Mahanimbin verbesserte altersbedingte Gedächtnisdefizite bei Mäusen durch verbesserte cholinerge Übertragung und unterdrückte oxidativen Stress, Amyloidspiegel und Neuroinflammation Teil 2

2.6. Bewertung der Malondialdehyd- (MDA) und Glutathion- (GSH)-Spiegel

Unter Verwendung kommerziell erhältlicher Kits wurden die MDA- und GSH-Spiegel in Gehirnproben analysiert (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA).

Während Wissenschaft und Technologie immer weiter voranschreiten, versuchen Wissenschaftler, die Geheimnisse mysteriöser und wichtiger menschlicher psychologischer Aktivitäten wie Gedächtnis, Denken und Bewusstsein aufzudecken. Unter diesen gilt die Untersuchung von Gehirnproben als besonders besorgniserregend, da sie uns helfen kann, die Beziehung zwischen Gedächtnis und Gehirn besser zu verstehen.

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Was ist eine Gehirnprobe? Einfach ausgedrückt handelt es sich dabei um eine Methode zur Erfassung, Erhaltung und Analyse von Neuronen (Gehirnzellen) und ihren Verbindungen im Gehirn. Laienhaft ausgedrückt ist es wie eine Karte des Gehirns, die die Verbindungen und Funktionen zwischen verschiedenen Bereichen aufzeigen kann.

Lassen Sie uns als Nächstes über die Beziehung zwischen Gehirnproben und Gedächtnis sprechen. Wissenschaftliche Untersuchungen haben gezeigt, dass unser Gedächtnis eng mit der Gehirnstruktur zusammenhängt. Wenn wir neues Wissen lernen, werden im Gehirn neue neuronale Verbindungen gebildet, und diese Verbindungen werden mit der Zeit stärker. Durch die Untersuchung von Gehirnproben arbeiten Wissenschaftler hart daran, diese Gehirnverbindungen zu untersuchen und zu verstehen, wie man dadurch das Lernen und das Gedächtnis verbessern kann.

Darüber hinaus können Wissenschaftler durch die Analyse von Gehirnproben auch einige interessante Dinge herausfinden. Sie fanden beispielsweise heraus, dass der Hippocampus im menschlichen Gehirn ein Bereich ist, der eng mit dem Gedächtnis zusammenhängt. Dies liegt daran, dass der Hippocampus im menschlichen Gehirn eine wichtige Funktion hat, nämlich die Umwandlung von Informationen aus dem Kurzzeitgedächtnis in das Langzeitgedächtnis.

Daher besteht der Wert der Gehirnprobenforschung nicht nur darin, uns dabei zu helfen, die Beziehung zwischen Gehirn und Gedächtnis besser zu verstehen, sondern auch darin, die Grundursachen von Gedächtnisstörungen oder kognitiven Krankheiten zu entdecken und so die Behandlung und Prävention damit verbundener Krankheiten zu fördern.

Abschließend sollten wir die Hilfe der Gehirnprobenforschung zum Gedächtnis positiv bewerten. Obwohl es noch viele wissenschaftliche Probleme zu lösen gibt, glauben wir, dass es mit der kontinuierlichen Verbesserung von Wissenschaft und Technologie in Zukunft weitere Durchbrüche geben wird. Lassen Sie uns gemeinsam in die Zukunft blicken und freuen uns darauf, unser Gehirn durch wissenschaftliche Forschung intelligenter zu machen! Es ist ersichtlich, dass wir das Gedächtnis verbessern müssen. Cistanche kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche antioxidative, entzündungshemmende und Anti-Aging-Wirkungen hat, die dazu beitragen können, oxidative und entzündliche Reaktionen im Gehirn zu reduzieren und so die Gesundheit des Nervensystems zu schützen. Darüber hinaus kann Cistanche auch das Wachstum und die Reparatur von Nervenzellen fördern und dadurch die Konnektivität und Funktion neuronaler Netzwerke verbessern. Diese Effekte können dazu beitragen, das Gedächtnis, die Lernfähigkeit und die Denkgeschwindigkeit zu verbessern und können auch das Auftreten kognitiver Dysfunktionen und neurodegenerativer Erkrankungen verhindern.

Die MDA- und GSH-Werte wurden entsprechend in Nanomol/Milligramm Protein bzw. Mikromol/Milligramm Protein gemessen. Zur Schätzung des Proteingehalts im Gehirngewebe wurde die Bradford-Technik angewendet.

