Melatonin verhindert die Infiltration von T-Lymphozyten in die Nieren hypertensiver Ratten, die durch eine salzreiche Ernährung induziert wird, indem es die Expression von CXCR3-Ligand-Chemokinen verhindert

Weitere Informationen:ali.ma@wecistanche.com

Ariel Bier¹, Rawan Khashab², Yehonatan Sharabi^1,2,3, Ehud Grossmann^1,2,3und Avshalom Leibowitz^1,2,3,*

¹Medizin D, The Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer 5262000, Israel; arielbier@gmail.com (AB);Yehonatan.Sharabi@sheba.health.gov.il (YS); Ehud.Grossman@sheba.health.gov.il (EG)² Hypertension Unit, the Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer 5262000, Israel;rawankhasbab@gmail.com³Sackler Faculty of Medicine, Tel-Aviv University, Tel-Aviv 6997801, Israel*

Zusammenfassung: In einer früheren Studie haben wir das gezeigtMelatoninverhindertNiereSchäden in einem salzinduzierten Bluthochdruckmodell durch Verringerung von oxidativem Stress. Wir stellten die Hypothese auf, dass dieser Effekt die immunmodulatorischen Eigenschaften von Melatonin beinhaltet. In-vivo-Studie-Dahl-salzempfindliche (DSS) Ratten wurden mit normalem Futter, einer salzreichen Diät (HSD) oder einer HSD und gefüttertMelatonin(30 mg/kg/Tag) in ihrem Wasser für acht Wochen.Nierenwurden für die sofortige Lymphozytenisolierung und Charakterisierung durch Durchflusszytometrie (CD3 plus CD4 plus und CD3 plus CD8 plus) und für Chemoattraktoren für Lymphozyten (hauptsächlich CXCLChemokine) Genexpressionsstudien. In-vitro-Studienratten, Mesangialzellen (RMC) wurden in einem Hochsalzmedium ohne und mit kultiviertMelatonin. Eine HSD war im Vergleich zur Kontrolle mit einer signifikanten Niereninfiltration von CD4-plus- und CD8-plus-T-Lymphozyten verbunden. Melatonin reduzierte signifikant die Infiltration von renalen Lymphozyten. Ein HSD erhöhte die mRNA-Expression von CXCL signifikantChemokine.Die Zugabe von Melatonin zum HSD beseitigte diesen Effekt. Die Behandlung von RMC-Zellen mit Salz erhöhte die Expression von CXCL10 und CXCL11, aber nicht von CXCL9. HinzufügenMelatoninzu den Kulturmedien verhinderte diesen Anstieg. Die Behandlung von mit HSD gefütterten Ratten mit Melatonin verringerte die mRNA-Expression von Chemoattractant-mRNA der renalen Lymphozyten und ist mit einer signifikanten Verringerung der Infiltration von renalen T-Lymphozyten verbunden. Salz kann eine direkte Wirkung auf Chemokin-produzierende Nierenzellen haben, die durch Melatonin-Behandlung abgestumpft werden.

Schlüsselwörter:Melatonin; Salz; T-Lymphozyten; Hypertonie;Niere; CXCL9; CXCL10; CXCL11

1. Einleitung

Bluthochdruck (HTN) ist einer der führenden modifizierbaren kardiovaskulären Risikofaktoren. Aufgrund der Alterung der Bevölkerung nimmt die Prävalenz von HTN stetig zu und erreicht im fortgeschrittenen Alter bis zu 30 Prozent [1]. Trotz verschiedener medizinischer Therapieoptionen ist HTN weltweit schlecht unter Kontrolle. Die Folgen einer unkontrollierten HTN sind verheerend und haben enorme negative Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit [2].

An der Pathogenese von HTN sind verschiedene Verhaltens-, Umwelt- und genetische Faktoren beteiligt. Der hohe Salzgehalt in der westlichen Ernährung wurde als Hauptfaktor für HTN angesehen und ist mit erhöhter Morbidität und Mortalität verbunden. Leitlinien und öffentliche Initiativen empfehlen, den Salzkonsum für die allgemeine Bevölkerung zu reduzieren. Allerdings kann nicht jeder Einzelne von dieser Einschränkung profitieren, da die Pathophysiologie, die die Salzempfindlichkeit mit HTN verbindet, nicht vollständig verstanden ist und ein verbessertes mechanistisches Verständnis erfordert [3]. Daher sind neue Strategien entscheidend für ein besseres Verständnis und eine bessere Kontrolle von HTN, was neue Forschungsparadigmen zu einem unmittelbaren Bedarf macht.

