-Liponsäure erhöht die Kollagensynthese und -ablagerung in nichtdiabetischen und diabetischen Rattennieren

Nevena Grdović et al

-Liponsäure (ALA) wird häufig als Nahrungsergänzungsmittel und therapeutisches Mittel bei der Behandlung von Diabetes eingesetzt. Die gut etablierten antioxidativen und hypoglykämischen Wirkungen von ALA wurden als besonders wichtig bei der Bekämpfung diabetischer Komplikationen angesehen, einschließlichNieren-Verletzung. Die vorliegende Studie bewertete das Potenzial von ALA, profibrotische Ereignisse imNieredas könnte seine Struktur und Funktionsweise verändern. ALA wurde intraperitoneal (10 mg/kg) nicht-diabetischen und Streptozotocin-induzierten diabetischen männlichen Wistar-Ratten für 4 und 8 Wochen verabreicht. Die Wirkungen von ALA wurden ausgehend von strukturellen/morphologischen Veränderungen über Veränderungen, die profibrotische Prozesse charakterisieren, bis hin zur Regulation der Kollagen-Genexpression in der Haut bewertetNiere. Hier haben wir gezeigt, dass ALA den systemischen Glukose- und Harnstoffspiegel verbessert, die Bildung von reduziertNieren-fortgeschrittene Glykationsendprodukte (AGEs) und die Aufrechterhaltung der strukturellen Nierenintegrität bei diabetischen Ratten. Allerdings wurden bei Diabetes provozierte profibrotische Ereignisse nicht durch ALA gelindert, da die Kollagensynthese/-ablagerung und die Expression des transformierenden Wachstumsfaktors - 1 (TGF- 1) und -Glattmuskelaktin (-SMA) bei ALA erhöht blieben. behandelten diabetischen Ratten, insbesondere nach 8 Wochen Diabetesbeginn. Darüber hinaus führte die 8-wöchige Behandlung nichtdiabetischer Ratten mit ALA zur Entwicklung profibrotischer Merkmale, die sich in einer erhöhten Kollagensynthese/-ablagerung widerspiegelten. Neben der nachgeschalteten TGF- 1-Signalgebung beinhaltet der zusätzliche Mechanismus, der der Hochregulierung von Kollagen IV bei nicht-diabetischen Ratten, die mit ALA behandelt wurden, zugrunde liegt, eine verringerte DNA-Methylierung seines Promotors, die aus einer erhöhten Tet1-Expression resultieren könnte. Diese Ergebnisse unterstreichen die therapeutische Vorsicht bei der Verwendung von ALA, insbesondere bei Patienten mitNieren-DiabetikerKomplikationen.

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1. Einleitung

DiabetikerNiereDie diabetische Nephropathie (DKD) oder diabetische Nephropathie gehört mit einer Inzidenz von 20-40 Prozent bei Diabetikern zu den mikrovaskulären Komplikationen, die mit fortschreitenden strukturellen Veränderungen und Verlust der Nierenfunktion einhergeht [1]. Der pathophysiologische Mechanismus, der DKD zugrunde liegt, ist komplex und beginnt mit einer chronischen Hyperglykämie, die wiederum oxidativen Stress, die Bildung fortgeschrittener Glykationsendprodukte (AGEs), die Aktivierung von MAPK/PKC-Signalwegen und die anschließende Expression mehrerer proinflammatorischer und profibrotischer Mediatoren auslöst [2, 3]. Crosstalk zwischen diesen Ereignissen führt zur Akkumulation von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) im Mesangium und Tubulointerstitium mit einem klassischen histopathologischen Muster vonNieren-Fibrose. Es beginnt mit strukturellen Veränderungen wie der Verdickung der Basalmembran und der mesangialen Expansion, die allmählich zu Glomerulosklerose und interstitieller Fibrose führt, die schließlich kulminiertNieren-Versagen[4, 5].

Transforming Growth Factor- 1 (TGF- 1) Downstream-Signaling ist Teil des Wundheilungsprozesses, der sich bei anhaltender Entzündung, Hyperglykämie oder oxidativem Stress, die für Diabetes charakteristisch sind, in eine pathophysiologische Fibrose umwandelt [6] . TGF- 1 ist ein zentraler Mediator der DKD-Pathogenese und der Hauptregulator der ECM-Proteinexpression bei Patienten mit Diabetes, wahrscheinlich als Folge des hyperglykämischen und gestörten oxidativen Milieus [7–10]. TGF- 1 induziert ECM-Akkumulation durch Stimulierung von Typ-I- und -IV-Kollagen, -Smooth-Muscle-Actin ( -SMA), Laminin und Fibronectin-Synthese sowie durch Hemmung von ECM-abbauenden Enzymen [11].

Kollagen Typ IV ist der häufigste Bestandteil der Basalmembran [12] und wird unter physiologischen Bedingungen in glomerulären und tubulären Basalmembranen exprimiert [13]. Die diabetische Nephropathie wird jedoch von einer abweichenden Expression von Kollagen Typ IV begleitet, die eine übermäßige Produktion und eine unregelmäßige Verteilung durch das Interstitium und das Mesangium umfasst [14–16]. Unter den sechs Isoformen des Typ-IV-Kollagens (1- 6) sind 1(IV) und 2(IV) universell in allen Basalmembranen vorhanden. Kollagen 1(IV)- und 2(IV)-Ketten werden von Col4a1- und Col4a2-Genen codiert, deren Transkriptionsregulation auf gut beschriebenen cis-trans-Wechselwirkungen beruht [17], aber neuere Erkenntnisse unterstreichen die wichtige Rolle epigenetischer Mechanismen, einschließlich DNA-Methylierung, in die Regulation ihrer Expression [18–20].