2.7. Schätzung der Aktivitäten von Acetylcholin (ACh) und Acetylcholinesterase (AChE).

Die ACh- und AChE-Spiegel im Gehirnhomogenisat wurden mit kommerziell erhältlichen Kits (BioAssay System, Hayward, CA, USA) analysiert, nämlich dem EnzyChromTM AcetylcholineAssay Kit bzw. dem QuantiChromTM Acetylcholinesterase Assay Kit.

Die Intensität der Farbbildung wurde in einem Mikroplatten-Lesegerät bei 570 bzw. 412 nm erfasst. Der erhaltene ACh-Wert wurde in µM ausgedrückt, wohingegen die AChE-Aktivität als U/L ausgedrückt wurde.

2.8. Messung des Amyloidspiegels

Die ELISA-Kits von Cloud Clone Corp (Katy, TX, USA) wurden verwendet, um die Konzentrationen von A 1-40 und A 1-42 in Gehirnhomogenaten zu bewerten. Zur Messung der Farbbildung wurde ein auf 450 nm eingestelltes Mikroplattenlesegerät verwendet.

Die Konzentration von A 1-40 und A 1-42 in der Probe war umgekehrt proportional zur Farbintensität. Die Ergebnisse wurden in pg/ml Gesamtprotein dargestellt.

2.9. Bewertung der -Sekretase (BACE-1)-Aktivität im Gehirn von Mäusen

Die BACE-1-Aktivität im Homogenat wurde mit einem kommerziell erhältlichen Kit (SensoLyte® -Secretase Assay Kit von AnaSpec, Fremont, CA, USA) quantifiziert. Der Nachweis des Kits basiert auf einem Peptid, das durch BACE-1 gespalten wird, und das Signal wird mit einem Aspectrophotometer mit Anregung/Emission bei 490/520 nm nachgewiesen.

2.10. Messung der Gesamtaktivität der Cyclooxygenase (COX).

Die Aktivität von Gesamt-COX im Gehirnhomogenat wurde mithilfe eines ELISA-Kits (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA) geschätzt. Die Farbbildung war direkt proportional zur gesamten COX-Aktivität. Zum Ablesen der Extinktion bei 590 nm wurde ein Mikroplatten-Lesegerät verwendet.

2.11. Genexpression von BACE-1 und COX-2

Die Expression von BACE-1 und COX-2 in isolierter Gehirn-RNA wurde mittels RT-PCR analysiert. Die drei wichtigsten Schritte waren: RNA-Extraktion, Umwandlung von RNA in cDNA und Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR).

Alle Schritte umfassten Kits, bereitgestellt von Qiagen Valencia, CA, USA. Zunächst wurde RNA aus der in der RNA konservierten Gehirnprobe extrahiert. In diesem Schritt wurden etwa 100 mg Hirngewebeprobe mit einem TissueRuptor in 1 ml QIAzol-Lysereagenz homogenisiert und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.

Die Mischung aus Gehirnlysat und QIAzol-Lysereagenz wurde mit Chloroform versetzt und 15 Sekunden lang kräftig geschüttelt, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur für 2–3 Minuten.

Die Mischung wurde bei 12,000× g 15 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert, und die drei Phasen bildeten eine farblose Phase (obere Phase), die aus RNA bestand und mit der Zugabe von 1 Volumen 70 % Ethanol gesammelt wurde Es.

Als nächstes wurden 700 µL der Probe in eine Spin-Säule überführt und 15 s lang bei Raumtemperatur und 8000 x g zentrifugiert; der Durchfluss wurde verworfen. Nach der Zugabe von 700 µL Puffer RW1 (im Kit enthalten) und einer 15-sekündigen Zentrifugation bei 8000 x g wurde der Durchfluss verworfen. Der Schritt wurde mit der Zugabe von 500 µL Puffer RPE (im Kit enthalten) fortgesetzt. und Zentrifugation für 15 s bei 8000 × g.

Dieser Schritt wurde zweimal wiederholt, um etwaige organische Verunreinigungen in der RNA auszuwaschen. Zuletzt wurde die RNA durch Zugabe von 50 µL RNAse-freiem Wasser eluiert und 1 Minute lang bei 8000 × g zentrifugiert.

Die RNA-Konzentration wurde mit Ananodrop (Nanodrop 2000c, Thermofisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemessen. Die extrahierte RNA wurde dann in cDNA umgewandelt, die zur Durchführung der RT-PCR verwendet wurde.