Es wurde festgestellt, dass Entzündungen und oxidativer Stress an der Pathogenese von essentiellem HTN beteiligt sind. Bei der Erforschung der Auslöser, die diese Prozesse auslösen und fortsetzen, legen viele experimentelle HTN-Modelle die Beteiligung der adaptiven Immunantwort nahe [4].

Klicke umCistanche Vorteile und Nebenwirkungen für die Nierenfunktion

Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen adaptiver Immunität und HTN gibt es bereits seit den 1960er Jahren. Fortschritte in dieser Richtung konnten jedoch erst in jüngster Zeit durch ein besseres Verständnis des Immunsystems erzielt werden. Eine wegweisende Studie von Guzik et al. zeigten, dass Angiotensin (Ang) II oder Desoxycorticosteron (DOC)-Salz HTN in Rag1–/–-Mäusen, denen es an T- und B-Lymphozyten mangelt, abgestumpft war und ein adoptiver Transfer von T-, aber nicht von B-Zellen die BP-Reaktion wiederherstellen konnte [5]. Seit diesem Artikel wurde festgestellt, dass verschiedene Komponenten der adoptiven Immunität für die Pathogenese von HTN in den meisten gängigen Tiermodellen relevant sind. Die Rolle von T-Zellen im salzinduzierten HTN-Modell wurde ebenfalls ausführlich untersucht. In-vitro-Studien zeigen, dass Salz die naive T-Zell-Differenzierung in TH17-Zellen vorantreiben kann [6]. Zahlreiche In-vivo-Arbeiten in durch salzreiche Ernährung (HSD) induzierten HTN-Modellen, wie z. B. in Dhal-Salz-empfindlichen (DSS) Ratten, zeigen eine ausgedehnte renale T-Zell-Infiltration [7–9].

Unter den vielen physiologischen Prozessen,MelatoninDie Beteiligung an der Blutdruckregulierung ist etwas intuitiv. Das zirkadiane Muster des Blutdrucks regte umfangreiche Forschungen zu Melatonin und HTN an. Viele Arbeiten in der Vergangenheit, bei Menschen und in experimentellen Modellen, brachten niedrige Melatoninspiegel mit HTN in Verbindung [10]. Es gibt einige klinische Daten, die darauf hindeuten, dass eine Melatonin-Supplementierung HTN behandeln kann, hauptsächlich bei Patienten mit nächtlicher HTN [11]. Die Widersprüchlichkeit dieser Daten wirft jedoch die Frage auf, ob nicht-zirkadiane Melatonineigenschaften auch an der Blutdruckregulierung beteiligt sind.

Die entzündungshemmenden und antioxidativen Eigenschaften von Melatonin legen nahe, dass Melatonin mit dem Immunsystem interagiert. Neuere Daten weisen auf die Rolle der Melatonin-Signalgebung bei der Entwicklung, Aktivierung, Differenzierung und dem Gedächtnis von T-Zellen hin. Dafür gibt es BeweiseMelatoninMembran- und Kernrezeptoren sind auf T-Zellen vorhanden [12,13].Melatoninbeeinflusst die Produktion vieler Zytokine, die an der Immunantwort beteiligt sind, wie z. B. Interferon (IFN) – das ein zentraler Regulator der Th1-Antwort ist [14].

Oxidativer Stress und T-Zell-Antwort wirken laut einigen Forschern zusammen, um die Entwicklung von HTN und hypertensiven Organschäden zu fördern [15]. In unserer vorherigen Arbeit haben wir das demonstriertMelatoninverringert lokalen (renalen) oxidativen Stress und verhindert salzinduzierte Nierenfibrose und Proteinurie in einem salzempfindlichen HTN-Rattenmodell (DSS-Modell) [16]. Da oxidativer Stress eine entscheidende Rolle bei der HTN-assoziierten adaptiven Immunantwort spielt, stellten wir die Hypothese auf, dass die immunmodulatorischen Eigenschaften von Melatonin für seine schützende Rolle bei HSD-induzierter HTN verantwortlich sind.

Das Ziel dieser Studie ist es zu evaluieren, obMelatonindie salzinduzierte T-Zell-Antwort verringert und die für diesen Effekt verantwortlichen Mechanismen aufzuklären.

