Angeborene Immunantwort auf Fasten und Refeeding in der Zebrafischniere

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Zongzhen Liao, Dihang Lin, Jirong Jia, Ran Cai, Yang Yu und Wensheng Li *

State Key Laboratory of Biocontrol, Guangdong Province Key Laboratory for Aquatic Economic Animals, Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center for Healthy Breeding of Important Economic Fish, School of Life Sciences, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510275, China;

liaozzh@mail2.sysu.edu.cn (ZL); lindihang2018@sibcb.ac.cn (DL); jiajr3@mail.sysu.edu.cn (JJ); Alan6382@163.com (RC); yuyang65@mail2.sysu.edu.cn (JJ)

* Korrespondenz: lsslws@mail.sysu.edu.cn

Cistanche ist sehr gut für die Nierenfunktion

Abstrakt: Tiere erhalten Nährstoffe und Energie durch Fütterung, um ein Gleichgewicht zwischen Wachstum und Organismusgesundheit zu erreichen. Bei einer Änderung der Nährstoffaufnahme ändert sich der Wachstumszustand und kann auch zu Veränderungen des intrinsischen Immunsystems führen. Beim kompensatorischen Wachstum (CG), einem spezifischen Wachstumsphänomen, geht es um die Frage, ob Veränderungen im Wachstum mit Veränderungen der angeborenen Immunität einhergehen können. Als geeignetes Modell kann der Zebrafisch (Danio rerio) dienen, ein bekannter Fisch-Modellorganismus. In dieser Studie wurde der Zebrafisch 3 Wochen lang gefastet und über einen Zeitraum von 3 bis 7 Tagen wieder gefüttert. Es wurde festgestellt, dass CG bei Zebrafischen erreicht werden konnte. Die Anfälligkeit von Zebrafischen für Streptococcus agalactiae nahm nach dem Hungern zu. Darüber hinaus stieg die Anzahl der Melanomakrophagen-Zentren nach dem Fasten und der Anteil der verletzten Tubuli nach der Wiederaufnahme für 3 bzw. 5 Tage. Außerdem dieNierender an Hunger leidenden Zebrafische standen unter oxidativem Stress, und die Aktivität mehrerer antioxidativer Enzyme stieg nach dem Hungern an, darunter Katalase, Glutathionperoxidase und Superoxiddismutase. Angeborene Immunparameter wurden durch Hunger beeinflusst. Zusätzlich stieg die Aktivität von alkalischer Phosphatase und Lysozym nach Hungern an. Die mRNA-Expression von immunbezogenen Genen wie il-1 war nach Fasten mit oder ohne Lipopolysaccharide (LPS)-Challenge unterschiedlich stark erhöht. Diese Studie zeigte, dass die Funktion des angeborenen Immunsystems bei Zebrafischen durch den Ernährungszustand beeinflusst werden könnte.

Schlüsselwörter: angeborenes Immunsystem; Niere; oxidativen Stress; kompensatorisches Wachstum; Zebrafisch

1. Einleitung

Grundlegende Lebensaktivitäten sind von der Energieversorgung des Organismus abhängig. Der Nährstoffzustand des tierischen Körpers kann die Funktion des Immunsystems beeinflussen [1,2]. Kompensatorisches Wachstum (CG) ist eine Phase schnellen Wachstums nach einer Phase der Wachstumsunterdrückung, die durch Nahrungsmangel und andere Umweltfaktoren verursacht werden kann [3,4]. Dieses Phänomen wurde zuerst bei Säugetieren beobachtet und wurde schließlich bei Vögeln [3] und Knochenfischen [5] gefunden. CG wird in zwei Phasen unterteilt: die katabole Phase und die hyperanabole Phase [6]. Eines der Grundmuster von CG ist Fasten und Refeeding. Nach einer erneuten Fütterung können Fische teilweise, vollständig, über- oder gar nicht kompensiert werden [4]. Das spezielle Fütterungsregime von CG wird als potenzieller Weg zur Verbesserung der Produktionseffizienz bei gezüchteten Arten angesehen [7].

Die angeborene Immunantwort ist die erste Grenze der Wirtsabwehr und schützt Organismen vor Krankheitserregern. Zu den Organen des Immunsystems bei Fischen gehören die Thymusdrüse,KopfNiere, Schwanzniere, Kiemen, Leber,und Darm [8,9]. Eine breite Palette von Zelltypen ist an unspezifischen zellulären Abwehrreaktionen bei Fischen beteiligt, darunter Monozyten/Makrophagen, unspezifische zytotoxische Zellen und Granulozyten (Neutrophile). Der Immunmetabolismus ist das Zusammenspiel zwischen immunologischen und metabolischen Prozessen [10]. Der Stoffwechselstatus von Fischen kann ihre Immunfunktion beeinflussen. Beim Menschen beeinflusst der Ernährungszustand die Anzahl der Immunzellen – und deren Aktivität [11]. Es wurde festgestellt, dass die Funktion des Immunsystems bei Mäusen durch deren Stoffwechselzustand beeinflusst werden könnte [12–14]. Intermittierendes Fasten bei Karauschen (Carassius auratus) veränderte die Darmbakteriengemeinschaften und erhöhte die Aktivität von Superoxiddismutase (SOD) und Lysozym [15]. Hunger verändert auch die Genexpression angeborener Immunantworten in der Leber von Lachsen [16]. Darüber hinaus finden sich Studien zu Auswirkungen der Stoffwechsellage auf das Immunsystem bei anderen Knochenfischen [17–19]. Allerdings ist der Einfluss der Stoffwechsellage auf das Immunsystem bei Knochenfischen noch wenig verstanden. Oxidativer Stress kann die Funktionalität des angeborenen Immunsystems einschränken und Komponenten wie Toll-like-Rezeptoren induzieren [20,21]. Unterdessen kann Hunger die Produktion von ROS erhöhen und Autophagie verursachen [22,23]. Es wäre eine Untersuchung wert, ob oxidativer Stress die Beziehung zwischen Hunger und Immunität vermittelt.

