichen Zeiten durchgeführt. Das Softwareprogramm GraphPad Prism (Version 6.1) wurde verwendet, um die parametrische oder nicht-parametrische Verteilung der Daten zu bestimmen. Einweg-ANOVA Tukeys Analyseabschnitt für Mehrfachvergleiche wurde verwendet, um TPC-, TFC-, TPAC-, TSC-, TPACC-, FRAP-, CUPRAC-, TOAC-, DPPH- und DMPD-Assays zu bewerten. Andererseits wurden die Ergebnisse der o-Amylase-, -Glucosidase- und AGE-Inhibitionsexperimente durch die Zweiweg-ANOVA-Sidak-Mehrfachvergleichsanalyse untersucht. Signifikante Ergebnisse wurden mit p gezeigt<0.05. 5.="">

In der vorliegenden Studie wurden die wässrigen Extrakte aller Cistus-Arten, die in der türkischen Flora nachgewiesen wurden, auf ihre phenolischen Profile und ihre antioxidativen und antidiabetischen Potenziale in vitro untersucht. Da Abkochung oder Aufguss die übliche Form in der traditionellen Medizin ist, ist die Verwendung von wässrigen Extrakten zur Aktivitätsbewertung in experimentellen Studien besonders wichtig. Andererseits werden hydrophile Bestandteile im wässrigen Extrakt nach der Einnahme einer Reihe von metabolischen Umwandlungen im Magen-Darm-System unterzogen. Daher sollten für eine korrekte Aktivitätsbewertung traditioneller Formulierungen auch die Aktivitäten der bioverfügbaren Metaboliten untersucht werden.

Dies ist die erste Studie, die die Folgen der Simulationsmethode der menschlichen Verdauung in vitro auf türkische Cistus-Arten untersucht. Darüber hinaus wurde in dieser Studie erstmals das Hemmpotential türkischer Cistus-Arten auf AGEs untersucht. Darüber hinaus wurden Salidrosid, Hyperosid und Quercitrin Marker zugeordnetFlavonoide, und Änderungen ihrer Konzentrationen wurden im In-vitro-Verdauungsverfahren überwacht. Obwohl der Phenolgehalt und die antidiabetischen und antioxidativen Aktivitäten der Extrakte durch gastrointestinale Verdauungsverfahren negativ beeinflusst wurden, zeigten sie immer noch eine signifikante Bioaktivität. Den Ergebnissen zufolge wurde C. saloifolius-Extrakt als die wirksamste Pflanze in Bezug auf den Phenolgehalt und die antioxidativen und antidiabetischen Aktivitäten identifiziert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass oberirdische Teile türkischer Cistus-Arten einen reichen Phenolgehalt und potenzielle antioxidative und antidiabetische Aktivitäten aufweisen. Während die In-vitro-Verdauungssimulationsmethode zur Bewertung der Bioverfügbarkeit eingesetzt wurde, ahmt sie die im Organismus auftretenden Stoffwechselwege möglicherweise nicht vollständig nach. Daher sind weitere In-vivo- und klinische Studien erforderlich, um die Bioverfügbarkeit der phenolischen Verbindungen und ihren Beitrag zu den berichteten pharmakologischen Wirkungen im Detail zu beurteilen.

Dieser Artikel stammt aus Molecules 2021, 26, 5322