Angesichts der pathophysiologischen Mechanismen, die der DKD zugrunde liegen, sind die Behandlungsstrategien unkompliziert und zielen auf Hyperglykämie und oxidativen Stress ab. Das hypoglykämische und antioxidative Potenzial von ALA, das eines der weit verbreiteten Antioxidantien ist, verbessert sichNieren-pathologische Veränderungen im Zusammenhang mit diabetischer Nephropathie [21–23]. Im Zusammenhang mit der Hautalterung wurde jedoch über die vorteilhaften Wirkungen von ALA durch erhöhte Kollagen-Typ-I-Synthese in menschlichen dermalen Fibroblasten berichtet [24]. In Anbetracht der Pathophysiologie von DKD könnte eine ähnliche Wirkung von ALA für Diabetiker schädlich seinNieren-Komplikationen. Vor diesem Hintergrund konzentrierte sich die vorliegende Studie auf die Bewertung der Wirkungen von ALA auf renale strukturelle/morphologische Merkmale und profibrotische Prozesse mit Schwerpunkt auf der Kollagen-Typ-IV-Genexpression bei diabetischen und nicht-diabetischen Ratten.

2. Material und Methoden

2.1.Tiere, Behandlungen und Versuchsaufbau.Alle Experimente wurden an 2,5- Monate alten männlichen Albino-Wistar-Ratten mit einem Gewicht zwischen 220 und 250 g durchgeführt. Alle von der Ethikkommission für die Verwendung von Versuchstieren des Instituts für biologische Forschung „Siniša Stan-ković“ der Universität Belgrad genehmigten tierexperimentellen Verfahren standen im Einklang mit der Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz von Tieren, die für Versuchs- und Versuchszwecke verwendet werden andere wissenschaftliche Zwecke. Die Tiere in dieser Studie wurden gemäß allen Empfehlungen der Richtlinien für die Euthanasie von Tieren durch eine physikalische Euthanasiemethode unter Verwendung einer Guillotine getötet. Der Tod tritt sofort ein und Tiere haben nicht gelitten. Euthanasie wurde im Operationssaal durchgeführt, getrennt vom Unterbringungsraum, Tier für Tier (der Rest der Tiere im Experiment wurde im Versuchsraum gehalten, der vom Operationssaal getrennt war, wo die Euthanasie durchgeführt wurde, um Stress für die anderen zu vermeiden Tiere). Euthanasie wurde von gut ausgebildetem und erfahrenem Personal durchgeführt. Die für die Enthauptung verwendete Ausrüstung war in gutem Zustand (es werden regelmäßig Wartungsarbeiten durchgeführt, um die Schärfe der Klingen zu gewährleisten).

Diabetes wurde durch mehrere niedrig dosierte (40 mg/kg) Injektionen von Streptozoticin (STZ) (MP Biomedicals) an fünf aufeinanderfolgenden Tagen induziert; Kontrollratten wurde nur das Vehikel injiziert (0,1 M Natriumcitratpuffer, pH 4,5). Der Blutglukosespiegel wurde 24 h nach der letzten STZ-Injektion mit einem Blutzuckermessgerät Accu-Chek Active gemessen, und die Tiere wurden als diabetisch betrachtet, wenn der Nüchtern-Blutglukosespiegel 20 mmol/l überstieg. Die Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in vier experimentelle Gruppen eingeteilt: Kontrolle (Kontrolle, n=8), mit ALA behandelte Kontrolle (ALA, n=8), Diabetiker (STZ, n=10) und Diabetikergruppe, die mit ALA behandelt wurde (STZ/ALA, n=10). ALA (Ivančić i synovial, Belgrad, Serbien) wurde intraperitoneal (10 mg/kg) jeden Tag für 4 und 8 Wochen, beginnend mit der letzten STZ-Injektion, injiziert. Nach der Opferung und Blutentnahme wurde ein Bauchschnitt gemacht und beidesNierenwurden entfernt. EinerNierewurde in flüssigem Stickstoff eingefroren, bei -80 Grad gehalten und für die Protein-, DNA- und RNA-Isolierung verwendet, während das andere für histologische Untersuchungen in 10 % gepuffertem Formalin fixiert wurde.

2.2.Biochemische Analyse.Ratten haben vor der Opferung über Nacht gefastet. Blutserum wurde nach Blutgerinnung und Zentrifugation bei 2, 000 g für 10 min gesammelt. Das Serum wurde zur Bestimmung der Glucosekonzentrationen mit einem kommerziellen Kit (Gluco-quant Glucose/HK; Boehringer), des Serumtriglyceridspiegels durch das GPO-PAP-Verfahren unter Verwendung eines enzymatischen Kits (Randox Laboratories, UK), des Harnstoffspiegels durch Urea Assay verwendet Kit (Abcam, USA) und Kreatininkonzentrationen unter Verwendung des Cayman's Creatinine Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers.

2.3. Histologische Analyse und Immunfärbung.FormalinfixiertNiereGewebe wurden in einer abnehmenden Reihe von Xylol und Alkoholen für den späteren Einschluss in Paraffinblöcke dehydriert. Gewebeblöcke wurden bei 5 &mgr;m auf einem Rotationsmikrotom (RM 2125RT; Leica Microsystem) geschnitten. Um Veränderungen in der Nierenmorphologie zu beobachten, wurden Gewebeschnitte mit der Periodsäure-Schiff (PAS)-Methode gefärbt. Außerdem wurden gefärbte Schnitte mit einem Olympus-Mikroskop (BX-51) analysiert, das mit einem Mikroaktuator, einem motorisierten Objekttisch und einer Kamera ausgestattet war und durch das stereologische Softwarepaket newCAST Visiopharm Integrator System gesteuert wurde. Die röhrenförmigen Lumenbereiche wurden bei einer objektiven Vergrößerung von 40x erhalten und als Prozentsatz (Prozent) pro untersuchtem Bereich ausgedrückt. Die Fraktion der mesangialen Matrix wurde als Fläche mit positiver PAS-Färbung bewertet, ausgedrückt als Prozent pro glomerulärer Gesamtfläche (objektive Vergrößerung 100-fach).

