MRNA-Transfer im großen Maßstab zwischen Haloxylon Ammodendron (Chenopodiaceae) und dem krautigen Wurzel-Holoparasiten Cistanche Deserticola (Orobanchaceae)
Feb 07, 2023
Höhepunkte
•Zehntausend mRNAs werden zwischen Haloxylon ammodendron und Wurzelparasiten übertragenCistanche Deserticola
•RNA-Mobilitäts- und Funktionsanalyse wurden im Sonnenblumen-Orobanche-Cumana-System durchgeführt
•CdNLR1 und CdNLR2 würden eine wurzelspezifische Herzfrequenz verursachen und das parasitäre Gleichgewicht beeinflussen
Zusammenfassung
Es wurde ein mRNA-Austausch zwischen Wirts- und Stängelparasiten gezeigt, aber nicht zwischen Wurzelparasiten.Cistanche Deserticola(Orobanchaceae) ist einHoloparasitisches Krautdas an den Wurzeln der Gehölzpflanze Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae) parasitiert. Wir verwendeten Transkriptomsequenzierung und bioinformatische Analysen, um fast zehntausend mobile mRNAs zu identifizieren. Die Fülle der Transkripte scheint eine treibende Kraft für das Transferereignis zu sein, und der mRNA-Austausch findet über die Haustorialverbindung statt. Die Mobilität ausgewählter mRNAs wurde in situ und in einem heterologen Parasitensystem aus Sonnenblumen-Orobanche cumana bestätigt. VierC. Deserticola→H. Ammodendron mobile mRNAs scheinen die Haustoriumentwicklung zu erleichtern. Interessanterweise verursachen zwei mobile mRNAs der mutmaßlichen Resistenzgene CdNLR1 und CdNLR2 eine wurzelspezifische Überempfindlichkeitsreaktion und verzögern die Parasitenentwicklung, was zum parasitären Gleichgewicht beitragen könnte. Die vorliegende Studie liefert Beweise für das groß angelegte mRNA-Transferereignis zwischen einem holzigen Wirt und einem Wurzelparasiten und demonstriert die funktionelle Relevanz von sechsC. DeserticolaGene in Wirt-Parasit-Interaktionen.
Themenbereiche
PflanzenbiologieInteraktion von Pflanzen mit OrganismenOmicsTranscriptomics
Einführung
Zunehmende Beweise deuten auf die Bedeutung von Makromolekülen wie Proteinen und mRNAs sowohl für die Kurz- als auch für die Fernkommunikation in Pflanzen hin.1 Plasmodesmen gelten als Transportkanäle über kurze Entfernungen, während das Gefäßsystem den molekularen Langstreckentransport zwischen distalen Geweben durchführt.2 ,3 Es wurde berichtet, dass mRNA im Phloem übertragen wird.4 Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Stamm-Schleifen-Struktur des tRNA-Ursprungs mRNA mit Langstreckentransportkapazität ausstattete.5 Es wurde berichtet, dass AtRRP44A, eine Untereinheit des RNA-Exosoms, mit Plasmodesmen interagiert und um den Zell-zu-Zell-Verkehr von KNOTTED1 (KN1) mRNA zu vermitteln.6
Parasitäre Pflanzen machen etwa 1 Prozent der Blütenpflanzen aus. Das wichtigste Merkmal parasitärer Pflanzen ist eine spezialisierte Struktur namens Haustorium, die physische und physiologische Verbindungskanäle zwischen dem Wirt und parasitären Pflanzen herstellt und so die meisten ihrer Interaktionen dominiert.7 Parasitäre Pflanzen verlassen sich auf den Wirt, um ihr Wachstum aufrechtzuerhalten, indem sie Wasser aufnehmen und die Nährstoffe wie Photosynthese, Aminosäuren und andere Zwischenmetabolite aus dem Wirt durch das Haustorium.8 Haustoria fungiert auch als Verbindungsbrücke zwischen den Wirten, um Signalmoleküle wie Pflanzenfressersignale zu übertragen.9 Es wurde auch gezeigt, dass die Biomoleküle, einschließlich Proteine und