Zebrafisch (Danio rerio) ist ein weit verbreitetes Modell zur Untersuchung von Immunität und Krankheit. Das angeborene Immunsystem von Zebrafischen beginnt sich am ersten Tag der Embryogenese zu entwickeln, und das adaptive Immunsystem fehlt bis 4–6 Wochen nach der Befruchtung. Dies macht Zebrafische zu einem großartigen Modell für Studien des angeborenen Immunsystems [9]. Die Niere ist das primäre lymphatische Organ beim Zebrafisch [24]. Das havcr1-Gen codiert ein transmembranes tubuläres Protein namensNierenverletzungsmolekül-1 (KIM-1) [25]. KIM-1 ist der Indikator für Gewebeschäden in der Niere, und die Überexpression von KIM-1 verursacht Nierenschäden bei Zebrafischen [26]. Es wurde festgestellt, dass Fasten den Stoffwechselzustand bei Zebrafischen verändern kann [27]. Das Fasten führte zu einem verringerten Sauerstoffverbrauch und Leberfett- und Glykogengehalt. Es erhöhte auch die Aktivität der 8-Oxidation und Glukoneogenese in der Leber. Unterdessen nahmen reaktive Sauerstoffspezies (ROS) an der CG im Zebrafisch teil [28]. ROS, die in der Leber produziert werden, waren für CG in Zebrafischen notwendig, weil sie den AMPK-Weg induzierten. In der vorliegenden Studie haben wir eine Strategie des Fastens und der erneuten Nahrungsaufnahme eingeführt, um das CG-Muster bei Zebrafischen zu untersuchen. Streptococcus agalactiae verursachte schwere Sepsis und Meningitis bei Zebrafischen und konnte mehr als 30 Fischarten infizieren [29]. Wir wählten Streptococcus agalactiae und Lipopolysaccharide (LPS) zur Injektion, um den Einfluss von CG auf das angeborene Immunsystem zu untersuchen, kombiniert mit Veränderungen der immunbezogenen Parameter und der Genexpression.

2. Materialien und Methoden

2.1. Zebrafisch, Fütterungsschemata und Körpergewicht

Die in dem Experiment verwendeten ausgewachsenen Zebrafische wurden vom Yuehe Fish-Bird-Flower-Markt (Guangzhou, China) gekauft und zwei Wochen lang akklimatisiert. Die gesamte Fischzucht wurde in der Fischkultur-Experimentierstation der Sun Yat-sen-Universität, Provinz Guangdong, China, durchgeführt. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und der Genehmigung des Animal Care and Use Committee der Sun Yat-Sen University durchgeführt. Während des Versuchszeitraums lag der pH-Wert im Bereich von 7,8 bis 7,9, der gelöste Sauerstoff im Bereich von 6,95 bis 7,23 mg/l und die Wassertemperatur im Bereich von 26,5 bis 28 oC. Die Konzentrationen von Ammoniak-N und Nitratstickstoff wurden unter 0,2 bzw. 0,{{20}}05 mg/L gehalten. Der Salzgehalt des Wassers betrug 0,2 ppt. Zebrafisch wurde in einem 12:12-h Licht-Dunkel-Wechsel gehalten. Um die Veränderungen des Körpergewichts während des Fastens und der Nachfütterung zu untersuchen, wurde das Körpergewicht einmal pro Woche aufgezeichnet. Das anfängliche Körpergewicht der Zebrafische im Experiment betrug 0,35 ± 0,06 g, und sie waren ungefähr 3 Monate alt. Die Zebrafische wurden nach dem Zufallsprinzip in 24-Liter-Tanks aufgeteilt, und jeder Tank enthielt 30 Fische. Ihnen wurde zweimal täglich eine handelsübliche Diät mit Sättigungsfütterung angeboten. Die Fütterungsschemata für jedes Experiment sind in Tabelle 1 gezeigt. Nach der Behandlung wurden die Zebrafische durch eine Überdosis MS-222 (Sigma, Burlington, MA, USA) betäubt und getötet. Dann wurde die Niere in das Eppendorf-Röhrchen gebracht und sofort in flüssigen Stickstoff gegeben. Die Probe wurde aus flüssigem Stickstoff überführt und bei -80 oC gelagert.