Für den Kollagenfasernachweis wurden Gewebeschnitte mit Masson-Trichrom-Färbung gefärbt. Nach dem Färben wurden die Schnitte unter einem Lichtmikroskop (DM RB Photomicroscope Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland, ausgestattet mit einer Leica DFC 320 CCD-Kamera; Objektivvergrößerung 40x) betrachtet. Die Bildanalyse wurde mit der ImageJ-Software (Version 1.52p, National Institutes of Health) durchgeführt. Die Bilder wurden in RGB-Stapel umgewandelt und es wurde ein manueller Schwellwert angewendet, um den Anteil der Kollagenfläche pro Gewebefläche zu bewerten.

Die immunhistochemische Analyse wurde wie in [25] beschrieben unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern, die gegen N(?)-(Carboxymethyl)lysin (CML) (Verdünnung 1:50) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) gezüchtet wurden, und Sekundärantikörper Meerrettichperoxidase (1: 100) (Santa Cruz Biotechnologie). Gewebeschnitte wurden mit 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) gefärbt, mit Hämatoxylin gegengefärbt und montiert und unter einem Lichtmikroskop (Leica DM RB-Fotomikroskop; Objektivvergrößerung 40x) betrachtet. Die Bildanalyse wurde mit der ImageJ-Software (Version 1.52p, National Institutes of Health) durchgeführt. Die Bilder wurden durch Farbdekonvolution mit der H-DAB-Vektoroption verarbeitet. Die CML-Signalisierung wurde als mittlere Grauintensität der DAB-Färbung berechnet, normalisiert auf die Anzahl der Zellkerne (erhalten mit der Option „Partikel analysieren“).

2.4. Western-Blot-Analyse.25 ug vonNiereHomogenate wurden durch SDS-PAGE getrennt, auf Polyvinylidendifluoridmembranen übertragen und mit polyklonalen Antikörpern gegen GAPDH (FL-335) und monoklonalen Antikörpern gegen Ratten-TGF- 1 (3C11) und SMA (CGA7) sondiert, alle von Santa Cruz Biotechnology und alles im Verhältnis 1:1, 000 verdünnt. Der Nachweis wurde durch ein verbessertes Chemilumineszenz-Nachweissystem (Santa Cruz Biotechnology) durchgeführt. Die Quantifizierung der immunreaktiven Banden wurde unter Verwendung der Elektrophorese-Software TotalLab (Phoretix) (Version 1.10) durchgeführt und auf die als Ladekontrolle verwendete GAPDH normalisiert.

2.5. Quantitative Echtzeit-PCR (RT-qPCR).Gesamt-RNA wurde daraus isoliertNierenmit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen). Für die cDNA-Synthese wurde 1 ug der Gesamt-RNA mit DNase I behandelt und mit dem RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Burlington, Kanada) unter Verwendung einer Mischung aus zufälligen Hexamer- und Oligo (dT)-Primern revers transkribiert. Die mRNA-Spiegel wurden unter Verwendung von 2x Maxima SYBR Green/-ROX qPCR Master Mix (Fermentas) auf einem QuantStudio 3 Real-Time PCR-System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) quantifiziert. Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) wurde verwendet, um die Primer (aufgeführt in der Ergänzungstabelle S1) für die Bewertung von Col4a1, Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b und zu entwerfen Tet1-Genexpressionen. Die thermischen Zyklen bestanden aus anfänglicher Denaturierung bei 95 Grad/10 min und 40 Zyklen Zweischritt-PCR bei 95 Grad/15 s und 60 Grad/60 s. Die mRNA-Expressionsniveaus der interessierenden Gene wurden durch die 2-dCT-Methode auf das mRNA-Expressionsniveau des Actb als Referenzgen normalisiert.

2.6. Genomische DNA-Isolierung und Bisulfit-Umwandlung von DNA.Genomische DNA wurde mit dem Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB)-Ansatz [26] gemäß dem Protokoll zur DNA-Extraktion aus Säugetiergewebe (online verfügbar unter https://bomb.bio/protocols/) isoliert. Genomische DNA wurde dem BOMB-Bisulfit-Konversionsprotokoll unterzogen (online verfügbar unter https://bomb.bio/protocols/) [26].

2.7.Messung des globalen Niveaus der DNA-Methylierung.Die globalen DNA-Methylierungsgrade wurden mit dem 5-mC DNA ELISA-Kit (Zymo Research, Kalifornien, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Gereinigte genomische DNA (100 ng), isoliert ausNierenaus allen experimentellen Gruppen wurde verwendet, und jede Probe wurde doppelt getestet. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung von Einweg-ANOVA mit Blockierung geschätzt, wobei jede ELISA-Platte als Block behandelt wurde.

