Darmschutz durch Proanthocyanidine beinhaltet antioxidative und entzündungshemmende Wirkungen in Verbindung mit einer Verbesserung der Insulinsensitivität, der Lipid- und Glukosehomöostase Teil 2

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Tein-Expression unter Verwendung von Western Blot. Abbildung 6 zeigt, dass die Zugabe von Fe/Asc zu Caco-2/15-Zellen den Spiegel der beiden wichtigen Enzyme erhöhte, aber PACs ihre Fe/Asc-induzierte Hochregulierung ausgleichen.

Da die Insulin-Signaltransduktion die Prozesse der Lipogenese, FA-Oxidation und Glukoneogenese moduliert, war es wichtig, den Einfluss von Fe/Asc und PACs auf MAPKs und PI3K/Akt, die beiden wichtigsten Insulin-Signalwege, zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden Caco-2/15-Zellen vor den anderen Caco-2/15-Zellen mit Insulin vorinkubiert

Abbildung 6. Auswirkungen von PACs auf die Glucogenese in Caco-2/15-Zellen. Proanthocyanidine (PACs, 250 ug/ml) wurden dem apikalen Zellkompartiment für 24 h vor der Behandlung mit Fe/Asc (200 μM/2 mM) für 6 h bei 37 Grad zugesetzt. Die Proteinexpression von (A) G6Pase und (B) PEPCK wurde durch Western Blot bewertet.Cistanche-PulverDie Ergebnisse stellen die Mittelwerte ± SEM von 3 unabhängigen Experimenten dar, jeweils in dreifacher Ausführung. Ein repräsentativer Western Blot wird gezeigt, der ein Experiment in dreifacher Ausführung auf dem gleichen Gel und bei der gleichen Exposition veranschaulicht.*P<0.05 vs="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc="" treated="" cells.="">Cistanche-WurzelG6Pase-Glucose-6-phosphatase, PEPCK-Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase.

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Behandlungen, um den Signalweg zu aktivieren. Während Fe/Asc die p38-MAPK-Proteinexpression und das Phospho-p38-MAPK/p38-MAPK-Verhältnis erhöhten, verhinderten PACs diese Wirkungen (Abb. 7A-C). Während Fe/Asc die Proteinmasse von Phospho Akt (pAkt) und das Akt/Akt-Verhältnis senkte, zeigten PACs die Fähigkeit, ihr normales Niveau aufrechtzuerhalten. Ein ähnlicher Trend wurde für PI3K festgestellt (Abb. 7D-I). Daher unterstützen diese Beobachtungen die günstige Rolle von PACs bei der Insulinsignalisierung.

Diskussion

Polyphenole sind bekannt für ihre pleiotropen biologischen und medizinischen Wirkungen, was die Anziehungskraft vieler Wissenschaftler und der Lebensmittelindustrie auf diese faszinierenden, aus Pflanzen gewonnenen Naturprodukte erklärt. PACs heben sich aufgrund ihrer pharmakologischen und therapeutischen Wirkung auf chronische Erkrankungen von der Vielfalt und der hohen Anzahl an Polyphenolen ab2021. Trotz ihrer lobenswerten Eigenschaften bleibt noch viel über ihren Einfluss auf den Magen-Darm-Trakt unbekannt, der ausgedehnte verdauungsfördernde, immunologische, neuronale und metagenomische Netzwerke nutzt2.cistanche schlafenAus diesem Grund wurden in der vorliegenden Untersuchung Anstrengungen unternommen, um die Rolle von PACs bei intestinaler OxS, antioxidativer Abwehr, Entzündung, FA-Oxidation, Lipogenese und Glukoneogenese zu klären, während gleichzeitig versucht wurde, zugrunde liegende Mechanismen wie die Insulinsignalisierung aufzuklären und Status der Transkriptionsfaktoren.