2. Materialien und Methoden

2.1. Tiere und Studienprotokoll

Das Studienprotokoll wurde von der institutionellen Tierethikkommission des Sheba Medical Center in Israel genehmigt. Ihr Gesundheitszustand wurde durch Messung des Körpergewichts und eine tägliche allgemeine Beobachtung der Bewegung und des Gesundheitszustands für jedes Tier überwacht in einer Tierhaltung in normalen Käfigen (zwei Ratten pro Käfig) bei 22 ◦C mit einem Zyklus von 14 h Licht/10 h Dunkelheit gehalten. Die Ratten wurden auf einer normalen Salzdiät gehalten und erhielten Leitungswasser zum Trinken nach Belieben für einen Akklimatisierungszeitraum von fünf Tagen. Die Ratten wurden dann über einen Zeitraum von 8 Wochen entsprechend der Ernährung in drei Gruppen (n=8) eingeteilt. Tiere, die Anzeichen von Krankheit und Leiden zeigten, sollten laut Ethikkommission geopfert werden.

Die Kontrollgruppe wurde mit einer Standard-Rattenfutterdiät (2018 SC; Teklad Envigo, Madison, WI, USA) und Leitungswasser gefüttert; die Gruppe mit salzreicher Ernährung (HSD) wurde mit einer abgestimmten, angereicherten Salzdiät (4 Prozent) (TD.120485; Teklad Envigo, Madison, WI, USA) und Leitungswasser gefüttert, und dieMelatoninGruppe wurde die gleiche angereicherte Salzdiät (4 Prozent) mit Melatonin (M5250; Sigma, Rehovot, Israel) (30 mg/kg/Tag) in ihrem Trinkwasser gefüttert. Körpergewicht und Wasserverbrauch wurden periodisch gemessen. Die korrekte Menge an Melatonin wurde im passenden Wasserbedarf für jeden Käfig aufgelöst, um jedem Tier die richtige Dosis zuzuführen. Tag Null ist definiert als der Tag des Beginns des HSD- und Melatoninkonsums. Am Ende der Studie wurden die Ratten durch tiefe Betäubung mit 3 Prozent Isofluran (Tiefe der Betäubung bestätigt durch Zusammendrücken des hinteren Fußes) und anschließend getötetNierengeerntet wurden. Beide Nieren wurden entfernt und halbiert. Die Nieren wurden zur durchflusszytometrischen Analyse entnommen, mit Ausnahme mehrerer Portionen, die schnell entfernt und in flüssigem N2 schockgefroren und bei –80 °C gelagert wurden. Gefrorene Gewebe wurden für die RNA-Extraktion verwendet.

Symptome der Cistanche-Nierenerkrankung

2.2. Quantitative reverse Transkriptions-PCR in Echtzeit

mRNA-Expressionsniveaus von Genen wurden in den ermitteltNiereGewebe durch quantitative Reverse-Transkriptase-PCR in Echtzeit (qRT-PCR). Gesamt-RNA wurde aus dem Nierengewebe unter Verwendung eines NucleoSpin RNA Kits (MACHERY-NAGEL, Düren, Deutschland) extrahiert. Die reverse Transkription wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems High-Capacity cDNAReverse Transcription Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt. qRT-PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung des Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK) und des Applied Biosystems 7500 Echtzeit-PCR-Systems durchgeführt. Die Zyklusbedingungen waren: ein erster Einzelschritt bei 95 ◦C für 0,20 min und dann 40 Zyklen Schmelzphase für 3 s bei 95 ◦C und eine verlängerte Phase von 30 s bei 60 ◦C. Am Ende der 40 Zyklen wurde eine Schmelzkurvenstufe durchgeführt. Die mRNA der ribosomalen Protein-Seitenstiel-Untereinheit P0 (Rplp0) wurde als interne Kontrolle verwendet. Die Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1. Liste der in dieser Studie verwendeten Ratten-Primer.