RNAs tauschen bidirektional über Wirt-Parasit-Verbindungen aus. Das früheste Beispiel für einen RNA-Transfer zwischen dem Wirt und parasitären Pflanzen ist die Übertragung des RNA-Virus vom infizierten Wirt auf die nicht infizierte Pflanze durch Dodder.10 Kleine RNAs (sRNAs) wie kleine Interferenz-RNA (siRNA) und Mikro-RNA (miRNA) wurden gezeigt zwischen Wirt und Parasit zu bewegen, um die Zielgenexpression in Empfängerorganismen zu regulieren.11,12,13 Was den mRNA-Transfer anbelangt, so wurden zunächst für mehrere Gene mobile mRNAs von den Wirten Tomate, Kürbis und Luzerne zum Parasiten Cuscuta chinensis nachgewiesen test.14 Durch Microarray-Analyse konnten Roney et al. fanden heraus, dass 474 mRNAs von der Tomate auf die Spinnzwirn übertragen wurden.14 Eine groß angelegte Identifizierung von Transfer-mRNAs wurde jedoch nur durch den Einsatz von Next-Generation-Sequenzierungstechnologie erreicht. Kimet al. nutzten die Transkriptom-Sequenzierungstechnologie, um den groß angelegten und bidirektionalen mRNA-Transfer zwischen dem Parasiten Cuscuta pentagona und Wirten wie Arabidopsis thaliana und Tomate zu identifizieren.15 Die funktionelle Relevanz von Transfer-mRNAs bei Wirt-Parasit-Wechselwirkungen war jedoch nicht klar.
Orobanchaceae ist die größte parasitäre Angiospermenfamilie, in der viele fakultative oder obligate Wurzelparasiten sind.16 Cistanche ist eine weltweite Gattung holoparasitärer Wüstenpflanzen in Orobanchaceae. C. deserticola ist ein Holoparasit, der an den Wurzeln eines verholzten Psammophyten, Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae), parasitiert.17 Es wurde gezeigt, dass das rpoC2-Gen des Chloroplasten von H. ammodendron auf C. deserticola durch horizontalen Gentransfer übertragen wurde.18 Hier identifizierten wir fast zehntausend mobile mRNAs zwischen C. deserticola und H. ammodendron durch Transkriptomsequenzierung der nächsten Generation und bioinformatische Analyse. Die mobilen mRNAs wurden durch multiples Sequenzalignment, PCR-Validierung und insbesondere die Verwendung eines Sonnenblumen-Orobanche cumana-Parasitensystems ermittelt. Auch die Funktion mobiler mRNAs wurde durch dieses heterologe parasitäre System für mehrere Gene nachgewiesen. Bisher waren die Berichte über den Austausch funktioneller mRNAs zwischen Wirt und Parasit sehr begrenzt. Daher liefert unsere Studie neue Einblicke in den parasitären Mechanismus aus Sicht mobiler mRNAs.
Ergebnisse
Identifizierung mobiler mRNAs zwischen C. deserticola und H. ammodendron
Die enge physische Verbindung der Wirtswurzel H. ammodendron und des Parasiten C. deserticola macht es unmöglich, sie am Haustorium zu trennen. Daher haben wir Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung (RNA-seq) und schrittweise bioinformatische Klassifizierung kombiniert, um die mobilen Transkripte zwischen Wirt und Parasit zu identifizieren. Vier verschiedene Probensätze wurden für RNA-seq-Analysen auf der Illumina HiSeq2500-Plattform gesammelt. Dazu gehören das Wurzelgewebe des parasitenfreien Wirts H. ammodendron (HA), Sukkulentenstamm vonC. Deserticola(CD), das Wurzelgewebe des Wirts H. ammodendron, mit dem es parasitiertC. Deserticola(HC) und die haustoriale Schnittstelle (HI). Für HC- und CD-Proben wurden die jeweilige Wirtswurzel und der Parasitenstamm 1 cm von der entfernt gesammeltparasitäre Verbindung(Abbildung 1A).
