Makrophagen-Depletion reduziert Krankheitspathologie bei Faktor-H-abhängiger Immunkomplex-vermittelter Glomerulonephritis Ⅱ

3. Ergebnisse

Wir induzierten CSS bei Mäusen durch wiederholte Immunisierung mit Pferdemilz-Apoferritin. Tiere erzeugen ein aktives humorales Antiapoferritin-IgG-ImmunsystemReaktion und Ablagerung von IgG in Glomeruli. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass Mϕ erhöht istInfiltration in die Nierenin dieser Einstellung.

3.1. Die Genexpression von Makrophagen ist in FH-abhängigen ICGN-Nieren erhöht. Um das Vorhandensein von Mϕs in FH-abhängigen ICGN-Nieren zu bewerten, wurde eine qRT-PCR mit M2-Makrophagenmarkern, CD204 (Mϕ-Scavenger-Rezeptor 1) und CD206 (Mϕ-Mannose-Rezeptor 1) durchgeführt [21–24]. Die Expression beider Gene in der Niere war nach der Apoferritin-Behandlung bei FHKO-Mäusen signifikant hochreguliert (Abbildung 1), was auf ein hindeuteterhöhtes Vorhandensein von Makrophagen in der Niere.

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3.2. Zeitliche Veränderungen durch Chlodronat-Behandlung bei der Infiltration von Nierenmakrophagen bei mit Apoferritin behandelten FHKO-Mäusen. Um die wirksame Methode zur Reduzierung von Mϕs in FH-abhängigem ICGN zu bestimmen, haben wir Mϕs in fh-/- Mäusen verringert

Abbildung 3: Ergänzende Daten. Angegeben sind die Durchflusszytometrieprofile von F4/80+-Monozyten der Kontrollmäuse und der mit Clodronat behandelten Mäuse. F4/80+-Zellen werden durch die Behandlung mit Clodronat deutlich reduziert und erreichen weniger als 10 %. Jeder Zeitpunkt n=6.

3.4. Makrophagen-Depletion reduziert glomeruläre

Pathologie im FH-vermittelten ICGN. Am Ende des Experiments wurden Immunkomplexablagerungen in der Niere und histopathologische Merkmale von ICGN bewertet. Die Immunfluoreszenzfärbung für C3 und IgG ergab, dass die Mϕ-Depletion die Immunkomplexe in dieser Situation nicht modulierte. Repräsentative Immunfluoreszenzfärbungen und Histopathologie sind in Abbildung 5 dargestellt. Das primäre histopathologische Merkmal war die diffuse Hyperzellularität der glomerulären Büschel bei fh-/- Mäusen, wobei CSS bei Erschöpfung von Mϕs signifikant reduziert wurde.

3.5. Makrophagen modulieren Zytokine in FH-abhängigem ICGN.

Einmal Mϕsin die Niere eindringenund entzündlichen Reizen ausgesetzt werden, setzen sie Zytokine frei. Wir untersuchten mittels ELISA die im Plasma zirkulierenden TNF- und IL-6-Spiegel sowie den Nieren-mCSF bei FHKO-Mäusen, die mit Kochsalzlösung, Apoferritin oder Apoferritin und Clodronat behandelt wurden. Die zirkulierenden IL-6-Spiegel waren bei Wildtyp-Mäusen sehr niedrig und bei FHKO-Mäusen erhöht und bei mit Clodronat behandelten FHKO-Mäusen verringert (Abbildung 6). Die drei Zytokine TNF, IL-6 und mCSF waren bei mit Apoferritin behandelten Mäusen im Vergleich zu mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollen signifikant erhöht. Die Mϕ-Depletion durch Clodronat begrenzte den Anstieg der Zytokine in dieser Situation deutlich

3.6. Makrophagen modulieren Profibrotik

Moleküle und Laminin im FH-abhängigen ICGN. Sobald dieNieren entwickeln eine Krankheit, sie neigen dazu, fibrotisch zu werden. Mϕs sind am fibrotischen Prozess beteiligt, indem sie profibrotische Moleküle überproduzieren. Die Echtzeit-PCR ergab einen Anstieg der mRNA-Expression des transformierenden Wachstumsfaktors Beta1 (TGFbeta1) um 75 %, einen Anstieg der Metalloproteinase-9 (MMP9)-Expression um 100 % und einen Anstieg der Laminin-mRNA um 230 %. Im Einklang mit der mRNA-Expression ist die Laminin-Proteinexpression in den fh-/--Mäusen mit CSS signifikant erhöht, die in Abwesenheit von Mϕs verringert war (Abbildung 7).

4. Diskussion

Unsere jüngsten Studien haben gezeigt, dass sich Mäuse in Abwesenheit von FH diffus entwickelnproliferative Glomerulonephritis(GN) mit F4/80+ Mϕs um Standorte von ICs [10]. Darüber hinaus zeigen unsere Studien, dass Cd11b-/-fh-/-Mäuse verstärkte Merkmale der Glomerulonephritis aufweisen [26]. Angesichts der Tatsache, dass das Vorhandensein einer erhöhten Anzahl entzündlicher M1-Makrophagen und deren anhaltende Aktivierung eine Gewebepathologie verursachen könnten und ihre Repolarisierung in den entzündungshemmenden Phänotyp zur Auflösung der Krankheitspathologie beitragen würde, wurde die aktuelle Studie durchgeführt, um die Rolle von Mϕs bei fh besser zu verstehen -/- Mäuse mit ICGN. Das erhöhte Vorhandensein von Mϕs in der Niere und die Auflösung der Krankheitspathologie durch Depletion von Makrophagen während der FH-vermittelten ICGN zeigen die entscheidende Rolle von Mϕs in diesem Umfeld und könnten daher als wichtige therapeutische Ziele in diesem Umfeld dienen.