Zuerst wurden 14 µL Template-RNA mit dem 6 µL Reverse-Transkriptions-Mastermix (1 µL Quantiscript Reverse Transkriptase, 4 µL Quantiscript RT-Puffer, 1 µL RT-Primer-Mix) hinzugefügt. Nach dem Mischen wurde es 15 Minuten lang bei 42 °C inkubiert, gefolgt von einer 3-minütigen Inkubation bei 95 °C, um die Quantiscript-Reverse-Transkriptase zu inaktivieren.

Das gebildete Produkt war cDNA, und schließlich wurde eine RT-PCR durchgeführt. Die RT-PCR-Bedingungen wurden auf 95 °C für 5 Minuten festgelegt, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 °C für 10 Minuten und 60 °C für 30 Minuten.

Die Expression der BACE-1- und COX{1}}-Gene wurde quantifiziert und anhand der beiden Housekeeping-Gene (-actin und GAPDH) normalisiert. Die Primer der Nukleotidsequenzen basierten auf Maus-BACE-1 (vorne50-GCATGATCATTGGTGGTATC-30: rückwärts 50-CCATCTTGAGATCTTGAC-CA-30) ​​und COX-2 (vorwärts 50-GTGTGCGACATACTCAAGCAGGA) cDNA-Sequenzen. -30: rückwärts 50-TGAAGTGGTAACCGCTCAGGTG-30), GAPDH (vorwärts 50-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-30: rückwärts 50-GCTGGAAGGTGGACAGTGAG-30) und -actin (vorwärts 50-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-30: rückwärts 50-GCTGGAAGGTGGACAGTGAG-30).

Es wurden Fluoreszenzmessungen durchgeführt und mit der Rotor-Gene 6000-Software ausgewertet (Qiagen, Hilden, Deutschland).

Die Ergebnisse wurden als Expressionsniveaus nach der Normalisierung auf das Housekeeping-Gen (B-Actin und GAPDH) unter Verwendung des vergleichenden CT-Ansatzes (Threshold Cycle) dargestellt. Gleichung (1) wurde verwendet, um die Genexpression der Probe zu berechnen.

Der CT-Wert jeder Probe wurde basierend auf der Standardkurve ermittelt, die für jedes Gen (Zielgen und Referenzgen) erstellt wurde.

∆∆CT=∆CT-Probe − ∆CT-Kontrolle (1)

Wo

∆CT-Probe: CT-Wert des Zielgens − CT-Wert des Referenzgens

∆CT-Kontrolle: CT-Wert des Zielgens − CT-Wert des Referenzgens

2.12. Statistische Analyse

Die experimentellen Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Zur Kategorisierung statistischer Variationen wurden das Einweg-ANOVA-Verfahren (Graph Pad Version 9, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) und der Tukey-Kramerpost-Hoc-Test verwendet. Signifikant wurde als ein Wahrscheinlichkeitswert von 0.05 definiert.

3. Ergebnisse

3.1. Durch Mahanimbin verbessertes Gedächtnis bei alten Mäusen

Das räumliche Lern- und Gedächtnisvermögen von Mahanimbin im Mausmodell wurde mit dem MWM-Test untersucht. Gemessen wurden die Escape-Latenz (EL), die Escape-Distanz (ED) und die im Zielquadranten verbrachte Zeit.

Darüber hinaus wurde auch die Bewegungsaktivität basierend auf der durchschnittlichen Schwimmgeschwindigkeit von Mäusen berücksichtigt. Abbildung 2A zeigt, dass die ältere Kontrollgruppe ab Tag 1 heute 3 deutlich längere EL aufwies (22,05 ± 1,70 s, 21,35 ± 1,85 s, 19,96 ± 2,34 s; p < 0,001; im Vergleich zur jungen Kontrollgruppe (12,75 ± 1,30, 10,12 ± 0,98; 7,60 ± 1,31).

Es zeigte sich, dass ältere Mäuse im MWM-Test ein erhebliches Defizit in der Lern- und Gedächtnisfunktion aufwiesen. Allerdings führte die orale Behandlung mit unterschiedlichen Dosierungen (1 und 2 mg/kg) Mahanimbin zu einer Umkehrung der oben genannten Veränderungen der EL bei älteren Mäusen.

