Aus Ishige Okamurae isoliertes Ishophloroglucin A unterdrückt die durch -MSH induzierte Melanogenese: In Vitro und In Vivo Teil 1

Abstrakt:Aus Ishige Okamura (IO) isoliertes Diphlorethohydroxycarmalol (DPHC) zeigte potenzielle Aufhellungseffekte gegen UV-B-Strahlung. Die Bestandteile von IO und ihr molekularer Mechanismus gegen -Melanozyten-stimulierendes Hormon ( -MSH) wurden jedoch noch nicht untersucht. Daher zielte diese Studie darauf ab, die hemmenden Wirkungen von Ishophloroglucin A (IPA), einem aus Braunalgen-IO isolierten Phlorotannin, und seinem Rohextrakt (IOE) auf die Melanogenese in vivo in einem -MSH-induzierten Zebrafischmodell und in B16F10-Melanomzellen zu untersuchen in-vitro. Molekulare Docking-Studien der Phlorotannine wurden durchgeführt, um ihre inhibitorischen Wirkungen zu bestimmen und ihren Interaktionsmodus mit Tyrosinase, einem mit der Melanogenese verwandten Glykoprotein, aufzuklären. Darüber hinaus nahmen morphologische Veränderungen und der Melaningehalt im -MSH-induzierten Zebrafischmodell nach IPA- und IOE-Behandlung ab. Darüber hinaus zeigte Western Blotting, dass IPA die extrazelluläre Proteinexpression in -MSH-stimulierten B16F10-Zellen hochregulierte. Daher legen diese Ergebnisse nahe, dass aus IOE isoliertes IPA das Potenzial zur Verwendung in der pharmazeutischen und kosmetischen Industrie hat.

Entsprechenden Studien zufolgeZistancheist ein weit verbreitetes Kraut, das als "Wunderkraut, das das Leben verlängert" bekannt ist. Sein Hauptbestandteil istCistanosid, die verschiedene Effekte hat, wie zAntioxidans, entzündungshemmend und Förderung der Immunfunktion. Der Mechanismus zwischen Cistanche und Hautaufhellung liegt in der antioxidativen Wirkung von Cistanche-Glykosiden.Melaninin der menschlichen Haut entsteht durch die durch Tyrosinase katalysierte Oxidation von Tyrosin. Die Oxidationsreaktion erfordert die Beteiligung von Sauerstoff, daher werden die sauerstofffreien Radikale im Körper zu einem wichtigen Faktor, der die Melaninproduktion beeinflusst. Cistanche enthält Cistanosid, das ein Antioxidans ist und somit die Bildung freier Radikale im Körper reduzieren kannHemmung der Melaninproduktion.

1. Einleitung

Meeresalgen haben immense Aufmerksamkeit in der funktionellen Lebensmittel-, Kosmetik- und Pharmaindustrie auf sich gezogen, da sie bioaktive Verbindungen wie Phlorotannine, Fucoidane, Polysaccharide und Proteine ​​verwenden [1–7]. Gemäß einer früheren Studie wurde Ishige Okamurae (IO) auf seine hemmende Wirkung auf die Tyrosinaseaktivität untersucht [8]. Obwohl sein Phlorotannin, Diphlorethohydroxycarmalol (DPHC), in einem In-vitro-Modell auf durch UV-B-Strahlung induzierte Anti-Melanogenese-Aktivität untersucht wurde [8], wurden keine weiteren Studien durchgeführt, um die Wechselwirkung zwischen DPHC und Melanogenese-verwandten Proteinen zu erklären. In dieser Studie wurde eine neuartige Polyphenolverbindung, Ishophloroglucin A (IPA) [9], in einer molekularen Docking-Studie auf ihre Wechselwirkung mit Tyrosinase im Vergleich zu der von DPHC untersucht.