2.2. Streptococcus agalactiae-Challenge

Die Zebrafische, die fasten und sich wieder ernähren, wurden mit Streptococcus agalactiae herausgefordert. Der Stamm Streptococcus agalactiae wurde freundlicherweise von Professor Anxing Li, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University [30] zur Verfügung gestellt. Die Zebrafische in jeder Gruppe wurden weiter in vier kleine Gruppen mit 15 Fischen in jeder kleinen Gruppe aufgeteilt. Die Zebrafische in drei dieser Gruppen wurden mit 80 mg/l MS-222 anästhesiert und intraperitoneal mit 5 ul, die 5 × 106 koloniebildende Einheiten von Streptococcus agalactiae enthielten, injiziert. Den verbleibenden Zebrafischen wurden 5 ul PBS injiziert. Alle Zebrafische wurden 4 Tage lang ohne Fütterung beobachtet. Die Sterblichkeitsrate wurde aufgezeichnet.

2.3. LPS-Einspritzung

Die Zebrafische, die fasten und sich wieder ernähren (F24, S24 und F21R3), wurden mit LPS (Sigma, Burlington, MA, USA) herausgefordert. LPS-Pulver wurde in sterilem Wasser auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml gelöst. Vor der Verwendung wurde 1 mg/ml LPS mit PBS verdünnt und die Endkonzentration betrug 20 ug/ml. Die Zebrafische in jeder Gruppe wurden in zwei kleine Gruppen aufgeteilt, und es gab 12 Fische in jeder kleinen Gruppe. Den Fischen in den beiden Gruppen wurden LPS und PBS injiziert. Die Zebrafische wurden mit MS-222 anästhesiert und intraperitoneal mit 5 ul 20 ug/ml LPS oder PBS injiziert. Nach 3 h wurden die Zebrafische betäubt und getötet. Danach wurde die Niere entfernt und bei -80 oC aufbewahrt.

2.4. Histopathologie

Die Zebrafische wurden nach 21 Tagen Hungern 14 Tage lang mit erneuter Fütterung gehalten. An den Tagen 21, 24, 28 und 35 wurden Proben entnommen. Nach der Tötung wurden die Zebrafischnieren entnommen und in 4-prozentiges Formaldehyd getaucht. Dann wurden die Nieren paraffingeschnitten. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin-Eosin (HE) (Beyotime, Shanghai, China) gefärbt und mit einem Lichtmikroskop (Olympus, Tokio, Japan) betrachtet. Um die Veränderung verletzter Tubuli und Melano-Makrophagen-Zentren (MMCs) zu quantifizieren, wurden 5 nicht überlappende Bilder von jedem Objektträger aufgenommen. Die Bereiche der verletzten Tubuli und die gesamte Probe wurden unter Verwendung der Cellsens-Software (Olympus, Tokyo, Japan) gemessen. Aus jedem Bild wurde der Anteil der verletzten Tubuli berechnet, indem die Fläche der verletzten Tubuli durch die Fläche der gesamten Probe dividiert wurde. Die Menge an MMCs wurde in jedem Bild gezählt und dann durch die Fläche der gesamten Probe dividiert. Anschließend wurden die Fold Changes der MMCs mit der Gruppe F21 als Standard berechnet.

2.5. Verwandter biochemischer Parameter-Assay

Die Gehalte an Malondialdehyd (MDA) und Stickstoffmonoxid (NO) sowie die enzymatischen Aktivitäten von SOD, alkalischer Phosphatase (ALP), Katalase (CAT), Glutathionperoxidasen (GSH-Px) und Lysozym in der Niere wurden mit entsprechenden kommerziellen Kits gemessen gemäß den Protokollen des Herstellers. In Kürze,Nierenaus Zebrafischen wurden in flüssigen Stickstoff gegeben und bei -80 oC gelagert. Vor dem Testen wurde jede Niere herausgenommen und in vorkaltem PBS mit einem Gewebezerstörer homogenisiert.Nierenhomogenatwurde bei 4 oC und 12,000× g für 10 min zentrifugiert und der Überstand wurde als genommenNiereAuszug zur Erkennung. Der MDA-Gehalt wurde mit einem Lipid Peroxidation MDA Assay Kit (Beyotime, Shanghai, China) nachgewiesen und der Nachweis basierte auf der Farbreaktion zwischen MDA und Thiobarbitursäure. Die verwendete Wellenlänge war 535 nm. Der NO-Gehalt wurde mit einem Griess-Reagenzsystem (Promega, Madison, WI, USA) gemessen. Das Griess-Reagenzsystem basiert auf der Nitritreaktion mit Sulfanilamid und N-1-Naphthylethylendiamindihydrochlorid unter sauren Bedingungen. Der NO-Gehalt wurde durch einen Natriumnitrit-Standard berechnet und auf den Proteingehalt normalisiert. Die Extinktion wurde mit einem Filter bei 490 nm gemessen. Die Aktivität von Lysozym wurde mit einem Lysozym-Assay-Kit (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) nach dem Protokoll des Herstellers nachgewiesen. Nierenextrakt wurde mit Fluorescein-konjugierter Micrococcus lysodeikticus-Zellwand inkubiert. Die Fluoreszenz wurde nach 45-minütiger Inkubation bei 37 °C bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 485 und 535 nm gemessen. Der Wert von Lysozym wurde durch eine Standardkurve berechnet und auf den Proteingehalt normalisiert. Die enzymatischen Aktivitäten von SOD, ALP, CAT und GSH-Px wurden getrennt mit Assay-Kits vom SOD-Typ, Assay-Kits für alkalische Phosphatase, Assay-Kits für Katalase und Assay-Kits für Glutathionperoxidase (Nanjing Jiancheng, Nanjing, China) nachgewiesen. Eine Einheit der SOD-Aktivität wurde als die Menge an SOD definiert, die einer 50-prozentigen Hemmung der Nitroblau-Tetrazolium-Reduktionsrate pro mg Protein in einem 1-ml-System entspricht. Die verwendete Wellenlänge betrug 570 nm. Eine Einheit der ALP-Aktivität wurde als das Volumen eines Enzyms definiert, das mit dem Substrat reagierte, um 1 mg Phenol in 30 min bei 37 °C zu produzieren, und auf den Proteingehalt normalisiert. Die verwendete Wellenlänge war 490 nm. Die CAT-Aktivität basierte auf dem Verbrauch von Wasserstoffperoxid. Die verwendete Wellenlänge war 405 nm. Die Aktivität von GSH-Px wurde durch die Geschwindigkeit der katalysierenden Reaktion zwischen Wasserstoffperoxid und GSH gemessen. Nach Abzug der nicht-enzymatischen Reaktion wurde eine Einheit der GSH-Px-Aktivität als Verringerung der GSH-Konzentration um 1 mol/l in jedem System definiert. Die verwendete Wellenlänge war 405 nm. Die Proteinkonzentration wurde mit einem BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Shanghai, China) gemessen. Die verwendete Wellenlänge betrug 570 nm.

