Lactobacillus Plantarum GKM3 fördert Langlebigkeit, Gedächtniserhaltung und reduziert Oxidationsstress im Gehirn bei SAMP8-Mäusen Teil 1

Abstrakt: (1) Hintergrund: Ein altersbedingter kognitiver Rückgang beeinträchtigt häufig das Leben älterer Menschen und führt zu Symptomen, die mit fortschreitenden Beeinträchtigungen des Gedächtnisses und des Lernens einhergehen. Es wurde vorgeschlagen, dass Probiotika altersbedingte neurologische Störungen über die Darm-Hirn-Achse modulieren könnten. (2) Methoden: Um die Anti-Aging-Wirkung des probiotischen Lactobacillus plantarum GKM3 zu untersuchen, wurden sowohl Überlebenstests als auch kognitive Experimente im SAMP8-Mäusemodell durchgeführt. Die sechs Monate alten SAMP8 (n{{10}} bei jedem Geschlecht) wurden bis zu ihrem natürlichen Tod mit probiotischem GKM3 in einer Dosierung von 5,1 × 109 und 1,0 × 109 KBE/kg KG/Tag gefüttert. Anschließend wurde die Lebensdauer untersucht. Drei Monate alten SAMP8 (n=10 bei jedem Geschlecht) wurde 14 Wochen lang GKM3 verabreicht. Anschließend wurden die Verhaltenstests und Oxidationsparameter aufgezeichnet. (3) Ergebnisse: GKM3-Gruppen zeigten eine deutlich erhöhte Latenz im passiven Vermeidungstest und die Zeit der erfolgreichen Vermeidung im aktiven Vermeidungstest. Die TBARS und 8-OHdG aus Mäusegehirnen zeigten ebenfalls eine signifikante Verringerung in den mit GKM3 behandelten Gruppen. Darüber hinaus wurde in den Gehirnen von SAMP8-Mäusen mit der Ergänzung von GKM3 eine geringere Anreicherung des Amyloid-Proteins festgestellt. (4) Schlussfolgerungen: Diese Ergebnisse zeigten, dass L. plantarum GKM3 den Alterungsprozess verzögerte, altersbedingte kognitive Beeinträchtigungen linderte und oxidativen Stress reduzierte.

Klicken Sie auf Cistanche Tubulosa Supplement

【Für weitere Informationen:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Schlüsselwörter: seneszenzbeschleunigte Maus, anfällig für 8 (SAMP8); Probiotika; 8-hydroxy-20 -desoxyguanosin (8-OHdG); Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS); Amyloid- (A); Altern

1. Einleitung

Es stellt ein Problem dar, dass kognitive Beeinträchtigungen in der Bevölkerung aufgrund des Anstiegs der Zahl älterer Menschen im letzten Jahrzehnt zugenommen haben [1]. Laut dem Bericht der Weltgesundheitsorganisation (WHO) wird die Zahl der Menschen mit kognitivem Rückgang, die 2015 bei über 46,8 Millionen lag, im Jahr 2030 auf über 74,7 Millionen ansteigen, was einer fast halbierten Steigerung innerhalb von fünfzehn Jahren entspricht [2] . Es wird allgemein angenommen, dass Alterung, die in starkem Zusammenhang mit kognitiven Beeinträchtigungen steht, mit oxidativem Stress verbunden ist, der an der Ansammlung freier Radikale beteiligt ist und viele physiologische Funktionsstörungen, insbesondere im Gehirn, einem sauerstoffempfindlichen Organ, fördert, die zu degenerativen Erkrankungen führen Symptome wie Gedächtnisverlust und Rückgang der Lernfähigkeit [3–5].