Abbildung 1. RNA-seq-Analyse und Bestätigung mobiler RNAs
(A) Abbildung ausgewählter Gewebe für die RNA-Seq-Analyse. CD, frische sukkulente Stängel von C. deserticola in der Nähe der Haustorialkreuzung; HC, die Wurzeln von CD-infiziertem H. ammodendron; HI, haustoriale Schnittstelle. Maßstabsbalken sind angegeben.
(B) Überblick über die Strategien zur Sequenzmontage und Bestätigung mobiler RNAs. RNA-seq, RNA-Sequenzierung der nächsten Generation. ISO-Seq, Transkriptomsequenzierung in voller Länge. HA, die Wurzeln von nicht parasitiertem H. ammodendron. HA.FL_NR, vollständige Transkriptomsequenz von H. ammodendron. CD.FL_NR, vollständige Transkriptomsequenz von C. deserticola.
(C) ORF-Vorhersage und weitere Bestätigung des Montageergebnisses. Der ORF-Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) wurde für die ORF-Vorhersage angewendet und oben zusammengestellte Unigene mit dem Ausdrucksschwellenwert von (FPKM größer als oder gleich 0).3 ) wurden gegengeprüft. Die überlappenden Unigene wurden weiter mit dualem BLASTN (E-Wert=1e-10) gegen Cis- und HAC-Unigene gefiltert.
(D) Venn-Diagramme, die gemeinsame und unterschiedliche Sätze von Transkripten zwischen CD-, HA- und HC-Proben zeigen.
Die zuverlässige Identifizierung von Quellgewebe für ein bestimmtes Transkript von interagierenden Organismen ist eine Herausforderung. Daher Ikeue et al. haben eine nützliche bioinformatische Methode entwickelt, um Wirts- und Parasiten-Transkripte zu unterscheiden.19Hier haben wir einen modifizierten bioinformatischen Ansatz verwendet, der auf ihrer Methode basiert, um die mobilen mRNAs zwischen ihnen zu identifizierenC. Deserticola UndH. Ammodendron(Abbildung 1B). Insgesamt wurden 723.382.940 saubere Lesevorgänge aus den obigen Bibliotheken generiert (Tabelle S2), und diese Lesevorgänge wurden über verschiedene Strategien zusammengestellt (Abbildung 1B). Als Ergebnis wurden alle zehn Proben hybrid zu 222.899 Unigenen zusammengesetzt (im Folgenden als „kombiniert“ bezeichnet, Tabelle S3).C. DeserticolaUndH. AmmodendronProben wurden auch zu 107.752 bzw. 194.720 Unigenen zusammengesetzt (im Folgenden als „Cis“ und „HAC“ bezeichnet, Tabelle S3). Um die Variation sowie die Ähnlichkeit für alle Proben zu visualisieren, haben wir eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) an den normalisierten FPKM-Werten aller nachgewiesenen Gene in "Combined Unigenes" durchgeführt. Das PCA-Diagramm zeigte, dass die Daten für drei biologische Wiederholungen eng geclustert und in verschiedenen Proben getrennt waren, insbesondere zwischen ihnenH. AmmodendronUndC. Deserticola(Abbildung S1). Unterdessen zeigte die ORF-Vorhersage, dass angenommen wurde, dass 149.825 (67,23 Prozent) der „kombinierten“ Unigene mutmaßliche Proteine codieren (Abbildung 1C). Die individuell zusammengesetzten Unigene mit dem Expressionsschwellenwert von FPKM größer als oder gleich 0.3 aus vier verschiedenen Proben wurden mit den ORF-Vorhersageergebnissen gegengeprüft (Tabellen S4–S6). Diese Analyse ergab, dass 69,01–75,90 Prozent der Unigene aus den vier Proben CD, HC, HA und HI mutmaßlichen ORF aufwiesen (Abbildung 1C). Es wurde eine Transkriptomsequenzierung in voller Länge durchgeführt und die Daten, CD_FL fürC. Deserticolaund HA_FL fürH. Ammodendron, wurden zur Korrektur von Montagefehlern für beide Hosts verwendetH. Ammodendronund ParasitC. Deserticolada beiden Arten genomische Daten fehlen (Tabellen S8–S11). Als die zugeordneten Unigene von oben vier Proben mit dualem BLASTN (E-Wert=1 e−10) gegen Cis, HAC, CD_FL und HA_FL, 94,78–99. 