2.6. ROS-Produktion

Der Inhalt von ROS in derNierewurde mit der Fluoreszenzsonde 2/,7/-Dichlorfluoresceindiacetat (DCF-DA) (Sigma, Burlington, MA, USA) wie zuvor beschrieben bestimmt [28]. Kurz gesagt, die dem Zebrafisch entnommene Niere wurde in vorgekühlte 100 &mgr;l PBS gegeben und mit Gewebezerstörer homogenisiert. Nach Zentrifugation für 10 min mit 10,000 × g bei 4 oC, 20 µL vonNiereExtraktwurde zu schwarzen Mikroplatten mit 96- Vertiefungen gegeben, und jeder Vertiefung wurden 25 uM DCF-DA zugesetzt. Die Mikroplatte wurde 30 min lang bei 37 °C inkubiert. Die Fluoreszenz wurde in einem Multilabel-Plattenlesegerät (PerkinElmer Victor X5, Waltham, MA, USA) mit auf 485 und 535 nm eingestellten Anregungs- und Emissionsfiltern gemessen. Der Proteingehalt des Nierenextrakts wurde mit einem BCA Protein Assay Kit gemessen. Der Gehalt an ROS für jede Probe wurde berechnet, indem der Fluoreszenzwert auf den Proteingehalt normalisiert wurde. Die Proteinkonzentration wurde mit einem BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Shanghai, China) gemessen. Die verwendete Wellenlänge betrug 570 nm.

2.7. Respiratory Burst Assay

Zebrafische, die fasten und sich wieder ernähren (F24, S24 und F21R3), wurden verwendet, um die respiratorische Burst-Aktivität zu messen. Das Protokoll für den respiratorischen Burst-Assay wurde gemäß einer zuvor veröffentlichten Methode durchgeführt [31,32]. Kurz gesagt, dieNierenwurden von den anästhesierten Zebrafischen getrennt und in {{0}}-Well-Mikroplatten mit 100 ul Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM)/F-12 gegeben. Nach Inkubation der Platte für 30 min bei 28 oC wurden 100 ul DMEM/F-12 enthaltend DCF-DA, Dimethylsulfoxid (DMSO) und Phorbolmyristatacetat (PMA) (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) zugegeben zu jedem erkannten Well hinzugefügt. Inzwischen wurden 100 ul DMEM/F-12, enthaltend DMSO, zu jeder Kontrollvertiefung gegeben. Die Endkonzentrationen der verschiedenen Lösungen waren wie folgt: 500 ng/ml DCF-DA, 0,2 Prozent DMSO und 200 ng/ml PMA. Die Fluoreszenz wurde in einem Multilabel-Plattenlesegerät mit auf 485 und 535 nm eingestellten Anregungs- und Emissionsfiltern gemessen. Die Fluoreszenz jeder Vertiefung

wurde unmittelbar nach der Zugabe von Lösungen in die Vertiefung und danach alle 15 min für 150 min gemessen. Der Zeitpunkt zum Vergleich der Fluoreszenzwerte war 150 min. Von der Fluoreszenz wurden die Fluoreszenzwerte der uninduzierten Kontrollgruppe abgezogen

Werte der einzelnen PMA-induzierten Gruppen. Die normalisierten Fluoreszenzwerte wurden berechnet. Diese normalisierten Fluoreszenzwerte wurden in drei Spalten sortiert.