Da das Altern unvermeidlich ist und die relativen negativen Symptome kompliziert sind, wenden Menschen Anti-Aging-Behandlungen an, die von Diättherapien bis hin zu mehr als medikamentösen Behandlungen reichen [6,7]. Beispielsweise zeigte der Wurzelextrakt von Ginseng (Panax quinquefolius) eine verbesserte kognitive Funktion und wurde von Koreanern als Favorit markiert [8]. Ginkgo biloba-Extrakt, ein weiteres Beispiel, wurde von den Japanern wegen seiner Funktionen bei der kognitiven Verbesserung und Oxidationsreduktion geliebt [9]. Obwohl in vielen Berichten darauf hingewiesen wird, dass pflanzliche Ernährung eine antioxidative Wirkung hat und den Alterungsprozess verlangsamt, gibt es interessantere Schwerpunkte auf der Darmmikrobiota oder sogar auf einer Gruppe spezifischer Bakterien im Darm, die diese Nutrazeutika verstoffwechseln und für eine positive Multimodulation sorgen könnten Auswirkungen auf den Wirt, einschließlich Langlebigkeit [10–14]. Darmbakterien könnten aus der Nahrung kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) wie Acetat, Propionat oder Butyrat produzieren [15]. Kinder, die pflanzliche enterale Ernährung zu sich nahmen, zeigten in ihren Stuhlproben höhere SCFAs als normale Kinder [16]. Diese SCFAs können eine wichtige Rolle im menschlichen Magen-Darm-Epithel spielen [17]. Acetat kann die Blut-Hirn-Schranke überwinden und eine hypothalamisch-neuronale Aktivierung induzieren [18]. Darüber hinaus wurde die Wirkung von Butyrat auf die Unterdrückung von Dickdarmentzündungen im menschlichen Darm untersucht [19]. Daher ist es wichtig, welche Art von Mikrobiota oder welche spezifischen Bakterien sich im menschlichen Darm befinden, insbesondere im Hinblick auf die Beeinflussung der Körpergesundheit und Langlebigkeit [20,21].

Die Darmmikrobiota kann auch die Darm-Hirn-Achse beeinflussen und den Alterungsprozess verzögern, wodurch das Fortschreiten altersbedingter Krankheiten wie Amnesie, Demenz oder sogar Alzheimer verhindert wird [22,23]. Der Neurotransmitter Gamma-Aminobuttersäure (GABA) könnte beispielsweise von bestimmten Bakterienstämmen produziert werden, von denen berichtet wurde, dass sie epitheliale Stammzellen im Darm vermehren und depressives Verhalten bei Mäusen verbessern [24,25]. Aktuelle unterstützende Daten zeigen, dass die Zugabe von Probiotika als Präventionsmethode bei diesen altersbedingten neurologischen Störungen im Trend liegt [26,27].

Lactobacillus ist das am weitesten verbreitete Probiotikum, das eine hohe Wahrscheinlichkeit für die Entwicklung funktioneller Lebensmittel aufweist, da es in der menschlichen Nahrung seit langem vorkommt [28]. Allerdings weisen einzelne Bakterienarten von Stamm zu Stamm einzigartige Bioaktivitäten auf, die einer experimentellen Bestätigung bedürfen. In unseren früheren Studien haben wir den probiotischen Stamm Lactobacillus plantarum GKM3 aus eingelegten Blättern (Brassica juncea), in der taiwanesischen Hakka-Gesellschaft auch als Langlebigkeitsgemüse bekannt, isoliert und funktionelle Studien zur Stärkung des Magen-Darm-Trakts und der Immunität in vivo durchgeführt [29–31]. . Daher erwarteten wir, dass L. plantarum GKM3 den Alterungsprozess und altersbedingte kognitive Beeinträchtigungen lindern könnte.

2. Materialien und Methoden

2.1. Fächer

L. plantarum GKM3 wurde aus Chinesischem Senf (Brassica juncea) isoliert und im Bioresource Collection and Research Center, Taiwan (BCRC) mit der Sammlungsnummer 910787 aufbewahrt. Zunächst wurde GKM3 mit einer MRS-Brühe (BD Co., Franklin Lakes, NJ, USA) 18 Stunden lang bei 37 °C im Reagenzglas kultiviert. Mit einer Inokulation von {{10}}.01 Prozent wurde die GKM3-Impfkultur in einem 50 L-Fermenter unter einer pH-Kontrolle von 6.0 vergrößert 18 Stunden lang bei 37 °C mit einem bestimmten Medium (5 Prozent Glucose, 2 Prozent Hefeextrakt, 0,05 Prozent MgSO4, 0,1 Prozent K2HPO4 und 0,1 Prozent Tween 80). Anschließend wurden die fermentierten Bakterien durch 10-minütige Zentrifugation bei 3800 U/min geerntet, zweimal mit Phosphat-Kochsalzpuffer gewaschen und das Pellet zur Gefriertrocknung mit 10-prozentiger Milch gemischt. Die Dosierungen des gefriergetrockneten Pulvers von L. plantarum GKM3 in dieser Studie wurden durch Sondenernährung auf 5,1 × 109 KBE/kg KG/Tag als hohe Dosis und 1,0 × 109 KBE/kg KG/Tag als niedrige Dosis für das Mausmodell angepasst .