Abbildung 5: Mϕs-Depletion reduziert die glomeruläre Pathologie bei FH-abhängigem ICGN. Angegeben sind repräsentative Bilder von Glomeruli von mit Kochsalzlösung behandelten (a), Apoferritin-behandelten (b) und Apoferritin+Clodronat-behandelten FH-defizienten Mäusen. In (A) sind die Schnitte mit C3 (grün) und IgG (rot) gefärbt, während (B) mit PAS gefärbte Schnitte zeigt. Die durch die Apoferritin-Behandlung erhöhten IgG-Ablagerungen blieben unverändert, während die Glomeruli bei Makrophagen-Depletion eher normal aussahen.

Das Fehlen von FH führt zu einer erhöhten C5a-Produktion. C5a bindet an C5aR1 und signalisiert Mos an die Niere, wo es zum Entzündungsmilieu beiträgt. Darüber hinaus haben unsere Studien auch gezeigt, dass in dieser Situation einer übermäßigen C5a-Erzeugung die Inaktivierung von C5a die Krankheit zu begrenzen scheint [10]. Die Aktivierung von Mos führt dazu, dass sie polarisiert werden, aber sie bleiben in einem Kontinuumszustand [27]. Unsere Ergebnisse in dieser Studie zeigen, dass die glomeruläre Erkrankung bei CSS bei fh-/−-Mäusen, bei denen Mϕs erschöpft waren, im Vergleich zu fh-/- Mäusen ohne Makrophagenverarmung reduziert war. Somit reduziert die Eliminierung von Mϕs-lindertem ICGN in fh-/−-Mäusen die Krankheitspathologie. Mϕs sind jedoch auch für den Reparaturprozess notwendig, und da Mϕs ihren Zustand von pro-in entzündungshemmenden Zuständen und umgekehrt ändern, wird es unser zukünftiges Bestreben sein zu verstehen, ob eine Veränderung der Mϕs-Landschaft ohne deren Erschöpfung die Krankheitspathologie verändern könnte.

Mϕs spielen eine wichtige Rolle bei der Auslösung und Aufrechterhaltung der Fibrose und sind auch an der Unterdrückung, Auflösung und Umkehrung der Fibrose beteiligt [28]. Unsere Ergebnisse zeigen eine erhöhte Expression von CD204+- und CD206+-Mϕ-Markern, was auf deren erhöhte Präsenz in dieser Umgebung schließen lässt. Da diese Mϕs eine Hauptquelle profibrotischer Moleküle sind, legen unsere Ergebnisse, die einen Anstieg von TGF -1 und MMP9 zeigen, nahe, dass diese Mϕs über verschiedene Mechanismen sowohl direkt als auch indirekt zu fibrotischen Prozessen in FH-vermitteltem ICGN beitragen könnten ( 1,3,8,44). TGF -1 kann die Fibrose durch Zytokinregulation verändern. Darüber hinaus moduliert TGF -1 die Biosynthese und Expression von C3 und Faktor B in Monozyten [29], und eine Veränderung des Komplements in den Immunzellen und Nierenzellen kann die Gewebefibrose erleichtern [30]. Allerdings müssen die genauen Wechselwirkungen zwischen Makrophagen und Komplement, die beteiligten Mechanismen, ihre Rollen und die Gewebekompartimentierung noch entschlüsselt werden [31]. Unsere Studien zeigten eine verringerte Lamininexpression bei Mäusen mit Mϕs-Mangel im Vergleich zu Mäusen mit Mϕs-Mangel. Um besser zu verstehen, wie FH den fibrotischen Prozess reguliert, müssen wir die spezifischen Mϕ-Untergruppen identifizieren, die in FH-vermitteltem ICGN vorhanden sind, und die Beiträge jeder Untergruppenpopulation erläutern. Diese Studien sind wichtig, da komplementäre Therapeutika zur klinischen Realität geworden sind. Gegen verschiedene Ziele in der Komplementkaskade wurden und werden weiterhin Inhibitoren entwickelt, die die nachgeschalteten Schritte in den Aktivierungswegen blockieren. Derzeit ist einer der Komplementinhibitoren im klinischen Einsatz der Anti-C5-Antikörper Eculizumab [32]. Daher ist es keine triviale Angelegenheit, die pathogenen Komplementkomponenten der Krankheit zu identifizieren und diese durch die Regulierung der Mϕs-Population zu ergänzen.

Abbildung 7: Laminin-Ablagerung inFH-defiziente Nierenmit ICGN wird durch Mϕs-Erschöpfung reduziert. (a) qRT-PCR für TGFB, MMP9 und Laminin aus demNieren-mRNAisoliert aus Mäusen nach 5 Wochen Kochsalzlösung und Apoferritin und 3 Wochen Clodronat. Der Ausdruck wird auf GAPDH (n=6/Gruppe) normalisiert. (b) Repräsentative IF-Mikrofotografien für die Lamininfärbung in den Nieren derselben Mäusegruppen. ∗P < 0:01.

Zusammenfassend haben wir hier die Rolle von Mϕs im FH-abhängigen ICGN-Modell untersucht. Die Ergebnisse können auch in Situationen unregulierter Komplementaktivierung mit Immunkomplexen angewendet werden, wie sie bei verschiedenen Krankheiten wie Lupusnephritis, IgA-Nephropathie und membranöser Nephropathie beobachtet werden. Wir zeigen die Bedeutung sowohl der Komplementregulierung durch FH als auch des Mϕs-Status bei der Krankheit. Daher hat das pharmakologische Targeting der Komplementkaskade und des Mϕs-Status bei IC-vermitteltem GN potenzielle klinische Relevanz.

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