2.8. RNA-Extraktion und Echtzeit-PCR

Das GefroreneNierenwurden in TRIzol (Omega, Norcross, GA, USA) gemahlen und die Gesamt-RNA wurde gemäß dem Protokoll [33] aufgetrennt. Nach Verdau mit DNase1 (NEB, Ipswich, MA, USA) wurde cDNA mit einem RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) mit Random Hexamer Primer produziert. qRT-PCR wurde in 10 ul Reaktionsmischungen angesetzt, die 5 ul 2x SYBR Green qPCR Master Mix (Bike, Houston, TX, USA) enthielten. Alle Proben wurden doppelt ausgeführt und auf eEF1a1a-Expression normalisiert. Die Sequenzen der in der vorliegenden Studie verwendeten Oligonukleotid-Primer sind in der Ergänzungstabelle S1 beschrieben. Die relative mRNA-Quantifizierung des Targets zur Referenz wurde mit der 2-AACT-Methode [34] bestimmt.

2.9. Statistische Analyse

Quantitative Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. Statistische Analysen wurden mit SPSS Version 24 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) durchgeführt. Die statistischen Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden je nach Ergebnis des Normalitätstests mit dem Student's t-Test oder dem nichtparametrischen Test durchgeführt. Die Analysen für mehrere Gruppen mit Normalverteilung wurden mit einfacher ANOVA durchgeführt, und der Rest wurde mit nichtparametrischen Tests durchgeführt. Alle statistischen Daten und Methoden können in Tabelle S2 überprüft werden.

3. Ergebnisse

3.1. Veränderungen des Körpergewichts und der antibakteriellen Eigenschaften von Zebrafischen während des Fastens und Nachfütterns

Bei Zebrabärblingen wurde ein vollständiges kompensatorisches Wachstum realisiert. Nach 7 bis 14 Tagen Fasten verloren Zebrafische mindestens 15 Prozent ihres Körpergewichts. Nach 14 Tagen Wiederfütterung holte das Körpergewicht der Zebrafische in der Fastengruppe das der Kontrollgruppe ein (Abbildung 1A–C). Um die Resistenz von Zebrafischen gegen Krankheitserreger zu untersuchen, wurde ihnen nach dem Fasten und erneuten Füttern Streptococcus agalactiae intraperitoneal injiziert. Zebrafische in der Fastengruppe hatten im Vergleich zur Kontrollgruppe eine erhöhte Sterblichkeitsrate. Mit der Verlängerung der Nachfütterung ging die Sterblichkeitsrate weiter zurück (Abbildung 1D).

Abbildung 1. Das Modell des kompensatorischen Wachstums bei Zebrafischen. A bis C: die Körpergewichtsänderung von Zebrafischen während des Fastens und der Wiederaufnahme der Nahrungsaufnahme. (A) Die Zebrafische wurden 7 Tage lang fasten gelassen und 28 Tage lang erneut gefüttert. (B) Die Zebrafische wurden 14 Tage lang fasten gelassen und 21 Tage lang erneut gefüttert. (C) Die Zebrafische wurden 21 Tage lang fasten gelassen und 14 Tage lang erneut gefüttert. n=21–22. (D) Die Überlebensrate von Zebrafischen, denen S. agalactiae intraperitoneal injiziert wurde; F: Fütterung; S: Hunger; R: Rückfütterung. n=3, *: p < {{10}}.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

3.2. Morphologische Veränderungen der Nieren von Zebrafischen während des Fastens und Refeeding

DasNiereist das wichtigste Immungewebe im Zebrafisch. Hunger verursachte morphologische Veränderungen in derNieren. Nach 21 Tagen Fasten zeigte die Niere deutliche morphologische Veränderungen. Wir fanden heraus, dass nach 3 und 5 Tagen erneuter Nahrungsaufnahme mehr verletzte Tubuli mit hyalinen Tröpfchen auftraten. Diese Situation verbesserte sich nach 7 Tagen. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass die Anzahl der Melanomakrophagenzentren (MMCs) in derNierenach Hunger erhöht (Abbildung 2A–C). Zusammen mit der Rückfütterung wurde dieses Symptom gerettet. Die mRNA-Expression von havcr1 nahm nach dem Fasten zu (Abbildung 2D), was zeigt, dass Hungern dazu führen kannNiereVerletzung.

Abbildung 2. Morphologische Veränderungen in derNierenvon Zebrafischen während des Fastens und Nachfütterns. (A) HE-Färbung vonNierebei Zebrafischen während des Fastens und der Wiederfütterung. Schwarzes Dreieck kennzeichnet verletzte Tubuli. Der rote Pfeil kennzeichnet MMCs. Roter Stern bezeichnet hyaline Tröpfchen. (B) Statistische Analyse des Anteils verletzter Tubuli in derNiere. (C) Statistische Analyse von MMCs in Nieren. n=3–4. (D) Die mRNA-relative Expression des havcr1-Gens in derNierevon Zebrafischen während des Fastens und Nachfütterns. n {{0}}–10. F: Fütterung; S: Hunger; R: Rückfütterung. *: p <>

3.3. Oxidativer Stress wurde während des Fastens und Refeeding ausgelöst

Der MDA-Gehalt war nach 21- und 24-tägigem Fasten signifikant erhöht und nach 3-tägiger Nahrungsaufnahme wieder zurückgegangen (Abbildung 3A). Der ROS-Gehalt nahm jedoch nach 24 Tagen Hunger ab und erholte sich mit erneuter Fütterung für 7 Tage (Abbildung 3B). Der NO-Gehalt stieg nach 21-tägigem Fasten an (Abbildung 3C). Die Aktivität antioxidativer Enzyme, einschließlich SOD, GSH-Px und CAT, nahm nach dem Fasten zu. Die Aktivitäten von GSH-Px und CAT nahmen schnell ab und erholten sich am 3. Tag der erneuten Fütterung. Obwohl die Aktivität von SOD mit der erneuten Fütterung abnahm, war sie immer noch höher als die der Kontrolle (Fig. 4).