2.8.Methylierungsspezifische PCR (MSP).Primerpaare für die MSP-Analyse, die auf der Promotorregion von Col4a1 entworfen wurden, die die Transkriptionsstartstelle (TSS) umfasst, wurden unter Verwendung von MethPrimer (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi) entworfen (Ergänzungstabelle S2 ). Die Positionen der Primer (relativ zu TSS für Col4a1, markiert als plus 1), die für die MSP-Analyse verwendet werden, sind wie folgt: M fw (-35, -14), M rev (plus 44, plus 64), U fw (-35, -14) und U rev (plus 45, plus 69). Da jeder Primer 2 CpGs abdeckt, wurden insgesamt 4 CpGs auf den Methylierungsstatus pro Primerpaar getestet. Das Reaktionsgemisch für MSP enthielt Maxima SYBR Green/ROX qPCRqRT-PCR Master Mix (Fermentas), 2 0 ng Bisulfit-konvertierte DNA und 0,5 μM jedes Primers, der für methylierte (M) und unmethylierte (U) DNA spezifisch ist bei einem Endvolumen von 10 μL. MSP wurde auf dem QuantStudio 3 Real-Time PCR-System (Applied Biosystems) durchgeführt. Die PCR-Zyklusbedingungen waren wie folgt: anfängliche Denaturierungsschritte bei 95 Grad/10 min und gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 Grad/15 s und Annealing und Elongation bei 58 Grad/60 s. Der relative Gehalt an methylierter DNA wurde unter Verwendung des Methylierungsindex ausgedrückt, der als 2 (demethylierter Zyklus Ct) – (methylierter Zyklus Ct) definiert ist [27].

2.9.Statistische Analyse.Die Daten wurden als Mittelwert ± SD (Standardabweichung) für alle untersuchten Parameter ausgedrückt. Der Student's t-Test wurde verwendet, um Mittelwerte von normalverteilten Variablen zwischen zwei Gruppen zu vergleichen. Statistische Unterschiede zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) analysiert, gefolgt von einem Tukey-Mehrfachvergleichstest unter Verwendung der GraphPad Prism Software, Ver. 5.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

3. Ergebnisse

3.1. Wirkung von ALA auf biochemische Indizes bei diabetischen Ratten.Glukose, Triglyceride, Harnstoff und Kreatinin wurden im Serum von Kontroll-, diabetischen und ALA-behandelten nicht-diabetischen und diabetischen Ratten bestimmt (Fig. 1). Der diabetische Zustand wurde 4 Wochen und 8 Wochen lang verfolgt, um den Zeitverlauf einzuschließen, der notwendig ist, damit sich nachteilige Prozesse manifestieren. Beide Gruppen diabetischer Ratten waren durch Hyperglykämie, ansteigende Tendenzen der Triglyceride und des Kreatininspiegels, jedoch ohne statistische Signifikanz, und durch signifikant erhöhte Harnstoffspiegel gekennzeichnet. Bei diabetischen Ratten führte eine 4-wöchige ALA-Behandlung zu einer Abnahme des Serumglukosespiegels auf den Kontrollwert, während nach 8 Wochen der Glukosespiegel abfiel, aber im Vergleich zu den Kontrollen immer noch signifikant erhöht blieb. In beiden mit ALA behandelten Diabetikergruppen waren Triglyceride und Kreatinin nicht signifikant verändert. Die Behandlung mit ALA senkte den Harnstoffspiegel von diabetischen Ratten nach 4 Wochen signifikant, während nach 8 Wochen der Harnstoff-Serumspiegel von diabetischen Ratten im Vergleich zu diabetischen Kontrollen abnahm, jedoch ohne statistische Signifikanz. Die Verabreichung von ALA an Kontrollratten beeinflusste die untersuchten biochemischen Parameter nicht signifikant.

3.2.Morphologische Bewertung der Nierenstruktur und CML-Bildung nach ALA-Behandlung.Die PAS-Färbung hob die charakteristischen histopathologischen Merkmale der Niere hervor, die mit Diabetes assoziiert sind (Abbildung 2(a)). Eine Verdickung der glomerulären Basalmembran trat nach 4 Wochen Diabetesbeginn auf, während mesangiale Matrixexpansion und Tubuli mit erweitertem Lumen nach 8 Wochen Diabetesbeginn beobachtet wurden. Die histologische Analyse zeigte, dass die Bereiche der tubulären Lumen-, glomerulären und mesangialen Matrix bei 8 Wochen diabetischen Ratten im Vergleich zu Kontroll- und ALA-behandelten Kontrollratten signifikant zunahmen. Nach der ALA-Behandlung nahmen die tubuläre Dilatation und die mesangiale Matrixexpansion jedoch signifikant ab, blieben aber immer noch über den Kontrollwerten, während der glomeruläre Bereich vollständig auf die Kontrollwerte zurückkehrte. Bei mit ALA behandelten Kontrollratten wurde festgestellt, dass die mesangiale Matrixfraktion erhöht war, was darauf hindeutet, dass die Langzeitanwendung von ALA einige der strukturellen Merkmale in der Matrix beeinflussen könnteNieren(Abbildung 2(a)).

AGEs sind pathogene Faktoren, die zur Nierenschädigung bei Diabetes beitragen. Um zu untersuchen, ob ALA die Akkumulation von AGE-Produkten in derNierenvon diabetischen Ratten wurde der CML-Nierengehalt durch immunhistochemische Färbung in diabetischen Kontrollratten (4 und 8 Wochen) und ALA-behandelten Kontroll- und diabetischen Ratten (4 und 8 Wochen) bestimmt (Fig. 2(b)). Die Färbung auf CML war in beiden Gruppen von diabetischen Ratten positiv, was zeigt, dass sich CML hauptsächlich im Tubulointerstitium und in geringerem Ausmaß in den Glomeruli ansammelt. Gemäß der Quantifizierung des CML-Gehalts waren diese Veränderungen im Vergleich zu entsprechenden Kontrollen statistisch signifikant (Abbildung 2(b)). Nach der ALA-Behandlung von diabetischen Ratten (4 und 8 Wochen) nahmen sowohl die tubulointerstitielle als auch die glomeruläre CML-Immunreaktivität deutlich ab, während bei den mit ALA behandelten Kontrollratten die CML-Positivität wie bei den Kontrollen nicht nachweisbar blieb.