2.3. Isolierung von T-Zellen aus Nieren

Nach dem Entfernen der Nierenkapsel werden die beidenNierenwurden zerkleinert und mit dem Kolben einer 2-ml-Spritze durch ein 100-µm-Zellsieb in RPMI 1640, enthaltend 2 mML-Glutamin, 10 % FBS, 10 ug/ml DNase 1 (Stem Cells Technologies, Cambridge, MA , USA) und 0,1 Prozent Kollagenase Typ IV (CLS 4, Worthington Decatur, AL, USA). Die Lösung wurde für 25 min bei 37 ◦C inkubiert. Waschlösung (DPBS/2 Prozent FBS/2 mM EDTA) wurde dann zu dem Nierenhomogenat hinzugefügt, um 45 ml zu erreichen, und wurde durch einen 70-&mgr;m-Celltrainer filtriert. Die Lösung wurde bei 400 x g/7 min zentrifugiert. und das Pellet wurde in 5 ml Waschlösung suspendiert und durch ein 40-&mgr;m-Zellsieb filtriert und bei 400 × g/7 min erneut zentrifugiert. Das Pellet wurde in 3 ml FBS (10 mM EDTA) resuspendiert und über Histopaque -1083 (Sigma, Rehovot, Israel) geschichtet und bei 20 °C bei 400 × g/30 min mit gelöster Bremse zentrifugiert. Die über dem Histopaque ruhende mononukleäre Zellschicht wurde entfernt, zweimal mit Waschlösung gewaschen und in 5 ml Waschlösung für die durchflusszytometrische Analyse suspendiert.

2.4. Durchflusszytometrie

Von jeder Gruppe,Nieren5–7 Ratten wurden analysiert. Für jede Probe wurden 1 × 106 Zellen entnommen. Isolierte mononukleäre Zellen wurden mit extrazellulären Markern inkubiert: Anti-CD3 (Thermo Fisher Scientific Kat.-Nr. 12-0030-82, RRID:AB_465493) und seine Isotypkontrolle (Thermo Fisher Scientific Kat.-Nr. 12-4742-41, RRID :AB_10753770), Anti-CD4 (Thermo FisherScientific Cat# 17-0040-80, RRID:AB_1210581) und seine Isotypkontrolle (Thermo Fisher Scientific Cat# 17-4724-81, RRID: AB_470188), Anti-CD8 (Thermo Fisher Scientific Kat.-Nr. 25-0084-82, RRID:AB_10548361) und seine Isotypkontrolle (Thermo Fisher Scientific Kat.-Nr. 25-4714-80,RRID: AB_657914). Alle Zellen wurden durch Durchflusszytometrie (BD FACSCalibur Flow Cytometry System, RRID: SCR_000401) unter Verwendung der FlowJo-Software (FlowJo, RRID: SCR-008520) analysiert.

Cistanche-Nierenfunktion

2.5. Zellkultur

Die mesangiale Rattenzelllinie RMC (ATCC Cat# CRL{{0}}, RRID: CVCL_0506) wurde von ATCC® erhalten. Die Zelle wurde in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (01-055-1A, biologische Industrien, Beit HaEmek, Israel) mit 4 mM L-Glutamin kultiviert, das auf 1,5 g/l Natriumbicarbonat und 4,5 g/l Glucose eingestellt und ergänzt wurde 0,4 mg/ml LG418 und 15 Prozent fötales Rinderserum. Melatonin wurde von Sigma (M5250 Rehovot, Israel) erhalten. A 250 mMMelatoninVorrat wurde in Ethanol hergestellt. Die Zellen wurden unter normalen oder Hochsalzbedingungen (Hinzufügen von 8 0 mM NaCl zum Medium) ohne oder mit Melatonin (0,5 mM) kultiviert. Die Melatoninbehandlung wurde zeitlich auf 45 min vor der Zugabe von NaCl zum Medium festgelegt. Alle Experimente fanden in Platten mit 6 Vertiefungen mit 3 × 105 Zellen pro Vertiefung statt und wurden in 6 unabhängigen Versuchen durchgeführt.

2.6. Statistische Analyse

Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Statistische Analysen wurden mit IBMSPSS Statistics, RRID: SCR_019096 durchgeführt. Die Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) und die Post-hoc-Tukey-Methode untersuchten die Unterschiede zwischen den Gruppen. Echtzeit-qPCR-Daten wurden mit DataAssist, RRID: SCR_014969 analysiert.

3. Ergebnisse

3.1. Melatonin schützt Ratten, die ein HSD konsumieren

Das Alter der Ratten während dieser Studie betrug 4–13 Wochen. In diesem Alter zeigt sich das Wohlbefinden der Ratten an der Gewichtszunahme, die die Kontrollgruppe zeigte [17]. Die HSD-Gruppe erreichte jedoch am Tag 30 und der Zugabe von ein PlateauMelatoninzur HSD verbesserte dieses Phänomen (Abbildung 1A). Die HSD-Gruppe zeigte während des Versuchszeitraums eine hohe Sterblichkeitsrate, bei der 50 Prozent der Ratten starben oder einen klinischen Zustand aufwiesen, der gemäß den Regeln der Tierethikkommission eingeschläfert werden musste. Melatonin-Ergänzungen verhinderten die Sterblichkeit der Ratten signifikant, wobei nur eine von acht Ratten am Tag 58 am Ende der Versuchsperiode starb (Fig. 1B).