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Molekulares Docking ist eine effiziente Computermethode zur Vorhersage des potenziellen Bindungsmodus kleiner Moleküle oder Liganden innerhalb des aktiven Zentrums eines Proteins oder Rezeptors mit bekannter dreidimensionaler Struktur zur Untersuchung ihrer Wechselwirkungsmuster oder für das Arzneimitteldesign [10–12]. Frühere Studien haben über die Interaktionsstelle und den Energiewert des Tyrosinase-Enzyms berichtet, wie sie durch molekulare Docking-Studien untersucht wurden [13,14]. Funktionell ist Tyrosinase ein geschwindigkeitsbegrenzendes Enzym, das eine relativ langsame Reaktionsgeschwindigkeit im Signalweg katalysiert und eine zentrale Rolle bei der Melaninbiosynthese in spezialisierten Organellen, sogenannten Melanosomen, spielt, die speziell von melanozytären Zellen synthetisiert werden [15]. Daher war die enzymatische Aktivität von Tyrosinase, wie sie durch In-Silico-Molekular-Docking-Simulationen modelliert wurde, das Ziel für die Untersuchung von Inhibitoren zur Verhinderung von hyperpigmentierten Hauterkrankungen. Basierend darauf wurden auf experimentellen und rechnerischen Gebieten viele phenolische Verbindungen oder Inhibitoren, die Metallchelatbildungsfähigkeiten besitzen, umfassend als Tyrosinase-Inhibitoren untersucht [16].

Melanin moduliert hauptsächlich die Hautfarbe und wirkt als Schutzpigment, wenn die Haut UV-Strahlung ausgesetzt ist [17]. Die Exposition gegenüber UV-Strahlung bewirkt die Freisetzung von -Melanozyten-stimulierendem Hormon ( -MSH) aus kutanen Keratinozyten und Melanozyten, um die Melaninsynthese zu induzieren und die Haut anschließend vor den schädlichen Auswirkungen der Sonnenstrahlung zu schützen [18]. Eine langfristige Exposition gegenüber UV-Strahlung induziert jedoch eine signifikante Melaninsynthese durch -MSH, was zu Hautschäden wie Sommersprossen, Sonnenflecken und schwarzen Flecken auf der Epidermis führt, was zu DNA-Lichtschäden und Hautkrebs führt [19]. Anschließend wurde die Verabreichung von -MSH in Melanozyten umfassend untersucht, um beträchtliche Veränderungen in der Tyrosinaseaktivität für die Melanogenese bei Melanomen zu induzieren [20].

Zebrafische zeigen Variationen in der Hautfarbe wie Menschen. Sie sind ein Tiermodell, das zum Verständnis des genetischen Ursprungs der menschlichen Hautfarbe verwendet wird und die grundlegende Biologie des Modellorganismus mit der Humangenetik verbindet [21]. Darüber hinaus ermöglichen die Pigmente in den ventralen und lateralen Regionen der Zebrafisch-Gastrula und ihre Transparenz während der Larvenstadien eine einfache Beobachtung des Pigmentierungsprozesses und bieten die Möglichkeit, tragfähige Modelle zum Verständnis von Hautzellstörungen zu entwickeln, die aus Defekten in der Melanozytenentwicklung resultieren [22– 24].

Die Melaninsynthese erfolgt über die Aktivität mehrerer mit der Melanogenese verwandter Proteine, wie z. {6}} (Trp-1) [15]. In dieser Studie wollten wir die hemmende Wirkung von IPA und IO-Rohextrakt (IOE) auf die Tyrosinaseaktivität und Melanogenese auf -MSH-induzierte Zebrafisch-in-vivo- und B16F10-Melanomzellen in vitro untersuchen, um ihre mögliche Verwendung bei der Behandlung von Hautpigmentierung und Melanom zu bewerten .