3.3. Die Wirkung von ALA auf die Kollagenablagerung und die Col4a1-Genexpression.Die Masson-Trichrom-Färbung zeigte eine Kollagenablagerung in tubulointerstitiellen Bereichen und innerhalb der Glomeruli, insbesondere in Basalmembranen beider Kompartimente in Rattengruppen mit Diabetes (4 und 8 Wochen) (Fig. 3(a)). Die ALA-Behandlung (4 und 8 Wochen) von nichtdiabetischen Ratten war auch mit einer erhöhten Kollagenablagerung verbunden, die durch glomeruläre und tubulointerstitielle Bereiche gekennzeichnet war, die von der mit Kollagen gefärbten Matrix besetzt waren, jedoch ohne statistische Signifikanz. Bei mit ALA behandelten diabetischen Ratten (4 und 8 Wochen) blieb die Kollagenablagerung hartnäckig, da eine signifikante Abnahme im Vergleich zu diabetischen Ratten nicht festgestellt wurde. Um den Anstieg der Kollagensynthese zu verifizieren, wurde das Ausmaß der Col4a1-Genexpression durch RT-PCR bewertet (Abbildung 3(b)). Eine signifikante Erhöhung der Col4a1-Genexpression in den Nieren von diabetischen Ratten zu beiden Zeitpunkten sowie in den Nieren von mit ALA behandelten diabetischen und nicht-diabetischen Ratten aus beiden Versuchsgruppen (4 und 8 Wochen) wurde im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollen nachgewiesen .

3.4.Profibrotische Veränderungen im Zusammenhang mit Diabetes und ALA-Behandlung.Die Western-Blot-Analyse ergab, dass sich der TGF- 1-Proteinspiegel nach 4 Wochen unabhängig von der Behandlung nicht signifikant veränderte (Abbildung 4(a)). Allerdings wurde nach 8 Wochen Diabetes eine statistisch signifikante Induktion des TGF- 1-Proteins festgestellt, die durch die ALA-Behandlung leicht reduziert wurde, aber im Vergleich zur Kontrolle signifikant erhöht blieb. Darüber hinaus wurde eine ähnliche Induktion von TGF- 1 bei nicht-diabetischen Tieren beobachtet, die mit ALA behandelt wurden (Fig. 4(a)). Um zu untersuchen, ob die TGF- 1-Induktion von dem Auftreten fibrotischer Marker begleitet wurde, wurde das Vorhandensein von SMA unter Verwendung von Western Blot analysiert (Fig. 4(b)). Der diabetische Zustand löste eine SMA-Expression aus, die ab der vierten Woche nach Beginn des Diabetes und danach nachgewiesen wurde. Die ALA-Behandlung von diabetischen Ratten reduzierte SMA nach 4 Wochen auf das Kontrollniveau, war aber nach 8 Wochen wirkungslos. Die ALA-Behandlung beeinflusste SMA bei nicht-diabetischen Ratten nach 4 Wochen nicht, während sie nach 8 Wochen zu einer erhöhten SMA-Expression im Vergleich zur Kontrolle führte, aber dieser Anstieg war statistisch nicht signifikant (Abbildung 4(b)).

Die Behandlung von nicht-diabetischen Ratten mit ALA führte zu ähnlichen Prägungen bezüglich profibrotischer Merkmale im Vergleich zu diabetischen Ratten, was auf die Notwendigkeit hindeutet, die Mechanismen aufzudecken, die den beobachteten fibrotischen Veränderungen in den Nieren von nicht-diabetischen Ratten zugrunde liegen, die mit ALA behandelt wurden. Um die Möglichkeit zu untersuchen, dass epigenetische Modifikationen zusätzliche Mechanismen darstellen, die an der beobachteten ALA-induzierten profibrotischen Landschaft bei nicht-diabetischen Ratten beteiligt sind, in einer besonderen Erhöhung der Col4a1-Expression, wurden Nieren von Kontroll- und ALA-behandelten nicht-diabetischen Ratten einer weiteren Analyse des DNA-Methylierungsstatus unterzogen .

3.5. Der Einfluss von ALA auf den DNA-Methylierungsstatus.Das globale Niveau der DNA-Methylierung und Genexpression der Hauptakteure, die an der DNA-Methylierung (Dnmt1, Dnmt3a und Dnmt3b) und Demethylierung (Tet1) beteiligt sind, wurden in den Nieren von nicht-diabetischen Kontroll- und ALA-behandelten Ratten für 4 und 8 Wochen bewertet (Abbildung 5 ). Nur der Tet1-mRNA-Spiegel zeigte nach 8-wöchiger ALA-Behandlung einen statistisch signifikanten Anstieg, während die Expression von Dnmts und das globale Niveau der DNA-Methylierung weder nach 4 noch nach 8-wöchiger ALA-Behandlung im Vergleich zu den Kontrollen einen signifikanten Unterschied zeigten.

Das nächste Experiment war auf die Untersuchung des lokalen Niveaus der DNA-Methylierung des Col4a1-Gens gerichtet. Die Hauptform von Kollagen IV enthält zwei 1(IV)-Ketten und eine 2(IV)-Kette, die von Col4a1- und Col4a2-Genen codiert werden, die in Kopf-an-Kopf-Orientierung angeordnet sind und eine einzigartige Transkriptionseinheit bilden und in unterschiedliche Richtungen von der gegenseitigen transkribiert werden Promoter [17]. Col4a1 wird aus der 130 bp langen intergenischen Region transkribiert, die zwei Sp1-Stellen, CAAT- und CTC-Boxen enthält [17] (Abbildung 6(a)). Der DNA-Methylierungsstatus des Col4a1/Col4a2-Promotors wurde mittels MSP-Analyse bewertet, und die Position der Primer ist in Abbildung 6(a) gezeigt. Beide Primerpaare, spezifisch für methylierte und für unmethylierte DNA, deckten 2 CpGs pro Primer ab. Die Ergebnisse der MSP zeigten, dass ALA den Methylierungsstatus des Col4a1/Col4a2-Promotors nach einer 4- einwöchigen Behandlung nicht beeinflusste (Abbildung 6(b)). Jedoch wurde nach 8 Wochen ALA-Behandlung eine statistisch signifikante Abnahme des DNA-Methylierungsindex beobachtet (Fig. 6(b)), was auf das Potenzial von ALA hindeutet, die Col4a1-Expression durch Veränderung des DNA-Methylierungsmusters seines Promotors zu modulieren.