Abbildung 3. Oxidativer Stress in den Nieren von Zebrafischen während des Fastens und Nachfütterns. (A) Der Gehalt an MDA in der Niere. (B) Die Veränderung von ROS in der Niere. (C) Der Gehalt an NO in der Niere. F: Fütterung; S: Hunger; R: Rückfütterung. n=6–10. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

Abbildung 4. Die Aktivität von Enzymen in den antioxidativen Systemen in derNierenvon Zebrafischen während des Fastens und Nachfütterns. (A) Die Aktivität von SOD in der Niere. (B) Die Aktivität von GSH-Px in der Niere. (C) Die Aktivität von CAT in der Niere. F: Fütterung; S: Hunger; R: Rückfütterung. n=6–10. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

3.4. Das angeborene Immunsystem der Zebrafischniere wurde durch Fasten und Refeeding beeinflusst

Die Aktivität von ALP stieg in der Niere nach Fasten an und nahm nach erneuter Nahrungsaufnahme ab (Fig. 5A). Bei einer 7-tägigen Nachfütterung gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen der Nachfütterungsgruppe und der Kontrollgruppe. Die Aktivität von Lysozym in der Niere zeigte einen ähnlichen Trend wie ALP, das mit Fasten zunahm (Fig. 5B). Nach erneuter Fütterung ging es schnell zurück. Die respiratorische Burst-Reaktion in der Niere zeigte keine signifikanten Veränderungen in verschiedenen Gruppen, aber die Reaktion war höher in der Fasten- und Refeeding-Gruppe (Abbildung 5C). Die mRNA-Expression des entzündungsfördernden Zytokins il-1 zeigte einen bemerkenswerten Anstieg in allen Fastengruppen, nahm aber nach erneuter Nahrungsaufnahme sofort ab (Abbildung 6A). Die mRNA-Expression von tgfb1a und tgfb1b zeigte den gleichen Trend wie il-1 (Abbildung 6E,F). Die mRNA-Expression von nfkb1 stieg jedoch nur nach 24-tägiger Hungerphase merklich an und nahm nach 3-tägiger Wiederaufnahme ab. Die mRNA-Expression von nfkb2 zeigte einen ähnlichen Trend wie der von nfkb1 (Abbildung 6B, C). Das Gen arg2 kodiert für Arginase II, die mit der entzündungsfördernden Reaktion in Verbindung steht. Darüber hinaus nahm die mRNA-Expression von arg2 in allen Fastengruppen bemerkenswert zu und war nach erneuter Fütterung reduziert (Abbildung 6D). Nachdem die Zebrafische herausgefordert wurden, die gefastet und sich wieder gefüttert hatten, war die Reaktion in der Fastengruppe stärker. Die mRNA-Expression von il-1 und mmp9 war in der mit LPS behandelten Fastengruppe signifikant höher als in den mit LPS behandelten Kontroll- oder Nachfütterungsgruppen (Abbildung 7).

Abbildung 5. Die Parameter des angeborenen Immunsystems imNierenvon Zebrafischen während des Fastens und Nachfütterns. (A) ALP-Aktivität in der Niere von Zebrafischen während des Fastens und Nachfütterns. (B) Lysozym-Aktivität in derNierevon Zebrafischen während des Fastens und Nachfütterns. (C) Die respiratorische Burst-Reaktion der Niere bei Zebrafischen nach Fasten und Ernähren. (C1) Der Wert von Fluoreszenz/Protein der Niere zu verschiedenen Zeiten. (C2) Fluoreszenz-/Proteinwerte derNierebei 150 min. (C3) Normalisierung des Werts von Fluoreszenz/Protein der Niere bei 150 min. F: Fütterung; S: Hunger; R: Rückfütterung. n=12. *: p < 0,05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

Abbildung 6. Relative mRNA-Expression immunbezogener Gene in den Nieren von Zebrafischen während des Fastens und der Wiederaufnahme der Nahrungsaufnahme. (A–F):il-1 , nfkb1, nfkb2, arg2, tgfb1a und tgfb1b. F: Fütterung; S: Hunger; R: Rückfütterung. n=8–1{{10}}. *: p < 0,05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

Abbildung 7. Die mRNA-relative Expression von immunbezogenen Genen in derNierenvon Zebrafischen, die mit 5 ul von 20 ug/ml LPS nach Fasten und erneuter Fütterung herausgefordert wurden. (A–C) il-1 , mmp9 und nfkb1. F: Fütterung; S: Hunger; R: Rückfütterung. n=8–12. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