Die seneszenzbeschleunigten anfälligen Mäuse P8 (SAMP8) wurden in dieser Studie als alterndes Tiermodell eingeführt. Alle SAMP8-Mäuse wurden einem 12-stündigen Dunkel-/Hell-Zyklus bei 25 ± 2 °C und 65 ± 5 Prozent relativer Luftfeuchtigkeit ausgesetzt und mit Futter und Wasser nach Belieben gehalten. Die folgenden experimentellen Verfahren wurden vom Tiermanagementausschuss der Abteilung für Lebensmittel und Ernährung der Providence University (Stadt Taichung, Taiwan) mit der IACUC-Nummer 20170629-A02 genehmigt.

2.2. Überlebenstest

Im Überlebenstest wurden sechs Monate alte SAMP8-Mäuse mit 20 Weibchen und 20 Männchen wie folgt gruppiert: Kontrolle, GKM3-Hochdosisgruppe und GKM3-Niedrigdosisgruppe. Den behandelten Mäusen wurde täglich das Probiotikum L. plantarum GKM3 verabreicht, bis sie ihren natürlichen Tod erreichten. Die lebenden/toten SAMP8-Mäuse in jeder Gruppe wurden erfasst und die durchschnittliche Lebensdauer berechnet.

2.3. Experimentdesign für altersbedingte kognitive Beeinträchtigungen

Für das Experiment zur kognitiven Beeinträchtigung wurden drei Monate alte SAMP8-Mäuse gehalten. Sowohl männliche als auch weibliche SAMP8-Mäuse wurden wie folgt gruppiert (n=10 bei jedem Geschlecht): Kontrollgruppe, GKM3-Gruppe mit hoher Dosis und GKM3-Gruppe mit niedriger Dosis. Den Mäusen in den Behandlungsgruppen wurde L. plantarum GKM3 14 Wochen lang oral verabreicht. Die Fortbewegungsaktivität wurde in der 11. Woche des Experiments durchgeführt. Der passive Vermeidungstest und der aktive Vermeidungstest wurden jeweils in der 13. und 14. Woche durchgeführt, und dann wurden die Mäuse für biochemische Analysen und histologische Untersuchungen getötet.

2.4. Fortbewegungsaktivität

Jede Maus wurde in die Mitte eines Shuttlekäfigs (25 cm × 25 cm × 25 cm, Coulbourn Instruments Model E61-21, Lehigh, PA, USA) gesetzt und ihre Fortbewegung wurde von einem Aktivitätsmonitor-Videopfadanalysator aufgezeichnet für 10 Min. Die durchschnittliche Zeit der Mausbewegung wurde alle 5 Minuten (s/5 Minuten) analysiert. Diese Prozession wurde bei schwachem Licht und stillen Bedingungen durchgeführt.

2.5. Passiver Vermeidungstest

Ein Shuttlekäfig (35 cm × 17 cm × 20 cm, Coulbourn Instruments Model E10-15, Lehigh, PA) wurde in einen dunklen und einen hellen Raum aufgeteilt. Zwischen den beiden Räumen befand sich eine Guillotine-Tür (7,5 cm × 6,5 cm, Coulbourn Instruments Model E10-15GD, Lehigh, PA, USA). Im Trainingstest für den passiven Vermeidungstest wurde eine Maus für eine winzige Anpassung in den hellen Raum gestellt und dann die Guillotine-Tür geöffnet. Die Maus würde 0,5 s lang einen Stromschlag von 0,5 µA erhalten, wenn sie den dunklen Raum betrat. Der Schock trat kontinuierlich dreimal alle fünf Sekunden auf. Die Maus wurde im gleichen Verfahren 24, 48 und 72 Stunden nach der Trainingseinheit für den Gedächtnistest ausgetauscht, mit der Ausnahme, dass kein Schock abgegeben wurde. Es wurde die durchschnittliche Verweildauer der Mäuse im hellen Raum gemessen. Es wurde eine obere Cutoff-Zeit von 180 s festgelegt.

2.6. Aktiver Vermeidungstest

Im Trainingstest für den aktiven Vermeidungstest würde die Maus einen 10 s langen konditionierten Reiz (CS) erhalten, der auf Licht und Ton basiert, und dann 5 s lang einen 0,3-mA-Elektroschock (bedingungsloser Reiz, UCS), wenn der Die Maus blieb im selben Raum, wohingegen es keinen Schockempfang gab, wenn die Maus in den anderen Raum wechselte. Jede Maus hatte 5 CS- und UCS-Zyklen trainiert. Die Maus wurde im gleichen Verfahren (CS/UCS-System) mit 15–20-minütigen Versuchsintervallen viermal täglich und kontinuierlich vier Tage lang getestet. Die durchschnittliche Vermeidungszeit wurde als Effekt des Lerngedächtnisses gemessen.