4. Diskussion

Aufgrund des epidemischen Anteils von Diabetes wird die DKD weltweit zur häufigsten Ursache für terminale Niereninsuffizienz und zum aussagekräftigsten Faktor für vorzeitige Sterblichkeit bei Patienten mit Diabetes [28, 29]. Die Inzidenz der DKD bei Diabetikern hat sich in den vergangenen Jahrzehnten trotz intensiver blutzuckerkontrollierender Behandlung nicht verringert [28, 30]. Zu den potenziellen Behandlungsstrategien, die einen Nutzen gegen DKD gezeigt haben, gehört das Targeting von oxidativem Stress, und in dieser Zeit wurde festgestellt, dass ALA die Nierenfunktion bei Diabetes verbessern kann [29, 31, 32]. Die in der vorliegenden Studie erhaltenen Ergebnisse bestätigten hypoglykämische Wirkungen von ALA, zeigten jedoch eine Unwirksamkeit von ALA gegen gestörte Harnstoffspiegel bei Langzeitdiabetes.

Ein Anstieg der Glykämie allein oder in Kombination mit oxidativem Stress ist einer der Mechanismen, die an der Bildung von AGEs beteiligt sind, deren Akkumulation in glomerulären und tubulointerstitiellen Kompartimenten mit dem Grad der Nierenschädigung in einem experimentellen Modellsystem der diabetischen Nephropathie korreliert wurde [33, 34] . CML ist eines der wichtigsten AGEs in vivo [35], dessen Spiegel im Kreislauf und in den Organen einschließlich der Nieren von Diabetikern ansteigt [36], was eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der diabetischen Nephropathie spielt [37]. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sich die CML-Ablagerung hauptsächlich im tubulointerstitiellen und in geringerem Ausmaß im glomerulären Kompartiment der diabetischen Rattenniere ansammelt, die nach der ALA-Behandlung deutlich abnahm. Nach publizierten Daten könnten mit CML angereicherte Tubuli das am schwersten verletzte Nierenkompartiment sein [38–40]. Im Gegensatz zu unserem Ergebnis wurden begrenzte Auswirkungen von ALA auf den CML-Gehalt bei diabetischen Ratten beschrieben, die sowohl durch Immunfärbung als auch durch chemische Analyse nachgewiesen wurden [40], und diese Widersprüchlichkeit kann sich aus dem experimentellen Design der Studie ergeben.

Die histologische Analyse einer Nierenstruktur durch PAS-Färbung bestätigte die Schutzwirkung von ALA bei Diabetes. Die vorteilhaften antioxidativen Wirkungen von ALA gegen Diabetes-induzierte oxidative Schäden in den Nieren waren gut etabliert [22, 31, 32]. Es wurde festgestellt, dass die Behandlung mit ALA Niereninsuffizienz vorbeugt und pathologische Veränderungen der Nierenstruktur einschließlich Expansion der glomerulären mesangialen Matrix und Glomerulosklerose aufgrund ihres kombinierten antioxidativen und hypoglykämischen Potenzials lindert [21, 22]. In Anbetracht dessen, dass hohe Glukose, oxidativer Stress und die Bildung von AGEs als wichtige Faktoren für die Induktion profibrotischer Veränderungen in der Niere anerkannt sind [41], sprechen gut etablierte antioxidative und hypoglykämische Wirkungen und die Fähigkeit von ALA, den CML-Gehalt zu reduzieren, stark für die Potenzial von ALA zur Linderung fibrotischer Prozesse in diabetischen Nieren. Unsere Ergebnisse zeigten jedoch, dass sich in Masson-gefärbten Schnitten von Nierengewebe der Grad der Kollagenfaserablagerung nach der ALA-Behandlung von diabetischen Ratten nicht signifikant veränderte. Darüber hinaus zeigte die ALA-Behandlung die Tendenz, die Kollagensynthese/den Kollagengehalt bei nicht-diabetischen Ratten zu erhöhen. In Übereinstimmung mit unseren Erkenntnissen wurde über die nachteiligen Wirkungen von ALA auf kontrollierte/gesunde Nieren berichtet [42]. Bei der Untersuchung der renoprotektiven Mechanismen von ALA bei diabetischer Nephropathie entdeckten die Autoren unerwartet, dass die Behandlung mit ALA mit der Entwicklung von Glomerulosklerose, tubulointerstitieller Fibrose und einer Abnahme der Nierenfunktion in den nichtdiabetischen Nieren verbunden war. Unabhängige Studien haben gezeigt, dass höhere Dosen von ALA bei gealterten Ratten oxidative Proteinschäden hervorrufen [43] und sogar eine Abnahme der Nierenfunktion bei Diabetes [40]. Dementsprechend wurde die prooxidative Wirkung von ALA nicht nur in Tierstudien nachgewiesen, sondern auch bei Patienten mit Nierenerkrankungen im Endstadium, die intravenöses Eisen erhielten [44].