4. Diskussion

In der vorliegenden Studie fanden wir heraus, dass bei Zebrafischen nach unterschiedlich langen Hungerperioden ein vollständiger CG erreicht werden konnte. Auch nach 3 Wochen Fasten erreichte das Körpergewicht der Zebrafische nach zwei Wochen das der Kontrollgruppe. Dieses Ergebnis stimmte mit früheren Arbeiten überein [28]. Studien haben gezeigt, dass Hunger und Nachfütterung den Stoffwechselzustand von Zebrafischen beeinflussen [27,28]. Bei gezüchteten Arten besteht die Bedeutung von CG darin, dass es die Effizienz der Produktion verbessert. Es ist wichtig, dass gezüchtete Arten ihre antibakteriellen Eigenschaften während des Fastens und der Wiederaufnahme der Fütterung beibehalten. Während dieses Prozesses besteht die Gefahr, dass Zebrafische von Krankheitserregern befallen werden. Es wurde berichtet, dass Hunger die Immunantwort bei infiziertem Piaractus mesopotamicus nicht beeinflusste [18]. Leider förderte das Fasten die Anfälligkeit der Zebrafische für S. agalactiae. Gleichzeitig wurden biochemische Parameter und die mRNA-Expression des angeborenen Immunsystems durch Hunger beeinflusst.

Beim Zebrafisch fehlen Lymphknoten, und die Niere ist das primäre lymphatische Organ, das dem Knochenmark von Säugetieren entspricht [24]. Bei ausgewachsenen Zebrafischen ist die Niere der Hauptort der Hämatopoese [35]. Die Populationen im Nierenmark enthalten viele hämatopoetische Zelltypen, darunter Makrophagen, Neutrophile und Lymphozyten [36,37]. Die richtige Funktion der Niere ist wichtig für das angeborene Immunsystem von Zebrafischen. In der vorliegenden Studie beobachteten wir einige morphologische Veränderungen in den Nieren von Zebrafischen, die Hunger ausgesetzt waren. Die Ablagerung von MMCs in der Niere nahm nach Hungern signifikant zu. Es wurde zuvor festgestellt, dass Hunger zur Ablagerung von Melano-Makrophagen (MMs) in der Niere und Milz von Fischen führen kann [38]. MMCs treten hauptsächlich in Niere, Leber und Milz auf und sind in der Niere diffus und weniger strukturiert [39]. Es wird davon ausgegangen, dass MMCs sowohl bei der Immunabwehr als auch bei normalen, nichtimmunologischen, physiologischen Prozessen wirken. Die primäre Funktion von MMCs ist die Phagozytose. Es wird angenommen, dass MMCs sowohl an der angeborenen als auch an der adaptiven Immunantwort beteiligt sind. Die Zugabe von MMCs nach Hunger kann auf Hämophagozytose und Beseitigung von Zelltrümmern zurückzuführen sein. Außerdem wurde in den frühen Tagen der Wiederfütterung die Struktur hyaliner Tröpfchen beobachtet. Es wird angenommen, dass das Vorhandensein hyaliner Tröpfchen hauptsächlich auf alpha2u-Globulin in tubulären Epithelzellen hinweist [40]. Darüber hinaus produzierten neoplastische Histiozyten in einem Modell des histiozytischen Sarkoms Lysozym, und Lysozym akkumulierte in tubulären Epithelzellen [41]. Zusammenfassend erfolgt die Bildung hyaliner Tröpfchen, weil die Niere das Protein, das sich in tubulären Epithelzellen ansammelt, nicht verdauen kann. Der KIM-1-Spiegel (kodiert durch havcr1) kann auf die strukturelle Beschädigung der Tubuli hinweisen [42]. Nach dem Hungern nahm die mRNA-Expression von havcr1 deutlich zu und mit der Wiederaufnahme ab. Wir können vorhersagen, dass die Nierenfunktion durch das Fasten beeinträchtigt wird und sich die Nierenfunktion bei einer erneuten Nahrungsaufnahme erholt. Allerdings sind die Auflagen zu Beginn der Rückfütterung belastend.

Die Phagozytose ist ein wichtiger Abwehrprozess des angeborenen Immunsystems von Fischen. Oxidativer Stress begrenzt die Immunantwort [20]. Die Abwehr von Antioxidantien hängt hauptsächlich von Enzymen ab. SOD, GPx und Katalase sind wichtige Bestandteile antioxidativer Systeme [43]. SOD vermittelt die Umwandlung von Superoxidanion und H2O2. Katalase ist an der Entgiftung von H2O2 zu Wasser beteiligt. GPx katalysiert Hydroperoxide (z. B. H2O2 und Lipidhydroperoxide) zu H2O durch Oxidation von Glutathion (GSH) zu Glutathiondisulfid (GSSH) [43–45]. MDA ist eines der wichtigsten Lipidoxidationsprodukte und wird aus mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs) durch chemische und enzymkatalysierte Reaktionen hergestellt. ROS können PUFAs peroxidieren, um MDA zu erzeugen. Der MDA-Gehalt ist ein Biomarker, der häufig zur Beurteilung von oxidativem Stress verwendet wird [46]. In der vorliegenden Arbeit stieg der Gehalt an MDA in der Niere bemerkenswert an, obwohl der Gehalt an ROS abnahm, und die Aktivität aller Enzyme, die zum Antioxidanssystem gehören, war ebenfalls erhöht. Der Nachweis von ROS ist eine transiente Reaktion. Die Veränderung der Aktivität des antioxidativen Enzyms war das Ergebnis des Langzeitfastens. Die gegensätzlichen Trends zwischen ROS und antioxidativen Enzymen können darauf zurückzuführen sein, dass normale zelluläre Aktivitätsprozesse ROS produzieren, während längeres Hungern zu einer verminderten Zellaktivität führt. Dieses Ergebnis zeigte, dass Hunger auf chronische Weise oxidativen Stress in der Niere verursachte. Anhaltender oxidativer Stress kann Zellsubstanzen wie Lipide und Proteine ​​schädigen und schließlich zu Apoptose und der Akkumulation oxidierter Molekülaggregate führen [20]. Bei Knochenfischen wurde berichtet, dass Hunger den MDA-Gehalt in Leber und Darm induziert und die Aktivität antioxidativer Enzyme erhöht [47–49]. Diese Ergebnisse implizierten, dass das antioxidative System zwar aktiviert wurde, aber nicht ausreichte, um die durch den Hunger verursachten Schäden zu beseitigen. Unterdessen kann oxidativer Stress eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren wie NF-kB, Nrf2 und HIF-1a aktivieren. Anschließend induzieren diese Transkriptionsfaktoren die Expression vieler Zytokine und Chemokine. So kann oxidativer Stress zu chronischen Entzündungen führen [44].