2.7. Analyse des oxidativen Stresses

Für den Nachweis von 8-Hydroxy-20 -desoxyguanosin (8-OHdG) aus der mitochondrialen DNA des Gehirns wurden 30 mg Gehirngewebe mit dem Blood & Tissue Genomic DNA Extraction Miniprep System (Viogene Biotek) extrahiert Corp., Taipei, Taiwan) und das hochempfindliche 8-OHdG Check ELISA Kit (Nikken SEIL Co. Ltd., Shizuoka, Japan) wurden mit einer Absorption bei 450 nm angewendet. Für die Analyse von Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen (TBARS) wurden 25 mg Hirngewebe mit 250 µL RIPA-Puffer gemahlen und bei 16,000× g 10 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert. Insgesamt wurden 100 µL Überstand gesammelt und mit 100 µL SDS-Lösung und 4 ml Farbreagenz versetzt und dann vor der Kühlbehandlung eine Stunde lang gekocht. Behandelte Proben wurden 10 Minuten lang bei 16,000× g zentrifugiert und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur aufbewahrt. Der TBARS-Gehalt (mM/g Protein) von jeder 150-µL-Probe wurde bei 535 nm Absorption mit der Standardkurve gemessen.

2.8. Messungen des Gehirn-Amyloid-Proteins

Das Amyloid-(A)-Protein aus dem Hirngewebeschnitt wurde mit der Methode der Immunhistochemie gefärbt. Der Prozentsatz der A-Anreicherung wurde mit einem Bildsystem (Leica, Q500, Wetzlar, Deutschland) mit einem Mikroskop unter einem 40-fachen Feld analysiert. Die Berechnung basierte auf dem Prozentsatz der A-Akkumulationsfläche im gesamten Gehirn: (-Amyloid-Ablagerungsfläche/Gesamthirnfläche) × 100 Prozent.

2.9. Histologie

Die Gehirne wurden herausgeschnitten und mit 10 Prozent Formalin fixiert. Das Hippocampusgewebe wurde durch Dehydrierung, Reinigung, Infiltration und Einbettung zum Schneiden verarbeitet. Anschließend wurde das Gewebe des Hippocampusbereichs durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) untersucht.

2.10. Statistik

In dieser Studie wurde der Statistikstuhl SPSS 19.0 verwendet. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt und durch eine einfache ANOVA zum Vergleich der Mittelwerte zwischen den verschiedenen Gruppen ausgewertet. Ein signifikanter Unterschied wurde berücksichtigt, wenn der p-Wert gemäß Duncans Mehrfachbereichstests weniger als 0,05 betrug. Im Überlebenstest wurde der Kaplan-Meier-Test zur Analyse angewendet und der Log-Rank-Test durchgeführt, um die Unterschiede zwischen den Gruppen zu überprüfen.

3. Ergebnisse

3.1. Wirkung von L. plantarum GKM3 auf den SAMP8-Überlebenstest

Im Überlebensexperiment wurde die Lebensspanne von SAMP8-Mäusen bis zu ihrem natürlichen Tod beobachtet und es dauerte 21 Monate, bis alle Einzelaufzeichnungen abgeschlossen waren. Die durchschnittliche Lebensdauer unbehandelter männlicher SAMP8-Mäuse betrug 11,90 ± {{10}},18 Monate und für weibliche 11,20 ± 0,21 Monate. In den probiotischen GKM3-Ernährungsgruppen verlängerte sich die durchschnittliche männliche Lebenserwartung auf 12,5 ± 0,15 Monate und 13,50 ± 0,14 Monate bei niedrigen bzw. hohen Dosen von GKM3-Behandlungen. Der dosisabhängige Effekt des Probiotikums GKM3 auf die Lebensspannenverlängerung bei Frauen konnte ebenfalls mit 12,15 ± 0,21 Monaten in der Niedrigdosisgruppe und mit 14,30 ± 0,17 Monaten in der Hochdosisgruppe beobachtet werden (Daten nicht gezeigt).

Um die Lebenserwartung zusammenzufassen, wurde die Überlebensrate geschätzt. Bei einer Überlebensrate von 50 Prozent betrug die niedrige GKM3-Dosis in der männlichen Gruppe 12,67 Monate und die hohe GKM3-Dosis der männlichen Gruppe 13,33 Monate, während die männliche Kontrollgruppe nur 12,50 Monate aufwies (Abbildung 1A). Ähnlich wie bei weiblichen SAMP8-Mäusen wurden in Gruppen, denen das Probiotikum GKM3 in einer Dosierung von 1,0 × 109 KBE/kg KG/Tag und 5,1 × 109 verabreicht wurde, 12,00 Monate und 15,50 Monate mit einer Überlebensrate von 50 Prozent beobachtet KBE/kg KG/Tag; In der weiblichen Kontrollgruppe wurden jedoch 10,50 Monate mit einer Überlebensrate von 50 Prozent beobachtet (Abbildung 1B). Als Grundlage für dieses Experiment wiesen die weiblichen SAMP8-Mäuse eine kürzere Lebenserwartung auf als die männlichen; Interessanterweise hatte die Wirkung von L. plantarum GKM3 hinsichtlich der Lebensdauer einen größeren Einfluss auf Frauen. Es wird vermutet, dass L. plantarum GKM3 die Lebenserwartung bei SAMP8-Mäusen beiderlei Geschlechts, insbesondere bei weiblichen Arten, erhöhen kann.