00 Prozent von ihnen hatten zuverlässige Konsensussequenzen (Abbildung 1C und Tabelle S7). Basierend auf der obigen Analyse wurden schließlich 17.379 (HA-exklusive 14.810 und HA-enthaltende 2.569) gemeinsame Unigene von HC und CD auf einer Venn-Diagrammanalyse der Unigene von CD, HC und HA ( 1D ) wiedergewonnen. Unter ihnen sind die früheren 14.810 Unigene aufgrund ihrer Abwesenheit in HA höchstwahrscheinlich von Parasiten-CD-Ursprung, aber ein Teil von ihnen könnte auch mobile HC→CD-mRNAs darstellen, die aufgrund ihrer Hochregulierung nur in HC, aber nicht in HA vorhanden sind auf Parasitenanhaftung. Die letzteren 2.569 Unigene stellen höchstwahrscheinlich unidirektionale HC→CD-Transfer-mRNAs dar, wie sie auch in HA vorhanden sind. Die anderen Unigene wurden von den Kandidaten für mobile mRNAs ausgeschlossen, da sie nicht zwischen HC und CD geteilt wurden. Man sollte auch beachten, dass 14.810 gemeinsame Unigene in [HC, CD] 166 gemeinsame Unigene in [HA, CD] um das 89-fache übertrafen, was stark auf die Zuverlässigkeit unserer Analysen hindeutet, da letzteres logischerweise unmöglich war und durch die unvermeidlichen Fehler von Unigene verursacht wurde Montage oder bioinformatische Analysen (Abbildung 1D).
Der Ursprung mutmaßlicher mobiler mRNAs wurde durch duale BLAST-Analysen weiter bestätigt, um ihren Sequenzursprung zuzuordnen (Abbildung 1B und Tabelle S12). Aufgrund des Mangels an genomischen Daten sowohl für den Wirt als auch für den Parasiten nutzten wir verfügbare Sequenzdaten für Organismen der Familien Chenopodiaceae und OrobanchaceaeH. AmmodendronUndC. Deserticolagehören jeweils. Unsere Hypothese ist, dass mobile mRNAs vonH. AmmodendronUrsprungs haben höchstwahrscheinlich höhere Homologien mit ihren Orthologen aus anderen Chenopodiaceae-Arten als solche aus Orobanchaceae-Arten, während es für mobile mRNA von umgekehrt istC. DeserticolaHerkunft, und die konservierten Orthologen haben wahrscheinlich eine große Ähnlichkeit sowohl mit Orobanchaceae als auch mit Chenopodiaceae. Diese Analyse könnte uns helfen, die Herkunft der mobilen mRNAs zu ermitteln, da sie über die Homologiesuche der Familienebene zugeordnet werden könnten. Um unsere Hypothese zu beweisen, wurde mit OrthoFinder ein phylogenetischer Stammbaum von 37 Arten erstellt, darunter sechs Orobanchaceae- und vier Chenopodiaceae-Arten. Die große evolutionäre Distanz zwischen Orobanchaceae- und Chenopodiaceae-Arten bestätigte die Zuverlässigkeit unserer Hypothese (Abbildung 2A und Tabelle S13). Die Analyse des Genverlusts zeigte, dass die Transkripte für viele Orthogruppen und Gene, die mit der Photosynthese in Zusammenhang stehen, fehltenC. Deserticola(Abbildungen 2B und 