Um die PAC-Effekte zu untersuchen, haben wir die Caco-2/15-Zelllinie verwendet, ein beliebtes Darmmodell, das vor allem von der wissenschaftlichen Gemeinschaft geschätzt wird2 und von der Food and Drug Administration für Aufnahme- und Transportprozesse4 anerkannt ist. Caco-2/15-Zellen differenzieren sich nicht nur spontan in funktionell und morphologisch ähnelnde menschliche Enterozyten3,25, sondern sie dienen auch der effizienten Erforschung von Darmabsorption und -wechselwirkungen, Ernährung, Toxikologie, Lebensmittelmikrobiologie, Bioverfügbarkeitstests und Screening von Arzneimitteldurchlässigkeit im Entdeckungsprogramm2²627. Wie in unseren früheren Berichten zu verschiedenen Themen28-3】 war die Caco-2/15-Zelllinie maßgeblich an der aktuellen Studie beteiligt, um das Potenzial von PACs zur Regulierung verschiedener Stoffwechselwege aufzudecken. Wichtig ist, dass in dieser Studie die Zellen auf porösen Filtern ausgesät wurden, die den Zugang zu beiden Seiten des bipolaren Darmepithels ermöglichten: apikale und basolaterale Kompartimente, die dem Darmlumen bzw. der serösen Zirkulation entsprechen. Zusätzlich haben wir Caco-2 vorinkubiert. /15-Zellen mit Fe/Asc, da dieses System in unserem Labor höchst relevant war, um starkes OxS und Entzündungen zu induzieren, die wiederum durch ein breites Spektrum an Effektoren herausgefordert wurden17, 1932-3 Bemerkenswert, Fe/Asc als starker Sauerstoff -radikalerzeugendes System verursacht oxidative Schäden an biologischen Makromolekülen, verändert die intrazelluläre Redoxumgebung und ist an zahlreichen pathologischen Zuständen beteiligt2.35,56 SOD2-Proteinexpression).cistanche tubulosa vorteileDarüber hinaus fördert der Fe/Asc-Komplex aufgrund seiner Fähigkeit, Lipidperoxide zu erzeugen, Entzündungen, wie durch die erhöhte Expression von TNFa, COX2 und NF-is belegt wird. Insgesamt validieren die vorliegenden Ergebnisse die Bildung von Radikalen und Entzündungen als Reaktion auf Fe/Asc

Das Vorhandensein von PACs wirkte der Fe/Asc-vermittelten Lipidperoxidation entgegen. Da das Versagen der antioxidativen Abwehr die Induktion von OCS erklären könnte, untersuchten wir seine Wirkung auf endogene antioxidative Enzyme. Tatsächlich waren PACs in der Lage, den durch Fe/Asc vermittelten Rückgang von SOD2 und GPx wiederherzustellen. Um den Mechanismus für die Verschlimmerung von OxS durch Fe/Asc und die Linderung durch PACs zu beschreiben, untersuchten wir den Signalweg Keap1-NRF2-antioxidant response element (ARE), der als das stärkste endogene Antioxidans gilt Regler37.Cistanche-TeeNRF2 ist ein zellulärer OCS-Sensor, dessen Funktion darin besteht, die Redox-Homöostase aufrechtzuerhalten. Unter normalen Bedingungen. NRF2 wird kontinuierlich ubiquitiniert und durch seinen negativ gebundenen Regulator Keap18 zum proteasomalen Abbau bestimmt. In Anwesenheit von endogenen und exogenen Effektoren wird Keapl inaktiviert und herunterreguliert, wodurch die Keapl-NRF2-Interaktion gestört wird und NRF2 freigesetzt wird, das zum Zellkern transloziert und an die Promotoren bindet

Abbildung 7. Auswirkungen von PACs auf die Insulinsensitivität in der Caco-2/15-Zelllinie. Proanthocyanidine (PACs, 250 ug/ml) wurden dem apikalen Zellkompartiment für 24 h vor der Behandlung mit Fe/Asc (200 μM/2 mM) für 6 h bei 37 Grad zugesetzt. Zwei Stunden vor dem Ende der 6-stündigen Inkubation mit der Fe/Asc-Mischung wurde Insulin (100 nM) zugegeben, um die Insulinsensitivität zu bewerten. Die Proteinexpression von (A) p38-MAPK, (B) Phosphor p38-MAPK, (D)Akt, (E)Phospho Akt, (G) PI3k und (H) Phospho PI3k war durch Western Blot ausgewertet. Die Verhältnisse (C) Phospho p38-MAPK/p38-MAPK, (F)Phospho Akt/Akt und (Dphospho PI3k/PI3k) wurden dann berechnet. Die Ergebnisse stellen die Mittelwerte ± SEM von 3 unabhängigen Experimenten dar jeweils in zweifacher Ausfertigung Ein repräsentativer Western Blot ist gezeigt, der ein Experiment in dreifacher Ausführung auf dem gleichen Gel und mit der gleichen Exposition veranschaulicht.*S<0.05 vs+/-insulin="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc+/-insulin-treated="" cells.p38-mapkp38-mitogen-activated="" protein="" kinase,="" pi3k="" phosphoinositide="" 3-kinase,="" akt="" protein="" kinase="">