3.2. Körpergewicht, Nahrungsaufnahme und Wasseraufnahme bei SAMP8-Mäusen

Im Experiment zur altersbedingten kognitiven Beeinträchtigung gab es vor der Tötung keine signifikanten Unterschiede im Energieverbrauch und in der Gewichtsveränderung aller SAMP8-Mäuse der verschiedenen Behandlungsgruppen (Tabelle 1). Dies bedeutet, dass das Probiotikum GKM3 diese Stoffwechselparameter im Modell mit gealterten Mäusen nicht beeinflusste.

3.3. Wirkung von L. plantarum GKM3 auf die Gedächtniserhaltung und die Lernverbesserung

Ein Fortbewegungsaktivitätstest zeigte, dass es im ersten 5--Minuten-Intervall keinen signifikanten Unterschied zwischen allen SAMP8-Mäusen gab, unabhängig vom Geschlecht (Tabelle 2). Obwohl im zweiten 5--Minuten-Intervall im Vergleich zum ersten 5--Minuten-Intervall eine Abnahme zu verzeichnen war, gab es keine signifikante Veränderung zwischen der behandelten und der nicht behandelten Gruppe.

Passive Vermeidungstests wurden an männlichen und weiblichen Gruppen von SAMP8-Mäusen durchgeführt (Abbildung 2). Während des Probetests gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen allen Gruppen (p > 0.05). Die Latenz männlicher SAMP8-Mäuse, die mit dem probiotischen GKM3 gefüttert wurden, war im Vergleich zur Kontrollgruppe am ersten Tag signifikant erhöht (p < 0.05) (Abbildung 2A). Auch die Verweildauer weiblicher SAMP8-Mäuse im hellen Raum war am ersten Tag der GKM3-Behandlung verlängert, mit einem p-Wert von weniger als 0,05 in der Gruppe mit niedriger Dosis und einem p-Wert von weniger als 0,01 in der Gruppe mit hoher Dosis -Dosisgruppe im Vergleich zur Kontrolle. Allerdings gab es nach dem zweiten Tag des passiven Vermeidungstests keine signifikanten Unterschiede. Eine längere Latenzzeit in der GKM3-Fütterungsgruppe, sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen SAMP8-Mäusen, deutete darauf hin, dass das probiotische GKM3 zur altersbedingten Gedächtniserhaltung und Lernverbesserung beitragen könnte.

Bei einem aktiven Vermeidungsverfahren mussten die Mäuse alle Maßnahmen ergreifen, um den schädlichen Reiz zu vermeiden. Am Versuchstag des aktiven Vermeidungstests zeigten sowohl die männlichen als auch die weiblichen SAMP8-Mäuse, die mit GKM3 gefüttert wurden, tendenziell einen höheren Vermeidungserfolg (Abbildung 3), erreichten jedoch nicht den statistischen Unterschied (p > 0.{{ 9}}5) im Vergleich zur Kontrollgruppe. Das Ergebnis an den Tagen eins und zwei des aktiven Vermeidungstests zeigte jedoch, dass die erfolgreiche Zeit in den männlichen Gruppen mit GKM3-Futter im Vergleich zu den nicht behandelten männlichen SAMP8-Mäusen signifikant verlängert war (Abbildung 3A) (p < 0,05). Ein ähnliches Ergebnis wurde auch in den weiblichen Gruppen beobachtet (Abbildung 3B). Interessanterweise gab es keine statistischen Unterschiede (p=0.157) beim Ergebnis des vierten Tages zwischen der Kontroll- und der Probiotikagruppe. Das bedeutet, dass die Kontrollmäuse vier Tage lang trainiert werden mussten, um mit den mit Probiotika gefütterten Mäusen mitzuhalten. Es wird vermutet, dass die Zugabe von probiotischem GKM3 zur Ernährung die Wahrnehmung des Wirts verbessern könnte, was sich auf das angemessene Verhalten beider Geschlechter auswirkt.

【Für weitere Informationen:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】