2C, Tabelle S14, Daten S2 und S3). Darüber hinaus ist die Venn-Diagrammanalyse zwischenC. Deserticolaund drei weitere sequenzierte parasitäre Pflanzen zeigten ebenfalls, dass 53,84 Prozent (926/1.720) der fehlenden Orthogruppen inC. Deserticolafehlten auch in anderen drei parasitären Pflanzen, nämlich 50,81 Prozent (755/1486), 48,09 Prozent (377/784) und 50,00 Prozent (260/520).C. Australien, Striga asiaticaUndPhtheirospermum japonicum(Abbildung S2). Diese Ergebnisse zeigten nicht nur die parasitäre Eigenschaft dieser Spezies, sondern auch die Zuverlässigkeit der Unigen-Assemblierung aus unseren Analysen und unterstützten auch unsere Hypothese, relative Pflanzenarten zur Bestätigung des Sequenzursprungs zu verwenden. Daher wurden die Kandidaten-Transfer-Unigene aus den obigen Analysen mit dualem BLASTN (E-Wert=1 e−10) gegen eine Sammlung öffentlich zugänglicher Sequenzdatensätze von Orobanchaceae (Transkriptom vonTriphysaria versicolor, Striga hermonthica und Phelipanche aegyptiaca; EST- und mRNA-Sequenzen von NCBI) und Chenopodiaceae (Transkriptom der nächsten Generation und in voller Länge vonH. Ammodendron; EST- und mRNA-Sequenzen von NCBI) (Abbildung 1B und Tabelle S12). Als Ergebnis wurde bestätigt, dass 7.496 Unigene von dem Parasiten stammenC. Deserticola, was 9,66 Prozent (7.496/77.615) und 13,70 Prozent (7.496/54.721) der Unigene in Ziel-HC-Proben bzw. Quell-CD ausmacht; und 2.370 Unigene wurden dem Wirt zugeordnetH. Ammodendron, was 3,38 Prozent (2.370/70.119) bzw. 4,15 Prozent (2.370/57.091) der Unigene in Quell-HC- bzw. Ziel-CD-Proben ausmacht (Abbildungen 2D und 2E, Tabellen S7, S12 und S15). Die gemeinsamen 2.931 Unigene waren zu homolog, um dem genauen Ursprungsorganismus zugeordnet zu werden. Diese Ergebnisse zeigten, dass fast zehntausend (7.496 plus 2,370 = 9,866) Unigene zwischen wurzelparasitären Pflanzen übertragen werden konntenC. Deserticolaund holziger PflanzenwirtH. Ammodendron. Viel mehr (7.496/2,370 = 3,16--fache) mobile RNAs stammten von ParasitenC. DeserticolaHerkunft als des WirtsH. AmmodendronUrsprung, was die Verzerrung des mRNA-Transfers in Parasit→Wirt-Richtung zeigt.
Abbildung 2. Genverlustanalyse und weitere Bestätigung mobiler RNAs durch multiples Alignment
(A) Phylogenie von Blütenpflanzengenomen. OrthoFinder wurde verwendet, um die Evolution aller Proteinsequenzen von 37 Arten zu analysieren und die orthogonale Gruppe zu finden, einschließlich direkter homologer Gene und kollateraler homologer Gene zwischen den Arten.
(B) Prozentsatz der verlorenen Orthogruppen. Die Anzahl der Orthogruppen-Deletionen in halbparasitären Pflanzen und vollständig parasitären Pflanzen.
(C) Prozentsatz verlorener Unigene. Der Anteil an Genen, die mit Photosynthese und Stoffwechsel in Verbindung stehen, wurde gezeigt.
(D) Venn-Diagramme, die gemeinsame und unterschiedliche Sätze von Transkripten zwischen CD- und HC-Proben bei multipler Ausrichtung zeigen. CD_trans, mobile CD→HC-RNAs. HC_trans, mobile HC→CD-RNAs.
(E) Tortendiagramme zeigen die Anteile der mobilen Lesevorgänge, die CD- (äußerer Kreis) und HC-Transkriptomen (innerer Kreis) zugeordnet sind.