Unter Belastung mit Streptococcus agalactiae erlitten die Zebrafische in der Fastengruppe eine höhere Sterblichkeit als die in der Kontrollgruppe. Unterdessen verbesserte sich die Aktivität von ALP und Lysozym mit Hungern. Lysozym ist ein wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems von Fischen und am Prozess der Phagozytose beteiligt [50]. Den Ergebnissen zufolge verursachte Hunger die mRNA-Expression von il-1 , nfkb1, tgfb1a, tgfb1b und arg2. Diese Veränderungen können durch oxidativen Stress verursacht werden. TGFB1 ist ein Zytokin, das sowohl entzündungsfördernde als auch entzündungshemmende Wirkungen hat [51]. Rekombinantes TGFB1 zeigte immunsuppressive Aktivität und regulierte die Expression von entzündungsfördernden Zytokinen in Leukozyten von Knochenfischen herunter. Bei Zebrafischen verursachte die Expression von tgfb1a eine Entzündung in der Leber [52]. Chronische tgfb1a-Induktion aktivierte Entzündungen, und ihre Expression induzierte Leberfibrose bei frühen hepatozellulären Karzinomen bei Zebrafischen. Arginase ist ein Urenzym und für die Umwandlung von L-Arginin in L-Ornithin und Harnstoff verantwortlich. Arginase hat zwei Isoenzyme (Arginase I und Arginase II) [53,54]. Arginase II ist ein immunbezogenes Gen und es wurde festgestellt, dass es über mitochondriale ROS mit entzündungsfördernden Reaktionen in Makrophagen in Verbindung steht. Diese Daten zeigten, dass Hungern eine Immunantwort in der Niere auslösen kann. Bei Mäusen verringerte Hunger die Empfindlichkeit gegenüber LPS und beeinflusste die Expression von il-1 nicht [55]. Mit LPS stimulierte Zebrafische zeigten jedoch eine grobe Reaktion auf LPS, und die Expression von il-1 und mmp9 war signifikant höher als in den anderen Gruppen. Im Gegensatz zu Mäusen wurden Zebrafische nach dem Hungern empfindlicher gegenüber LPS, so dass Hungern ihre Fähigkeit beeinträchtigen kann, Krankheitserreger zu beseitigen.

5. Schlussfolgerungen

In der vorliegenden Studie untersuchten wir vorläufig den Einfluss von Fasten und Nachfütterung auf das angeborene Immunsystem von Zebrafischen. Bei Zebrafischen wurde ein kompensatorisches Wachstum realisiert, begleitet von einer erhöhten Anfälligkeit für Krankheitserreger nach dem Hungern. Oxidativer Stress – verursacht durch Hunger und die mit Gefahren verbundenen molekularen Muster, die von verletzten Nierentubuli produziert werden – könnte zur Entzündung beigetragen haben. Weitere Studien sind erforderlich, um zu untersuchen, wie Hunger die Anfälligkeit erhöht und wie der Stoffwechselzustand verschiedene Arten von Immunzellen beeinflusst.

Ergänzende Materialien: Die folgenden sind online verfügbar unter https://www.mdpi.com/article/10.3390/biom11060825/s1, Tabelle S1: Liste der in dieser Studie verwendeten Primer; Tabelle S2: Das statistische Ergebnis des Experiments.

Autorenbeiträge: Konzeptualisierung, ZL und WL; Datenpflege, JJ; Formale Analyse, ZL und DL; Fördermittelakquise, WL; Untersuchung, ZL, DL, RC und YY; Methodik, ZL; Supervision, WL; Schreiben – Originalentwurf, ZL; Schreiben – Überprüfung & Bearbeitung, WL Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und sind damit einverstanden.

Finanzierung: Diese Arbeit wurde vom National Key R&D Program of China (2018YFD0900101), dem China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS-46) und dem Program for Chinese Outstanding Talents in Agricultural Science Research ({{3 }}) an Wensheng Li.

Erklärung des Institutional Review Board: Die Studie wurde gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt und vom Animal Care and Use Committee der Sun Yat-Sen University genehmigt.

Einwilligungserklärung: Nicht zutreffend.

Erklärung zur Datenverfügbarkeit: Nicht zutreffend.

Interessenkonflikte: Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.