ARE und beschleunigt die Transkription antioxidativer Enzyme39. Unseren Daten zufolge unterdrückte die Behandlung von Caco-2/15-Zellen mit PACs Keapl und ermöglichte wahrscheinlich NRF2, in den Kern zu translozieren, was die Bindung an ARE (Kernsequenz: 5'TGACnnnGC3') in der Promotorregion von Antioxidansgenen ermöglichte (SOD2 und GPx), was zu einer Stimulierung ihrer Transkription und einer koordinierten Hochregulierung führt. In Übereinstimmung mit diesen Daten verhinderte die phenolische Resveratrol-Verbindung OxS in mit H, O behandelten Fibroblasten-ähnlichen Synoviozyten der rheumatoiden Arthritis, indem sie die Expression von NRF2 förderte und die Expression von Keap12 verringerte. Darüber hinaus kann laut Kanzaki et al. die Aktivierung antioxidativer und zytoprotektiver Enzyme mit dem NRF2/Keapl-Verhältnis in Verbindung gebracht werden1.

Wie von der Besserung von OCS erwartet, senkten PACs die Entzündung signifikant, wie durch die Herunterregulierung von TNFa und COX2 belegt wurde. Da NF-KB ein Schlüsselregulator proinflammatorischer Zytokine ist, haben wir seine Reaktion auf PACs untersucht. Entsprechend dem Trend bei Entzündungsmitteln hoben PACs die Fe/Asc-vermittelte NF-KB-Induktion auf und reduzierten das NF-KB/IikB-Verhältnis. Daher können wir vernünftigerweise davon ausgehen, dass PACs über die Kontrolle von NF-kB, dem Hauptregulator der Entzündungsreaktion, zum Schutz vor Entzündungen beitragen, die die Darmzellfunktionen gefährden. Es ist erwähnenswert, dass PACs vor Entzündungen schützen können, indem sie die antioxidativen Abwehrmechanismen der Zellen stimulieren, da eine enge Beziehung zwischen Biomarkern des Redox-Ungleichgewichts und Entzündungen besteht2.

Die vorliegende Studie zielte darauf ab, die Auswirkungen von Pac auf die intestinale Lipidhomöostase zu untersuchen. Unsere interessanten Ergebnisse zeigten, dass PACs einerseits CPTla hochregulierten und FAS herunterregulierten, die die Biomarker der FA-Oxidation bzw. Lipogenese darstellen. Daher sind diese Enzyme potenzielle Ziele von PACs, was auf das polyphenolische Potenzial hindeutet, eine Lipidakkumulation zu verhindern, die in vielen Geweben als pathologische Manifestation einer OxSand-Entzündung angesehen wird*3. Die molekularen Mechanismen hängen wahrscheinlich mit der Hochregulierung von PPARa und der Herunterregulierung von SREBPlc zusammen, zwei Transkriptionsfaktoren, die den Lipidstoffwechsel regulieren. FAS ist das zentrale Enzym in der Lipogenese, verantwortlich für die Katalyse der Umwandlung von Malonyl-CoA in FAs45. ACC katalysiert seinerseits die Bildung von Malonyl-CoA, einem essentiellen Substrat für FAS. In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen wurde auch festgestellt, dass Solanum nigrum-Polyphenole FAS und SREBPs verringern, während sie CPTla und PPARa in mit Ölsäure behandelten Hepatozyten erhöhen“6.

Die Wirkungsmechanismen von Polyphenolen sind im Allgemeinen mit der Aktivierung der AMPKa-Phosphorylierung verbunden7. Wichtig ist, dass phosphoryliertes AMPKa in unserer Studie durch Fe/Asc gesenkt, aber durch PACs stimuliert wurde, was die Herunterregulierung von Phospho-ACC erklärt, was zu einer gehemmten Lipogenese und einem erhöhten Energiestoffwechsel führt. Allerdings wurde die Proteinexpression von AMPKa durch Fe/Asc-induziertes OxS in Caco2/15-Zellen erhöht. Dementsprechend können ROS und OxS AMPKa über verschiedene vorgeschaltete Kinasen induzieren8.