Im Zusammenhang mit den beobachteten Wirkungen von ALA auf die Kollagenablagerung zeigten unsere Ergebnisse zusätzlich, dass ALA bei diabetischen Ratten nach 8 Wochen die Konzentration von zwei fibrotischen Markern, TGF- 1 und -SMA, nicht senkte und sogar TGF induzierte - 1-Expression bei nichtdiabetischen Ratten nach 8-wöchiger Behandlung. Dementsprechend war die Genexpression von Kollagen Typ IV sowohl bei diabetischen als auch bei den mit ALA behandelten diabetischen und nichtdiabetischen Ratten signifikant höher im Vergleich zu den Kontrollen. Zuvor wurde gezeigt, dass oxidativer Stress TGF- 1 und seine nachgeschalteten Zielgene wie Kollagen Typ I, III und IV sowie Fibronektin induziert [9, 45] und dass Antioxidantien TGF{{ 10}} Ausdruck [46]. Im Gegensatz zur allgemeinen Vorstellung von der schützenden und antifibrotischen Rolle von Antioxidantien deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass ALA mehrere Auswirkungen auf Faktoren haben könnte, die am fibrotischen Prozess in diabetischen Nieren beteiligt sind. Es scheint, dass ALA spezifisch die Expression einiger Fibrose-assoziierter Gene wie TGFB1 und insbesondere Col4a1 induziert, deren erhöhte Expression bereits nach 4-wöchiger ALA-Behandlung in diabetischen und nicht-diabetischen Nieren nachgewiesen wurde. Eine verstärkte Expression und Ablagerung von Kollagen Typ I wurde nach ALA-Behandlung in humanen dermalen Fibroblasten beobachtet [24]. Die Studie ergab, dass die Hochregulierung von Kollagen Typ I aus der nachgeschalteten TGF-Rezeptor-I-Signalübertragung resultiert, was auf eine neuartige pharmakologische Wirkung von ALA hindeutet, die an der Hautalterung beteiligt ist. In Anbetracht der hier vorgestellten Ergebnisse könnte die Hochregulierung von Kollagen eher eine übliche Zellreaktion auf ALA sein als ein spezifischer Mechanismus, der für dermale Fibroblasten charakteristisch ist.

Die Kollagen-Typ-IV-Synthese wird auf gut etablierten transkriptionellen, posttranskriptionellen und posttranslationalen Ebenen reguliert, aber es entstehen weitere Daten zur Rolle der DNA-Methylierung bei der Col4a1-Expression. Eine vor 40 Jahren durchgeführte Studie ergab, dass die Behandlung von F9-Teratokarzinomzellen mit dem DNA-Demethylierungsmittel 5- Azacytidin zu einer erhöhten Col4a1-Expression führt, was zum ersten Mal darauf hindeutet, dass DNA-Methylierung eine wichtige Rolle bei seiner Expression spielen könnte [47]. Menschliche Methylom- und Transkriptomstudien zeigten eine Korrelation zwischen der Methylierung des Col4a1-Promotors und seiner Expression in gesunden und zur Produktion von ECM-Proteinen aktivierten Leberzellen [20, 48]. Dasselbe wurde in mesangialen Zellen gefunden, wo nach 5-Azacytidin-Behandlung die Col4a1-mRNA-Spiegel signifikant anstiegen [49]. Darüber hinaus wurde bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung der DNA-Methylierungsgrad der Col4a1- und Col4a2-Gene als signifikant niedriger im Vergleich zu gesunden Probanden und in Korrelation mit erhöhter mRNA- und Proteinexpression festgestellt [50]. Unsere Ergebnisse bestätigten starke Beweise für die Regulierung der Col4a1-Expression durch DNA-Methylierung, da wir herausfanden, dass die Col4a1-Expression mit dem Methylierungsstatus seines Promotors in der Niere korreliert. Es sollte beachtet werden, dass die beobachteten Änderungen im Methylierungsstatus des Col4a1-Promotors höchstwahrscheinlich auch die Expression von Col4a2 beeinflussen, da zwei Gene über eine gemeinsame bidirektionale Promotorregion reguliert werden. Die in unseren Experimenten verwendeten MSP-Primer wurden so gestaltet, dass sie sich teilweise mit zwei Sp1-Bindungsstellen überlappen, und eine Abnahme der DNA-Methylierung, die wir nach der ALA-Behandlung beobachteten, könnte die verbesserte Bindung von Sp1 und die Hochregulierung der Col4a1-Expression widerspiegeln.

Unsere Ergebnisse, dass die Col4a1-Expression und ihr Methylierungsstatus bei nicht-diabetischen Tieren nach 8-wöchiger ALA-Behandlung anfällig für ALA-Aktionen sind, deuten zusätzlich auf das Potenzial von ALA hin, auch als epigenetischer Regulator zu fungieren. Gemäß unseren Ergebnissen beeinflusste ALA das Tet1-Enzym nach 8-wöchiger Behandlung in Richtung einer erhöhten Expression, was auf die Möglichkeit hindeutet, dass eine genspezifische Demethylierung ohne nachweisbaren Nettoeffekt auf die genomweite DNA-Methylierung auftreten könnte. Obwohl es eine Korrelation zwischen erhöhter Expression von Col4a1 und verringerter Methylierung seines Promotors nach 8-wöchiger ALA-Behandlung gibt, ist es dennoch schwierig, eindeutig davon auszugehen, dass DNA-Demethylierung der einzige kausale Zusammenhang zwischen ALA-Behandlung und erhöhter Kollagen-Genexpression ist nach 4 Wochen war eine erhöhte Expression von Col4a1 nicht mit einer Veränderung seines Methylierungsstatus verbunden. Die Fähigkeit von ALA, bestimmte Gene epigenetisch zu regulieren, wurde für die IL-1- und IL-6-Gene vorgeschlagen, deren herunterregulierte mRNA- und Proteinspiegel mit einer Hypermethylierung ihrer Promotorregionen assoziiert waren [51, 52]. Obwohl Hypermethylierung als einer der Mechanismen der ALA-Wirkung vorgeschlagen wurde, wurden die detaillierten Wege der epigenetischen Regulation, die von ALA gesteuert werden, noch nicht aufgeklärt und warten darauf, auch für die anderen Gene bestätigt zu werden. Daher erfordert die Verbindung zwischen erhöhter Kollagensynthese/-ablagerung, die zu einem pathologischen Phänotyp führen kann, und Tet-vermittelter DNA-Demethylierung des Col4a1-Promotors, die durch die ALA-Behandlung hervorgerufen wird, zusätzliche Beweise und sollte die Plattform für zukünftige Studien bieten.