2. Ergebnisse

2.1. Molekulare Docking-Studie

Eine Docking-Methode wurde durchgeführt, um die Bindung des kommerziellen Tyrosinase-Enzyms mit IPA, DPHC und Arbutin zu simulieren [25]. Die Bindungsmodi von IPA, DPHC oder Arbutin mit Pilztyrosinase sind in Abbildung 1A–Cdargestellt. Wie im 3D-Diagramm des Tyrosinase-IPA-Komplexes (Abbildung 1A), Tyrosinase-DPHC (Abbildung 1B) und Tyrosinase-Arbutin (Abbildung 1C) gezeigt, obwohl IPA, DPHC und Arbutin an das aktive Zentrum andockten, die Tyrosinase- Der IPA-Komplex zeigte die größte Bindungsoberfläche. Darüber hinaus zeigte der Tyrosinase-IPA-Komplex, wie in einem 2D-Diagramm gezeigt, mehr Wechselwirkungen mit den verschiedenen Aminosäuren der Tyrosinase als entweder Tyrosinase-DPHC oder Tyrosinase-Arbutin. Sieben Benzolringe (1., 2., 3., 8., 9., 12. und 16.) und ihre Sauerstoffatome haben π-π-Wechselwirkungen mit Histidin60, Methionin61, Lysin157, Glutamat158, Prolin160, Prolin201, Arginin206 und Valin218 . Insbesondere der 16. Benzolring wurde mit Histidin60 und Histidin204, den Hauptaminosäuren des aktiven Zentrums, kombiniert. Darüber hinaus interagierten viele Sauerstoffatome in IPA über Wasserstoffbrückenbindungen mit Glutamat158, Prolin160, Aspartat167, Methionin184, Phenylalanin197, Asparagin199, Glutamin202, Asparagin205 und Arginin209. Darüber hinaus wurde basierend auf den Ergebnissen der Docking-Analyse berechnet, dass die Gesamtbindungsenergie und die CDOCKER-Wechselwirkungsenergie unter Verwendung des CDOCKER-Interaktionsenergieprogramms von DS 3.0 ( 1D ) wie folgt waren: Wechselwirkungsenergie mit Tyrosinase: Ishophloroglucin A (IPA): – 152,154 kcal/mol, Diphlorethohydroxycarmalol (DPHC): –65,5221 kcal/mol und Arbutin: –33,6835 kcal/mol und die Bindungsenergie mit Tyrosinase: Ishophloroglucin A (IPA): –546,504 kcal/mol, Diphlorethohydroxycarmalol (DPHC): –407,706 kcal /mol und Arbutin: −79,0913 kcal/mol.

2.2. Auswirkungen melanogener Inhibitoren auf die Melaninsynthese in Zebrafischlarven

Der Zweck dieser Studie war zu bestimmen, ob IPA und IOE die Melanogenese in Zebrafischlarven in vivo hemmen können. In unserer vorherigen Studie zeigten IPA und IOE keine Toxizität bei Zebrafischlarven [26]. Wir behandelten Zebrafischlarven mit Zebrafisch (0.05, 0.15 und 0.5 nM) und IOE (3, 10 und 30 µg/ml ), um ihren Melaningehalt zu bestimmen. Um die inhibitorischen Aktivitäten abzuschätzen, haben wir den Gesamtmelaningehalt der Zebrafischextrakte gemessen. Die phänotypische Wirkung auf Zebrafisch-Melanin wurde beobachtet, indem ihre Körperpigmentierung unter einem Mikroskop bei Raumtemperatur analysiert wurde. Das Oberflächenmelanin wurde durch verschiedene Konzentrationen der Zielinhibitoren signifikant reduziert (Abbildung 2). Die Behandlung mit 3 nM -MSH erhöhte den Melaningehalt von Zebrafischen im Vergleich zur unbehandelten Gruppe signifikant. Die höchsten Konzentrationen von IPA (0,5 nM) und IOE (30 µg/ml) verringerten den Gesamtmelaningehalt um fast 28,56 Prozent bzw. 30,36 Prozent, was ähnliche Wirkungen zeigte wie die mit Arbutin (200 µM) behandelte Gruppe (Abbildung 2A, B).

2.3. Wirkungen von IPA und IOE auf die Melaninsynthese in B16F10-Zellen

Die zytotoxischen Wirkungen von IPA und IOE auf B16F10-Zellen wurden über die MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,{{ 7}}Diphenyltetrazoliumbromid)-Assay. Wir untersuchten zunächst die zytotoxischen Wirkungen von IPA und IOE auf B16F10-Zellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen ohne -MSH-Stimulation behandelt wurden. IPA (0,15, 0,5, 1,5 und 5 nM) zeigte keine signifikante Zytotoxizität auf B16F10-Zellen, während IOE (1, 3, 10 und 30 µg/ml) keine Zytotoxizität zeigte (Abbildung 3A, B). Die Konzentrationen von IPA und IOE ohne Toxizität wurden für weitere Untersuchungen verwendet.