Abbildung 1.Melatoninverbesserter Blutdruck und Überleben bei HSD. DSS-Ratten wurden 9 Wochen lang mit HSD mit und ohne Melatonin behandelt. Eine salzreiche Ernährung verringerte das Körpergewicht ab Tag 36 und Melatonin milderte diesen Effekt (A). HSD erhöhte die Sterblichkeitsrate ab Tag 4 0. Die Behandlung von HSD-Fedratten mit Melatonin verbessert ihr Überleben. (B). (n=8) *-p Weniger als oder gleich 0,05 Salz und Salz plus Melatonin versus Kontrolle. #-p Weniger als oder gleich 0,05 Salz gegenüber Kontrolle und Salz plus Melatonin. HSD – salzreiche Ernährung.

3.2. Melatonin verhindert die durch HSD induzierte Nieren-T-Zell-Infiltration

Wir isolierten Zellen aus derNiereund ordnete sie dem T-Zellmarker CD3 zu. CD3-Plus-Zellen wurden zu CD4 und CD8 gegatet. Sowohl CD3 plus CD4 plus als auch CD3 plus CD8 plus waren signifikant höher in der HSD (5,18 ± 1,62 bzw. 4,6 ± 0,75 Prozent) im Vergleich zur Kontrolle (0,16 ± {{18} }.{{20}}2und 0,95 ± 0,15 Prozent) undMelatoninDie Ergänzung der HSD reduzierte sowohl CD3 plus CD4 plus als auch CD3 plus CD8 plus Zellen zurück auf Kontrollniveaus (0,68 ± 0,21 bzw. 1,37 ± 0,45) (Abbildung 2A–D).

Abbildung 2. Melatonin verhindert das Eindringen von T-Zellen in dieNiere. T-Zellen wurden aus den Nieren von Ratten isoliert und auf CD3 untersucht. Die CD3--positiven Zellen wurden auf CD4 und CD8 abgetastet. Melatonin (C) reduzierte sowohl CD3 plus CD4 plus als auch CD3 plus CD8 plus im Vergleich zu HSD ohne Melatonin (B) ohne Unterschied zur Kontrollgruppe (A). Die Analyse für alle Ratten ist in (D) (n=7–8) gezeigt. HSD – salzreiche Ernährung. *-p Kleiner als oder gleich 0.05 versus Kontrolle. #-p Weniger als oder gleich 0,05 gegenüber Salz plus Melatonin.

3.3. Melatonin reduziert bestimmte Nieren-Chemokine, die bei HSD hochreguliert wurden

Die Rekrutierung von T-Zellen zu entzündlichen Geweben wird durch lokale Chemokinexpression reguliert. Wir haben daher die Expression von zwei Chemokinfamilien in der Ratte gemessenNieren: die Familie der Chemokine (CXC-Motiv)-Liganden (CXCL) und die Familie der Chemokine (C-C-Motiv)-Liganden (CCL).

Bei der CXCL-Familie waren CXCL 9, 10 und 11, die T-Zellen mithilfe des CXCR3-Rezeptors auf den T-Zellen zu ihrem Zielgewebe locken, bei HSD-Ratten signifikant hochreguliert. Die Ergänzung vonMelatoninzur HSD reduzierten ihre Expression zurück auf Kontrollniveaus. Dasselbe Muster wurde für CXCL 1 und 16 festgestellt. Für CXCL12 wurde jedoch keine Hochregulierung in der HSD festgestellt (Abbildung 3A).

Für die CCL-Familie zeigten CCL 2, 4, 12, 17, 19 und CX3CL1 keine Hochregulierung bei HSD. CCL3 wurde bei HSD hochreguliert, aber es wurde keine signifikante Veränderung bei der Zugabe von Melatonin zur Nahrung festgestellt. Für CCL7 eine signifikante Hochregulierung in der HSD und eine signifikante Herunterregulierung mit dem Zusatz vonMelatoninzur HSD wurde erkannt (Abbildung 3B).