Die EL-Werte für die 1 mg/kg Mahanimbin-Gruppe betrugen 22,01 ± 1,60 s, 15,88 ± 1,54 s (p < 0.01) und 8 .26 ± 0.93 s (p < 0.001) für die Tage 1, 2 und 3, entsprechend verglichen mit der gealterten Kontrolle, während die EL Die Werte für die 2 mg/kg Mahanimbin-Gruppe betrugen 16,09 ± 0,33 s (p < 0,05), 17,14 ± 0,57 s (p < 0,05), 10,57 ± 0,{36}} s (p < 0,01), wenn parallel zur gealterten Kontrolle. Am dritten Tag unterschied sich der EL beider Gruppen (1 und 2 mg/kg) Mahanimbin nicht signifikant von der jungen Kontrollgruppe.

Abbildung 2. Wirkung von Mahanimbin auf (A) Fluchtlatenz, Zeit, die zum Auffinden der versteckten Plattform benötigt wird. (B) Fluchtdistanz, zurückgelegte Distanz vom Startpunkt bis zum Auffinden der versteckten Plattform; (C) Durchschnittsgeschwindigkeit, Schwimmgeschwindigkeit des Tieres, um die versteckte Plattform zu finden; (D) Sondentest, prozentualer Anteil der im Zielquadranten verbrachten Zeit gealterter Mäuse unter Verwendung des Morris-Wasserlabyrinthtests. Mit Mahanimbin kam es bei älteren Mäusen zu deutlichen Verbesserungen der Fluchtlatenz und der Fluchtdistanz.

Darüber hinaus verlängerte die Behandlung die im Zielquadranten verbrachte Zeit bei älteren Mäusen. Alle Daten wurden als Mittelwert ± SEM (n {{0}}) ausgedrückt. Einfaktorielle ANOVA (Tag 1: F(3,20)=11.74, p < 0.001, Tag 2: F(3,20)=17.38,p < 0.001 und Tag 3: F(3,2{{69 }})=14.88, p < 0.001 für Escape-Latenz Tag 1: F(3,20) {{ 26}}.22, p < 0.001,Tag 2: F(3,20)=28.62, p < 0.001 und Tag 3: F(3,20) {{40 }}.15, p < 0,001 für Fluchtdistanz; Tag 1:F(3,20)=1.939, p > 0,05, Tag 2: F(3,20)=3.467, p > 0,05 und Tag 3: F(3,20)=2.497, p > 0,05 für Durchschnittsgeschwindigkeit; F(3,20)=7.185, p < 0,01 für Sondentest, gefolgt von Tukey-Kramer-Mehrfachvergleichstest.** p < 0,01 und *** p < 0,001 im Vergleich zur jungen Kontrollgruppe, # p < 0,05, ## p < 0,01 und ### p < 0,001 im Vergleich zur älteren Kontrollgruppe.

Abbildung 2B zeigt die Wirkung von Mahanimbin auf die zurückgelegte Strecke vom Startpunkt bis zum Auffinden der versteckten Plattform. Die ältere Kontrollgruppe legte an den Tagen 1, 2 und 3 die längste Strecke zurück, bevor sie die versteckte Plattform fand (4,79 ± 0,73 m, 4,34 ± {{10}},11 m und 4,38 ± 0.59 m; p < {{20}}.001; bezogen auf die junge Kontrolle (1,36 ± 0,31 m, 1,35 ± 0,24 m bzw. 0,78 ± 0,14 m;

Ältere Mäuse, denen 1 mg/kg Mahanimbin verabreicht wurde, reduzierten die ED signifikant (2,17 ± 0,11 m (p < 0.01),2,10 ± { {13}},24 m (p < 0.001), 0,89 ± 0,18 (jeweils p < 0,001) für Tag 1 bis Tag 3, entsprechend der Alterskontrolle.

Ein signifikanter paralleler Rückgang der ED wurde bei Mäusen beobachtet, denen an den Tagen 1, 2 und 3 2 mg/kg Mahanimbin verabreicht wurden (2,43 ± 0,28 (p < 0.01). , 2,78 ± 0.32(p < 0.001), 1,47 ± 0,30 (p < 0,001);

Bezüglich der durchschnittlichen Schwimmgeschwindigkeiten während der Aufgabe konnten keine Unterschiede zwischen den Gruppen beobachtet werden (Abbildung 2C). Dies weist darauf hin, dass Mahanimbin die mit der motorischen Funktion zusammenhängende Bewegungsaktivität bei älteren Mäusen nicht veränderte.