OCS und Entzündungen induzieren stark Insulinresistenz und zusätzliche Stoffwechselstörungen9,50, was uns dazu veranlasste, die Fähigkeit von Pac zur Regulierung einiger Schlüsselproteine ​​in Bezug auf den Insulinsignalweg zu bewerten. Wir konzentrierten uns zunächst auf p38-MAPK, dessen Expression durch OxS hochreguliert wurde, während es die Insulinrezeptor-Signalkaskade störte. Sowohl die Analyse der p38-MAPK-Phosphorylierung als auch die Berechnung des Phospho-p38-MAPK/p38-MAPK-Verhältnisses ergab eine signifikante Steigerung der Reaktion auf Fe/Asc, was mit einer beeinträchtigten IS in Caco{ kompatibel ist. {6}}/15 Zellen. Die Validierung wurde durch den Rückgang von pAkt und PI3K erreicht. Im Gegensatz dazu kehrten PACs den Trend um, da sie die Fähigkeit zeigten, die p38-MAPK-Phosphorylierung und das Phospho-p38-MAPK/p38-MAPK-Verhältnis zu verringern und gleichzeitig den PI3K/Akt-Signalweg zu verbessern. von dem bekannt ist, dass es die wichtigsten biologischen Wirkungen von Insulin vermittelt, indem es den Glukosetransport, die Proteinsynthese, die Zellproliferation, das Zellüberleben und die Glukoneogenese reguliert. Die Beeinträchtigung des IS aufgrund von OxS und chronischer Entzündung kann auch den Glukoneogeneseprozess beeinflussen3,54. Die Analyse der beiden Hauptenzyme, die an der De-novo-Glukosesynthese beteiligt sind (PEPCK, G6Pase), zeigte eine signifikante Zunahme der Reaktion auf Fe/Asc, während die Verabreichung von PACs sie in Caco2/15-Zellen wieder auf normale Werte brachte.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass zahlreiche Studien in der wissenschaftlichen Literatur signifikante gesundheitliche Auswirkungen von Phenolverbindungen entweder als spezifisches Phenolmolekül oder als Mischung mehrerer Polyphenole durch indirekten Nachweis zeigen. Die vorliegende Arbeit weist auf die entscheidende Wirkung von PACs (komplexen Flavanolen) bei der intestinalen Homöostase hin, indem sie OxS, Entzündungen und damit verbundene Stoffwechselstörungen verhindern. Da PACs möglicherweise nicht vollständig vom Dünndarm absorbiert werden, sind weitere Studien erforderlich, um die Mechanismen zu untersuchen, die an ihren positiven Auswirkungen auf die Gesundheit im Dünndarm beteiligt sind.

Material und Methoden

Intestinale Caco-2/15-Zellkultur und Behandlung. Für alle Experimente verwendeten wir die humane epitheliale kolorektale Adenokarzinom-Zelllinie Caco-2/15, einen stabilen Klon der Eltern-Caco-2-Zellen (American Type Culture Collection, Rockville, Md., USA), das von Dr. JF Beaulieu (Abteilung für Zellbiologie, Medizinische Fakultät, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Kanada) erhalten wurde. Die Caco-2/15-Zelllinie hat die einzigartige Eigenschaft, sich in vitro in polarisierte reife Enterozyten zu differenzieren und einen undurchlässigen Mon-over zu bilden. Caco-2/15-Zellen wurden wie zuvor beschrieben323455 kultiviert und für die Untersuchung der Zellintegrität, OCS und Entzündung17,19 und IS56 verwendet.

Proteinexpressionsanalyse durch Immunoblotting. Nach der Inkubation mit verschiedenen Behandlungen wurden Caco-2/15-Zellen in eiskaltem Puffer lysiert, der 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM Na2E-DTA, 1 mM EGTA, 1 % NP enthielt -40, 1 % Desoxycholat, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Na2VO4, 1 ug/ml Leupeptin und 1 mM PMSF. Die Proteinkonzentration jeder Probe wurde unter Verwendung des Bradford-Verfahrens (Bio-Rad) bestimmt. Die Proteine ​​wurden dann für 5 min in einem Probenpuffer denaturiert, der SDS und ß-Mercaptoethanol enthielt. Homogenate, die insgesamt 15 ug Proteine ​​enthielten, wurden auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel gemäß den Proteinmolekulargewichten aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembranen elektrogeblottet. Fettfreie Milch wurde verwendet, um unspezifische Stellen der Membranen zu blockieren, bevor primäre Antikörper über Nacht bei 4 Grad zugegeben wurden. Die Verdünnung von Antikörpern wird in den ergänzenden Informationen und in unserer jüngsten Veröffentlichung beschrieben. Reaktive Banden wurden unter Verwendung eines ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad) erfasst. Alle Daten sind als das Verhältnis des Zielproteins zu -Actin in derselben Probe ausgedrückt.

Statistische Analyse. Alle Werte sind als Mittelwert ± SEM von mindestens drei verschiedenen Experimenten ausgedrückt, die in dreifacher Ausführung durchgeführt wurden. Die Daten wurden durch einfache ANOVA analysiert, gefolgt von Mehrfachvergleichstests nach Tukey unter Verwendung von PRISM 7. 0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Unterschiede wurden bei P als signifikant angesehen<>

Dieser Artikel ist aus Scientific Reports|extrahiert (2021) 11:3878|https://doi.org/10.1038/s41598-020-80587-5