Abbildung 3. Hochregulierung vonNierenChemokinebei HSD mit und ohne Melatonin. Die Expression der Chemokin (CXC-Motiv)-Liganden (CXCL)-Familie (A), der Chemokin (CC-Motiv)-Liganden-Familie und CX3CL1 (B) wurde bei den Ratten bestimmt. (n=7–8) *-p Kleiner als oder gleich 0.05 versus Kontrolle. #-p Weniger als oder gleich 0,05 gegenüber Salz plus Melatonierung. HSD – salzreiche Ernährung.

3.4. Die direkte Wirkung von Melatonin auf die RMC-Mesangial-Zelllinie

Wir konzentrierten uns dann auf CXCL9, 10 und 11, die T-Zellen anziehen, indem sie an den Rezeptor CXCR3 binden. Wir haben deren Ausdruck bestimmtChemokinein RMC-Zellen, die eine Ratten-Mesangium-Zellinie sind.

Wir behandelten die Zellen mit 80 mM NaCl ohne und mit 0,5 mMMelatonin. Diese NaCl-Konzentration erhöhte signifikant die Expression von CXCR10 um das 2,4 ± 0,26--fache im Vergleich zur Kontrolle, und die Zugabe von 0,5 mM Melatonin nahm signifikant ab dieser Ausdruck auf 1,4 ± 0,{{10}}-fach verglichen mit der Kontrolle (Abbildung 4A). Für CXCL11 erhöhten 80 mM NaCl die Expression signifikant um das 3 ± 0,48--fache im Vergleich zur Kontrolle, und die Zugabe von 0,5 mM Melatonin verringerte diese Expression signifikant auf 1,8 ± 0,{{22 }}fach im Vergleich zur Kontrolle (Abbildung 4B). CXCL9 wurde in RMC-Zellen nicht nachgewiesen.

Abbildung 4. Salz regulierte die CXCL10- und CXCL11-Expression in einer mesangialen Zelllinie hoch, wo die Melatonin-Behandlung ihre Expression herunterregulierte. RMC (Ratten-Mesangialzelllinie) wurden mit 80 mM Salz mit und ohne 0,5 mM Melatonin behandelt. CXCL10 (A) und CXCL11 (B) wurden durch Salzbehandlung und die Zugabe von hochreguliertMelatoninReduzieren Sie diese Hochregulierung. Die Diagramme zeigen 6 unabhängige Versuche. *-p Kleiner als oder gleich 0.001 gegenüber Kontrolle #-p Kleiner als oder gleich 0.005 gegenüber Salz 80 mM und Melatonin 0,5 mM. $-p Weniger als oder gleich 0,05 gegenüber Salz 80 mM und Melatonin 0,5 mM.

4. Diskussion

Die wohltuende Wirkung vonMelatoninauf HTN wurde in früheren Studien nachgewiesen und wurde als mögliche Vorgehensweise bei behandlungsresistentem HTN vorgeschlagen [18]. In unserer ersten Studie konzentrierten wir uns auf oxidativen Stress und zeigten, dass Melatonin den durch HSD induzierten oxidativen Stress reduziert. In der vorliegenden Studie konzentrierten wir uns auf den Effekt des adaptiven Immunsystems und zeigten, dass Melatonin das Überleben von mit HSD gefütterten Ratten verbessert. Dieser Effekt ist mit einer Verringerung der T-Zellen, die die Niere infiltrieren, und der Herunterregulierung von T-Zellen verbundenNiereChemokin-Expression.

Historische Daten zeigen, dass DSS-Ratten, die ein HSD konsumieren, eine schwere HTN entwickeln und höhere Sterblichkeitsraten aufweisen [19]. Dahl selbst berichtete während der Erstellung des Modells, dass DSS-Ratten, wenn sie beim Absetzen (im Alter von 21–23 Tagen) auf eine HSD (8 Prozent NaCl) gesetzt wurden, schnell HTN entwickelten und alle in der 16. Woche der Salzfütterung starben [20]. Später, nach einigen Modifikationen des Stammes, haben Rapp et al. berichteten, dass alle Ratten innerhalb von acht Wochen nach der HSD (8 Prozent NaCl) tot waren [21]. Die Ratten in unserer Studie hatten eine hohe Sterblichkeitsrate, erreichten jedoch nicht 100 Prozent, wahrscheinlich aufgrund des geringeren Salzanteils (4 Prozent) in ihrer Ernährung. Trotzdem ist das offensichtlichMelatonineine Supplementierung verhinderte signifikant die Rattensterblichkeit.