Nach 24 Stunden der eigentlichen Aufgabe wurde eine Sondentestsitzung (Tag 30) durchgeführt, um die Gedächtnisleistung der Tiere zu bewerten. Die ältere Kontrollgruppe (Abbildung 2D) verbrachte weniger Zeit im Zielquadranten (10,10 ± 1,14 % (p < 0,001)) und zeigte im Vergleich zur älteren Kontrollgruppe eine deutlich kürzere Zeit im Zielquadranten junge Kontrolltiere (19,53 ± 2,56 %), während ältere Mäuse, die mit 1 mg/kg (20,27 ± 4,84 %, p < 0,01) und 2 mg/kg (17,85 ± 1,56 %, p < 0,05) Mahanimbin per oraler Sondenernährung behandelt wurden, eine signifikante Verbesserung zeigten längere Zeit im Zielquadranten verbracht im Vergleich zur älteren Kontrollgruppe.

3.2. Wirkung von Mahanimbin auf die MDA- und GSH-Spiegel im Gehirn alter Mäuse

Die MDA-Werte in der gealterten Kontrollgruppe (Abbildung 3A) waren erheblich höher (11,54 ± 0,88 µM;p < 0.001) im Vergleich zu der jungen Kontrollgruppe (4,37 ± 0,09). µM). Der Anstieg des MDA-Spiegels im Gehirnhomogenat gealterter Mäuse spiegelte eine höhere LPO-Aktivität wider, was auf einen Anstieg des oxidativen Stresses im Gehirngewebe hindeutete.

Umgekehrt senkte die Verabreichung von Mahanimbin (1 mg/kg, p.o.) die MDA-Spiegel im Gehirn bei älteren Mäusen signifikant (7,56 ± 0,35 µM;p < 0,001) im Vergleich zur betagten Kontrolle. Bei 2 mg/kg Mahanimbin (9,65 ± 0,51 µM) wurden keine wesentlichen Veränderungen festgestellt.

Die Menge an Glutathion (GSH) im Gehirnhomogenat deutete auf das antioxidative Potenzial von Mahanimbin hin. Die statistische Analyse von GSH (Abbildung 3B) zeigte eine signifikante Abschwächung zwischen der älteren Kontrollgruppe (0.0028 ± 0.0004 µmol/ mg; p < 0,001) in Verbindung mit der jungen Kontrolle (0,0447 ± 0,0029 µmol/mg).

Die vorliegende Studie ergab außerdem, dass die Behandlung mit Mahanimbin (1 und 2 mg/kg, p.o.) den GSH-Spiegel umkehrte, der deutlich höher war (0.0372 ± 0.{{8} }{{10}}38 µmol/mg, p < 0,001 bzw. 0,0282 ± 0,0041 µmol/mg, p < 0,001) entsprechend der gealterten Kontrolle.

3.3. Mahanimbin verbesserte die cholinerge Aktivität im Gehirn alter Mäuse

Abbildung 4A zeigt die ACh-Werte im Gehirn der Maus. ACh war in der gealterten Kontrolle (17,79 ± 1,54 µM) im Vergleich zur jungen Kontrolle (34,82 ± 0) vergleichbar reduziert (p < 0.001). 31 µM). Die Verabreichung von Mahanimbin (1 und 2 mg/kg) erhöhte sich jedoch signifikant (35,61 ± 0,85 µM, (p < 0,001); 39,42 ± 0,88 µM (p < 0,001); bzw.) der ACh-Spiegel im Gehirn im Zusammenhang mit der älteren Kontrollgruppe.

Abbildung 4B zeigt die Wirkung von Mahanimbin gegen die ACHE-Aktivität im Gehirn. Die Aktivität von AChE war in der älteren Kontrollgruppe (204,80 ± 1,55 U/L) deutlich erhöht (p < 0,001), parallel zur jungen Kontrollgruppe (51,06 ± 1,36 U/L).

Dennoch wurde der AChE-Spiegel durch die Behandlung mit 1 mg/kg (62,{5}}3 ± 4,64 U/L; p < 0,001) und 2 mg/kg (43,73 ± 4,76 U) deutlich gehemmt /L; p < 0,001) Mahanimbin in Verbindung mit der Alterskontrolle. Insgesamt führte die Verabreichung einer hohen Dosis Mahanimbin (2 mg/kg, p.o.) zu besseren Ergebnissen für die cholinerge Aktivität, da sie den ACh-Spiegel erhöhte und die AChE-Aktivität unterdrückte.

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