5. Schlussfolgerungen

Die schützende Rolle von ALA gegen diabetesbedingte Fehlfunktionen verschiedener Organe, einschließlich der Nieren, wurde hauptsächlich seinen antioxidativen und hypoglykämischen Wirkungen zugeschrieben. Die in dieser Studie vorgestellten Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass der Nierenschutz bei Diabetes durch ALA aufgrund der erhöhten Kollagensynthese/-ablagerung in den Nieren eingeschränkt sein könnte. Durch die Analyse der Auswirkungen von ALA auf profibrotische Prozesse in diabetischen Rattennieren fanden wir heraus, dass ALA weder die Kollagensynthese noch profibrotische Marker reduzierte. Darüber hinaus trug die Behandlung mit ALA zu profibrotischen Ereignissen und zur Kollagensynthese selbst in nichtdiabetischen Rattennieren bei, was teilweise mit Änderungen des DNA-Methylierungsstatus des Col4a1-Gens zusammenhängt. Folglich ist bei Patienten mit Nierenfibrose Vorsicht bei der Anwendung von ALA geboten, um eine Verschlimmerung der bestehenden Nierenkomplikation zu vermeiden. Darüber hinaus ist Vorsicht geboten, wenn ALA zur Steigerung des antioxidativen Potenzials bei einer gesunden Person oder zur Behandlung anderer diabetischer Komplikationen verwendet werden soll, da vorteilhafte Wirkungen für eine Komplikation für die andere nachteilig sein könnten.

1Abteilung für Molekularbiologie, Institut für biologische Forschung „Siniša Stanković“, Nationales Institut der Republik Serbien, Universität Belgrad, Bulevar Despota Stefana 142, 11060 Belgrad, Serbien

2Abteilung für Zytologie, Institut für biologische Forschung „Siniša Stanković“, Nationales Institut der Republik Serbien,

Universität Belgrad, Bulevar Despota Stefana 142, 11060 Belgrad, Serbien

Die Korrespondenz ist an Aleksandra Uskoković zu richten; auskokovic@ibiss.bg.ac.rs

Eingegangen am 4. November 2020; Überarbeitet am 19. Februar 2021; Angenommen am 27. Februar 2021; Veröffentlicht am 12. März 2021

Akademischer Herausgeber: Alin Ciobica

Copyright © 2021 Nevena Grdović et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter der Creative Commons Attribution License vertrieben wird, die die uneingeschränkte Nutzung, Verbreitung und Vervielfältigung in jedem Medium erlaubt, vorausgesetzt, das Originalwerk wird ordnungsgemäß zitiert.

Datenverfügbarkeit

Alle relevanten Daten, die zur Untermauerung der Ergebnisse dieser Studie verwendet wurden, sind in dem Artikel enthalten.

Interessenskonflikte

Die Autoren erklären, dass bezüglich der Veröffentlichung dieses Papiers kein Interessenkonflikt besteht.

Autorenbeiträge

Konzeption und Design der Experimente: MM, NG, AU; Handhabung und Behandlung von Tieren: MĐ, JAJ, AU, SD; Durchgeführte histologische Analyse, Immunfärbung und Quantifizierung der Ergebnisse: JAJ, MĐ, ST. Durchgeführte Western-Blot-Analyse: AU, SD, NG; Durchgeführt die RTqPCR-Experimente: JR, MĐ; Führte die DNA-Methylierungsexperimente durch: JR, AT, MV; Statistische Analyse: NG; Interpretation der Daten und Aufbereitung der Abbildungen: NG, MM; Schrieb die Arbeit: NG, AU; Kritische Überarbeitung des Manuskripts: MV, SD. Alle Autoren genehmigten die endgültige Version zur Veröffentlichung.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft und technologische Entwicklung der Republik Serbien unterstützt (Grant Nr. 451-03-9/2021-14/200007).

Zusatzmaterialien

Ergänzende Tabelle S1: Sequenzen von Primern, die für die quantitative Echtzeit-PCR-Analyse von Col4a1 (Kollagen Typ IV alpha 1-Kette), Dnmt1 (DNA-Methyltransferase 1), Dnmt3a (DNA-Methyltransferase 3 alpha), Dnmt3b (DNA-Methyltransferase 3 beta), Tet1 verwendet wurden (Tet-Methylcytosin-Dioxygenase 1) und Actb (Actin, beta) Genexpression. Ergänzende Tabelle S2: Sequenzen von Primern für die MSP-Analyse der DNA-Methylierung der Promotorregion des Col4a1-Gens. Ergänzende Abbildung S1: Repräsentative Bilder des Immunoblots. Proteinspiegel von TGF- 1 (A) und SMA (B), zwei Fibrose-verwandten Proteinen, in Nieren von mit ALA behandelten oder nicht behandelten Kontroll- und diabetischen Ratten, 4 und 8 Wochen nach Diabetesinduktion, bestimmt durch Western Blot-Analyse. (Zusatzmaterialien)

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