Gewichtszunahme ist ein Indikator für das Wohlbefinden der Ratten im Alter von 4–13 Wochen. DSS-Ratten stammen von Sprague Dawley, einem gut charakterisierten Stamm. In dem Alter der Ratten, die wir in unseren Experimenten verwendeten, sollten die Ratten konstant an Gewicht zunehmen [22]. In vielen Tierversuchen wird die Gewichtsreduktion als einer der "Endpunkte" der Experimente angesehen [23]. Aus mehreren Studien geht hervor, dass ein HSD bei DSS-Ratten im Vergleich zu Kontrollen zu geringeren Gewichtszunahmeraten führt [24,25]. In Übereinstimmung mit diesen Studien beobachteten wir auch Gewichtsunterschiede zwischen den Gruppen. Hier nahmen die Ratten nach vier Wochen HSD nicht zu. Melatonin stoppte auch diesen Effekt des HSD, da die mit Melatonin behandelten Ratten weiter an Gewicht zunahmen, wenn auch weniger als die Kontrollen.

Die Fähigkeit vonMelatoninzur Senkung des Blutdrucks in Tiermodellen wurde Ende der siebziger Jahre des 20. Jahrhunderts entdeckt [26–28]. Seitdem wurde in mehreren anderen Modellen berichtet, wie z. B. dass eine fructosereiche Ernährung bei spontan hypertensiven Ratten ein metabolisches Syndrom induziert [29,30]. Unsere Studien auf diesem Gebiet sind die ersten, die zeigen, dass Melatonin bei salzinduzierter HTN eine Rolle spielt, indem es Organschäden verhindert und die Sterblichkeit reduziert.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass eine HSD eine T-Lymphozyten-Infiltration induziertNiere, ein Prozess, der hauptsächlich von Mattsons Gruppe bei DSS-Ratten beschrieben wurde [31–33]. Durch eine HSD und einen Splenozytentransfer induzierte HTN verschlimmert die salzempfindliche HTN [34].

Melatonin kann T-Zellen in verschiedener Hinsicht beeinflussen (zur Übersicht siehe [35]). Das hat diese Studie erstmals gezeigtMelatoninreduziert die Anziehungskraft sowohl von CD4 plus- als auch von CD8 plus-T-Zellen auf dieNiereim HSD. Diese Wirkung von Melatonin könnte der Mechanismus sein, der seine vorteilhafte Wirkung in diesem Modell unterstreicht.

Die Fähigkeit von Melatonin, die T-Zell-Infiltration zu reduzieren, wurde im experimentellen Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE)-Mausmodell beschrieben. Bei EAE wurde gezeigt, dass Melatonin die Infiltration von CD4 plus T-Zellen und Th17-Zellen in das ZNS reduziert [36,37].

Die Anziehung von T-Zellen zu einem bestimmten Gewebe wird hauptsächlich durch lokale hohe Konzentrationen von reguliertChemokinedas sind chemotaktische Zytokine, die die Migrationsmuster und die Positionierung von Immunzellen steuern. Zwei große Chemokinfamilien, die eine T-Zell-Infiltration induzieren, sind die Chemokinfamilien der CXC-Motivliganden (CXCL) und der CC-Motivliganden (CCL) [38].

Cistanche zur Verbesserung der Nierenfunktionsstörung

In unserer Studie fanden wir kein konstantes Muster in der Reaktion der CCL-Familie auf eine HSD und aufMelatonin. Von den neunChemokineIn dieser Familie wurde beobachtet, dass nur CCL7 und CLL21 ihre Expression aufgrund von HSD erhöhen, und eine Melatonin-Supplementierung reduzierte sie. Ein HSD erhöhte die Expression von CCL3, aber bei den mit Melatonin behandelten Ratten wurde keine Reduktion festgestellt. Eine kürzlich durchgeführte Studie mit demselben Modell hat gezeigt, dass eine HSD CCL2 im Körper hochreguliertNiereunter Verwendung der RNA-Seq-Methode [39]. Diese Studie testete jedoch die Werte an den Tagen 3 und 21 nach Beginn der Diät. In unserer Studie haben wir die Werte nach acht Wochen getestet. Es ist möglich, dass sich die Chemokin-Expression während der HSD-Periode ändert.