Wir untersuchten, ob die Wirkung der Melaninhemmung von entweder IPA- oder IOE-Behandlung in vivo ohne -MSH-Stimulation in B16F10-Zellen reversibel war. Der Melaningehalt war bei Behandlung mit IPA (5 nM) oder IOE (30 µg/ml) im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant verringert (Abbildung 3C, D). Diese Ergebnisse legten nahe, dass IPA und IOE die Melaninsynthese ohne -MSH-Stimulation in B16F10-Zellen hemmten und somit zu ihrer Anti-Melanogenese-Wirkung beitrugen.

2.4. Wirkungen von IPA und IOE auf Tyrosinaseaktivität und Melaninsynthese in -MSH-stimulierten B16F10-Zellen

Daher wurden Dosen von IPA (0,5, 1,5 und 5 nM) und IOE (3, 10 und 30 µg/ml) mit B16F10-Melanomzellen inkubiert, um ihre Bioaktivität in zellulärer Tyrosinaseaktivität und -MSH zu bestimmen -vermittelte Melanogenese.

Die Konzentrationen von -MSH und Arbutin wurden basierend auf den Ergebnissen ihrer Zytotoxizität und Melaninproduktion in B16F10-Zellen bestimmt (Abbildung S2A–D). Durch Analyse der Daten zur Überlebensrate wurden 1 nM -MSH und 100 &mgr;M Arbutin für weitere Experimente verwendet.

Was die zelluläre Tyrosinase-Aktivität betrifft, so unterschied sich die Konzentration fast 10-mal, obwohl die inhibitorischen Wirkungen von 1,5 nM IPA relativ geringer waren als die in der positiven Kontrolle dargestellten, wobei die höhere Arbutin-Konzentration bei 100 uM lag (Abbildung 4A). IOE reduzierte die Tyrosinase-Aktivität mit einer leichten Schwankung zwischen den Wirkungen unterschiedlicher Konzentrationen im Vergleich zu der mit -MSH behandelten Gruppe (Fig. 4B). Bezüglich der -MSH-vermittelten Melanogenese wurden signifikante Verringerungen des Melaningehalts in den mit 1,5 und 5 nM IPA behandelten Gruppen beobachtet (Fig. 4C). Darüber hinaus hemmten 30 µg/ml IOE die Pigmentierung bis zu einem Punkt, der der Blindgruppe ähnelte (Abbildung 4D). Diese Ergebnisse legen nahe, dass IPA und IOE die Tyrosinase-Aktivität herunterregulieren und dass diese inhibitorische Wirkung zu einer verringerten zellulären Melaninsynthese in B16F10-Zellen führen kann.

2.5. Wirkungen von IPA und IOE auf den molekularen Mechanismus in -MSH-stimulierten B16F10-Zellen

Um den Mechanismus aufzuklären, der für ihre hemmende Wirkung auf die Melanogenese verantwortlich ist, bestimmten wir den Einfluss von IPA und IOE auf die Expressionsniveaus von Signalmolekülen, die an der Melaninsynthese beteiligt sind (Abbildung 5). ERK (extrazelluläre signalregulierte Kinase), JNK (Jun N-terminale Kinase) und p38 gehören zur intrazellulären Signaltransduktionskaskade der mitogenaktivierten Proteinkinase (MAPK) [27,28]. Wie in Abbildung 5A, B dargestellt, wurde die ERK-Phosphorylierung durch die IPA-Behandlung verstärkt, während die Phosphorylierung von JNK nach der Behandlung mit IPA (1,5 und 5 nM) oder IOE (30 µg/ml) leicht verringert wurde. Darüber hinaus waren, wie in Abbildung 5C dargestellt, die p-p38-Spiegel in den -MSH-stimulierten Gruppen stark erhöht, um etwa 80 Prozent im Vergleich zur Kontrolle. Darüber hinaus wurde nach Behandlung mit IPA, IOE oder Arbutin die Phosphorylierung von p38 leicht unterdrückt. Diese Befunde legen nahe, dass die melanogenen Hemmwirkungen von IPA und IOE mit den JNK- und p38-MAPK-Signalwegen zusammenhängen könnten.

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