Umgekehrt stiegen die Spiegel der meisten CXCL-Familie, einschließlich CXCL 1, 9, 10, 11 und 16, bei den mit HSD behandelten Ratten und anMelatoninErgänzung beseitigte diese Erhöhung. Nur CXCL12 zeigte keine Zunahme als Reaktion auf HSD.

CXCL9, CXCL10 und CXCL11, die als "Interferon-induzierbare CXC-Chemokin-Rezeptor-3-Liganden" bezeichnet werden, werden durch IFN- induziert und sind die Liganden des CXC-Chemokin-Rezeptors 3 (CXCR3). In-vivo-Studien haben ihre Bedeutung für die Aktivierung und Rekrutierung von T-Lymphozyten zum Zielorgan gezeigt [40–42]. Younet al. zeigten bei menschlichen Bluthochdruckpatienten sowohl eine renale Infiltration von T-Zellen als auch erhöhte zirkulierende Spiegel aller drei CXCR3Chemokine, was darauf hindeutet, dass CXCR3 und seine Liganden für T-Zellen relevant sind, die an menschlichem HTN beteiligt sind [43]. Eine andere Studie hat gezeigt, dass CXCL10 bei Bluthochdruckpatienten erhöht ist und seine Werte mit ihren Blutdruckwerten korrelieren [44].

Aufgrund dieser Studien konzentrierten wir uns auf CXCL9, CXCL10 und CXCL11. Wir kultivierten die mesangiale Rattenzelllinie und behandelten sie mit 80 mM NaCl und 0,5 mM Melatonin. Wir fanden heraus, dass CXCL 10 und 11 in den Zellen hochreguliert sind und Melatonin diese Erhöhung beseitigt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Wirkung von Salz bei der Erhöhung von CXCL 10 und 11 und die gegenteilige Wirkung vonMelatonin, wurden beide direkt in Mesangialzellen nachgewiesen. Im Gegensatz dazu wurde CXCL9 in diesen Zellen nicht nachgewiesen.

Unsere Studie hat Einschränkungen. In unseren FACS-Ergebnissen waren viele der CD3 plus sowohl für CD4 als auch für CD8 doppeltnegativ. Die gleichen Ergebnisse wurden in der Studie von Mattson aus dem Jahr 2010 beobachtet [31]. In neueren Studien von Mattsons Gruppe waren die CD3 plus CD4-CD8--Zellen jedoch sehr wenige [32,33,45,46]. Die signifikante Abnahme der doppelt negativen CD3-Zellen könnte darauf zurückzuführen sein, dass der CD45-Marker hinzugefügt und nur die CD45-positiven Zellen analysiert wurden, was in den späteren Studien von Mattson durchgeführt wurde. Es ist möglich, dass die große Population von CD3 plus CD4-CD8- ein Artefakt ist. Für die Zellpopulation CD3 plus CD4 plus und CD3 plus CD8 plus ist jedoch kein Artefakt bekannt.

5. Schlussfolgerungen

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine salzreiche Ernährung mit einer T-Zell-Infiltration in den assoziiert istNierenvon DSS-Ratten. Salz erhöhte auch die Expression spezifischer T-Zell-Chemoattraktoren in der Niere. Behandlung mitMelatonin(30 mg/kg/Tag) hob diese Wirkungen auf (Melatoninreduziert die HSD-induzierte Infiltration von T-Zellen in die Nieren zusammen mit einer Reduzierung der CXCL3-Liganden-Chemokin-Expression).

Unsere In-vitro-Studie zeigt, dass Salz und Melatonin die Expression von Chemoattraktoren durch direkte Beeinflussung regulieren könnenNiereZellen.

Autorenbeiträge: Conceptualization, AL; formale Analyse, AB und RK; Untersuchung, RK; Methodik, AB und AL; Schreiben – Originalentwurf, AB und AL; Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, YSund EG Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Finanzierung: Diese Forschung erhielt keine externe Finanzierung.

Erklärung des Institutional Review Board: Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Animalethics Committee im Sheba Medical Center, Protokoll Nr. 1219/19/ANIM und Protokoll Nr. 16418 des Gesundheitsministeriums genehmigt.

Einwilligungserklärung: Nicht anwendbar.

Erklärung zur Datenverfügbarkeit: Die in dieser Studie präsentierten Daten sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Danksagung: Die Autoren danken Zehava Shabtai für ihre hervorragende technische Unterstützung und Michael Kanovsky für seine redaktionellen Dienste.

Interessenkonflikte: Die Autoren geben keine Interessenkonflikte an.

Verweise

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